全 文 ：第 39卷第 2期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.2
2 0 1 0年 4月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Apr., 2 0 1 0
拟南芥花粉表面蛋白基因 T-DNA
插入突变体的鉴定
易素华 , 张　丞 , 史志浩 , 杨仲南 , 张　森＊
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:花粉表面蛋白质(Polencoatproteins, PCPs)是一类在被子植物进行繁殖生长过程中
起着重要作用的蛋白质.它们参与了花粉与柱头的识别 、黏附 、水合等过程 ,直接影响花粉的萌
发能力.根据已经建立的拟南芥花粉表面蛋白数据库中的信息 ,从美国拟南芥生物资源中心购
买了有 T-DNA插入的 SALK株系种子 ,并对这些株系进行了 T-DNA插入位点的鉴定 ,实验
结果为进一步研究花粉表面蛋白质奠定了基础.
关键词:花粉表面蛋白;拟南芥;SALK株系;T-DNA
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)02-0213-06
　　　　　　　　　　
收稿日期:2009-09-29
基金项目:国家自然科学基金项目(30671127);上海市教委科研创新项目(09YZ168);上海师范大学科研项目
(SK200827).
作者简介:易素华(1985-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;张　森(1963-),男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院副教授.
＊通讯作者.
0　引　言
显花植物授粉是一个复杂的过程 ,雄配子体与柱头的识别以及与雌配子体的受精过程都受到严
格的调控 [ 1] .作为雄配子体胞外的主要结构-花粉壁的组成成分在植物雄配子体与柱头的接触 、识别
的过程中相互作用 ,是决定授粉成功与否的一个重要因素.成熟花粉壁由外壁和内壁构成 ,外壁主要
由孢粉素构成 ,能够抵抗不利的外界环境 ,对保护花粉起重要作用.内壁主要由果胶质和纤维素组
成 [ 2] .刚从花药中释放的花粉表面覆盖含油层的物质叫花粉外被(polencoat),是花粉壁的重要组成
部分.目前普遍认为花粉外被来自于绒毡层的分泌物和绒毡层自身降解的残余物 ,相对于富含孢粉
素的花粉外壁 ,花粉外被则含有多种脂类 、多糖 、类胡萝卜素 、类黄酮以及花粉表面蛋白 [ 2-4] .花粉外
被具有保护作用 ,防止花粉迅速失水而失活 ,吸引并辅助昆虫传粉 ,参与花粉的水合作用 ,介导花粉
与柱头的识别过程 [ 5] .
花粉外被中的蛋白质对于花粉柱头的细胞识别过程至关重要 ,因此了解花粉表面蛋白质的组成是
研究授粉过程中细胞识别分子机理的基础.在拟南芥中 ,花粉外被中的蛋白质主要包括酯酶 ,富含甘氨
酸的含油体蛋白 ,钙离子结合蛋白以及受体激酶的胞外肽段等 [ 4, 6] ,通常这些蛋白都和信号传导有关 ,
因此这些蛋白可能在雌雄配子体的识别中起重要作用.目前 ,遗传分析表明脂质的合成和沉积与花粉粘
附柱头的过程相关 ,也找到了一些相关突变体 [ 7, 8] ,但对花粉表面蛋白功能研究并不深入.
为给研究花粉表面蛋白质功能奠定基础 ,本研究根据已经建立的拟南芥花粉表面蛋白质数据库中
的信息(本实验室未发表结果),从美国拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBiologicalResourceCenter:
　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
ABRC)购买了 142个 T-DNA插入株系 ,对其基因型和表型进行了鉴定 ,获得并证实了 94个 T-DNA
纯合插入的株系.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
拟南芥 T-DNA插入株系(Columbia生态型)种子购自美国拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBio-
logicalResourceCenter:ABRC),野生型拟南芥(Columbia生态型)种子由本实验室保存.
1.1.2　生物学试剂
DNA聚合酶 , dNTPs,琼脂糖等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;引物由 In-
vitrogen公司合成.
1.2　方法
1.2.1　材料种植
拟南芥种子在 0.1%的琼脂糖中 4 ℃春化 2 ～ 4 d后培养在黑土:蛭石:珍珠岩(1∶6∶0.25)的混合土
中.培养时先用营养液 PNS把土浇湿 ,并在其上层罩一层塑料膜以保持湿度 ,当拟南芥种子萌发出子叶
后去掉塑料膜.16 h光照 , 8 h黑暗 ,湿度 60% ～ 70%,温度 22 ～ 25 ℃,光照强度为 50 μEm-2·s-1.
1.2.2　植株总 DNA的提取
研磨法提取拟南芥基因组 DNA,具体方法参照 Zhang等方法 [ 9] .
1.2.3　DNA的 PCR扩增
PCR反应体系:Taq酶 0.3 μL, 10 ×PCRbufer3 μL, dNTPs3 μL,模板 DNA1 μL,正向引物 F1 μL,
反向引物 R1 μL,无菌水 21 μL,总体积 30 μL,混匀后放入 PCR仪中进行反应.
PCR反应条件:(1)预变性 , 94 ℃, 5 min;(2)变性 , 94 ℃, 30 s;(3)退火 , 62 ℃, 30 s, 72 ℃延伸
70 s(从变性到延伸 35个循环);(4)最后的延伸 , 72 ℃, 10 min.反应结束 4 ℃保存.
1.2.4　PCR产物的检测
检测 PCR产物一般利用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳 ,所用的电泳缓冲溶液为 1 ×TAE,所用的电
压为 5 V/cm,用 EB进行染色 , PCR产物点样量为 10 μL.电泳结果用 TannonGIS凝胶图像处理系统拍
照记录.
1.2.5　PCR引物的设计
每个 T-DNA插入株系基因型的鉴定需要三条引物 ,分别是:LP,位于基因组上距离 T-DNA插入
位点左臂端 600 bp处;RP,位于距离 T-DNA插入位点右臂端 300 bp处;T-DNA左臂端上引物 LB1.3
(5′-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3′).PCR引物设计参照 SIGNAL(htp:∥signal.salk.edu/tdnaprimers.
2.html)相关资料.
2　结果分析
2.1　PCR引物设计
如图 1所示 ,当用 LP和 RP这对引物进行 PCR扩增并进行电泳时 ,在野生型植株(wildtype,
WT)和杂合子(heterozygouslines, HZ)植株中产生一条 PCR产物带 ,分子量大约是 900 bp,而纯合子
(homozygouslines, HM)植株中没有 PCR产物形成;当用 RP和 LB1.3这对引物 PCR扩增时 ,在野生
型植株中没有 PCR产物 ,而在杂合子植株和纯合子植株中均有一条 PCR产物带 ,分子量大小为 410
+Nbp.
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　第 2期 易素华 , 张　丞 , 史志浩 ,等:拟南芥花粉表面蛋白基因 T-DNA插入突变体的鉴定 　　
来源于 htp:∥signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
图 1　 PCR引物设计原理
图 2　电泳结果图
2.2　T-DNA插入位点鉴定结果
T-DNA株系种子种下 3 ～ 4周后 ,每个株系取 10
株 ,提取基因组 DNA作为模板进行 PCR扩增 ,每个株
系用一个野生型植株基因组 DNA作为对照模板.当分
别用 LP、RP和 RP、LB1.3这两对引物进行 PCR扩增
时 ,根据电泳结果(图 2)可判断 ,除了作为对照的 1泳
道 ,其他相邻的两个泳道中 ,当有两条分子量分别为
900 bp和 410+Nbp的 PCR产物时 ,说明该植株在该
位点有 T-DNA插入 ,而且是杂合子植株(如 2和 3、 6
和 7泳道);当只有一条分子量为 410 +Nbp的 PCR
产物时 ,说明该植株在该位点有 T-DNA插入 ,而且是纯合子植株(如 4和 5、8和 9泳道).通过一系列的
PCR扩增和电泳结果分析 ,最后 ,得到了 94个纯合体株系(表 1),并保存种子.
表 1　 142个 T-DNA株系经过 PCR鉴定后获得的 94个纯系 　
基因号 株系的 SALK号 T-DNA插入位点＊
AT1G04410 SALK 054146 +2263, exon
AT1G07750 CS847413 +696, exon
AT1G08700 SALK 038487C +48, exon
AT1G15415 SALK 010026 +29, exon
AT1G23240 SALK 139655C +573, exon
AT1G29250 SALK 005348 -105, promoter
AT1G49490 SALK 004113 +744, exon
AT1G60983 SALK 061344 -152, promoter
AT1G60987 SALK 020303 +421, exon
AT1G61070 SALK 138431C +45, exon
AT1G62820 CS800395 +146, exon
AT1G65930 CS833601 +38, exon
AT1G70490 SALK 131794 +1157, exon
AT1G70730 CS806392 +1670, exon
AT1G73610 CS839694 +335, intron
AT1G75880 SALK 024323C +330, exon
AT1G75890 SALK 121724 0, exon
基因号 株系的 SALK号 T-DNA插入位点＊
AT3G51040 SALK 064824 +1667, exon
AT3G61177 SALK 046556 +227, exon
AT3G61182 SALK 118287 +112, intron
AT3G62290 SALK 130670 +2204, exon
AT3G62710 SALK 069100C +1267, exon
AT4G09795 SALK 135334 +116, intron
AT4G10595 SALK 071474 -171, promoter
AT4G11760 SALK 003342 +723, exon
AT4G13095 SALK 024731 -407, promoter
AT4G15733 SALK 054229 -266, promoter
AT4G19035 SALK 060051 +509, intron
AT4G19905 SALK 046856 +157, intron
AT4G22105 SALK 035495 -384, promoter
AT4G22115 SALK 014992 -425, promoter
AT4G27020 SALK 004816C +124, exon
AT4G29290 SALK 044553 +56, exon
AT4G30074 SALK 105132 +266, intron
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
续表 1
AT1G75920 SALK 057114 +402, exon AT4G30076 CS805496 -179, promoter
AT1G75930 SALK 020241C -84, promoter AT4G33465 CS812738 -197, promoter
AT2G02150 CS816708 +790, exon AT4G39917 CS843341 -364, promoter
AT2G20208 SAKK 052957 -365, promoter AT5G03690 SALK 124050 +14, exon
AT2G22121 SALK 043376 -245, promoter AT5G04885 SALK 065081 +120, exon
AT2G22345 SALK 092205 -57, promoter AT5G07460 SALK 106118C +1015, exon
AT2G25344 CS840363 +45, exon AT5G07470 SALK 032823C +1302, exon
AT2G28355 SALK 045916C +500, intron AT5G07475 CS824808 +377, intron
AT2G29045 SALK 142195 +105, intron AT5G07480 SALK 052621 +1957, exon
AT2G33640 SALK 034833 +1937, exon AT5G07490 SALK 067202 -6, promoter
AT2G36460 SALK 118067 -143, promoter AT5G07500 SALK 042365 +87, exon
AT2G37620 SALK 093023C +998, exon AT5G07560 SALK 026077 +619, exon
AT2G41000 SALK 049409C +260, exon AT5G07590 SALK 033771 +198, exon
AT2G42100 SALK 144931 +450, exon AT5G07620 SALK 039439 -380, promoter
AT2G42170 SALK 143467 +1227, exon AT5G19880 SALK 008455 +86, exon
AT2G47470 SALK 097094 -300, promoter AT5G20940 CS804551 +694, exon
AT2G47510 SALK 080809 +45, exon AT5G38760 SALK 023582 +489, intron
AT3G02480 SALK 145341 +682, exon AT5G42223 SALK 088968 +313, exon
AT3G03670 SALK 076194 +462, intro AT5G42242 SALK 128316 +324, intron
AT3G07850 SALK 057380 +1111, exon AT5G42797 SALK 035691 +26, exon
AT3G08530 SALK 151638 +203, exon AT5G45875 SALK 089063 +344, exon
AT3G11130 SALK 104433 -60, promoter AT5G47030 CS809595 -314, promoter
AT3G17940 SALK 050935 +77, exon AT5G47075 CS802594 -25, promoter
AT3G18780 SALK 048987C +1435, exon AT5G47077 SALK 130282 -256, promoter
AT3G20997 SALK 034310 -134, promoter AT5G47175 SALK 069816 +235, exon
AT3G22950 SALK 027975 +399, exon AT5G48543 SALK 046646 +105, intron
AT3G23165 SALK 051119 -50, promoter AT5G61570 CS814890 +363, exon
AT3G25265 SALK 025043 +314, exon AT5G61590 SALK 015182C +514, exon
AT3G46520 SALK 052709C +615, exon AT5G61640 CS801532 +133, exon
AT3G51030 SALK 044578 +998, exon AT5G62242 SALK 123653 +1103, exon
　　＊说明:以每个基因序列起始密码子 ATG的碱基 A作为序列 1,位于 ATG上游的 T-DNA位点记为 “ -”值 ,位于 ATG下游的 T-
DNA位点记为 “ +”值
2.3　纯合体株系分析以及基因在拟南芥染色体上的分布
在获得的 94个纯合株系基因中有 31%(29/94)属于富含半胱氨酸的花粉包被蛋白(polencoat
protein),另有 3个富含半胱氨酸的 S-位点蛋白.这些蛋白可能参与到花粉和柱头的识别交联过程.此
外 ,还有一些含油体蛋白及激酶 ,这些蛋白通常都具有信号传导的功能.然而 ,所有 T-DNA纯合株系的
生殖生长都没有出现可见表型.
利用 TAIR(htp:∥www.arabidopsis.org/)网站的染色体绘图工具(ChromosomeMapTool),将 94个
纯合体株系基因定位在拟南芥 5条染色体上(图 3).从图 3中可以看出 , 94个基因中有 20.2%的基因
分布在第一条染色体上 ,第二和第四条染色体上均有 16.0%的基因分布 ,且在这两条染色体的短臂上
基本上没有基因分布 ,第三条染色体上有 19.1%的基因分布 ,而第五条染色体上分布的基因最多 ,有
28.7%.
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图 3　94个纯合体株系基因在拟南芥 5条染色体上的分布情况
3　讨　论
被子植物双受精的识别是多位点的 [ 10] ,可分为 3个层次:花粉与柱头 、花粉管与花柱及雌雄配子之
间的识别 ,任何一个环节出了问题都会导致生殖障碍.花粉与柱头之间的识别是至关重要的一步 ,花粉
的识别物质主要是蛋白质分子 ,贮存于花粉的表面.在生物信息学的基础上 ,利用反向遗传学的方法获
得了 94个纯合插入的株系 ,为进一步了解花粉表面蛋白提供了基础.
虽然这 94个株系都是 T-DNA纯合插入 ,但是并没有发现与野生型的表型有差异 ,这可能有两个
原因:(1)这些株系中被插入的基因很多都是同一个基因家族的 ,只敲除其中一个基因 ,该家族中其他
同源基因的表达能够弥补该基因缺失后造成的功能丧失 ,即存在基因冗余;(2)有些插入植株在正常
的环境下并不表现出突变的表型 ,如果改变其生长条件 ,如温度 ,湿度 ,光照强度等 ,有可能发生表型的
改变.
在下一步工作中 ,通过同一基因家族基因的蛋白质序列的比对 ,可以找到同源性较高的基因 ,然后
从遗传分析角度通过构建双突变甚至多突变来研究这些基因的功能.其次 ,逐一改变培养条件 ,观察这
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
94个纯合株系是否有表型的改变 ,以研究环境对花粉表面蛋白功能的影响.再次 ,上述纯合株系的细胞
学发育过程可能存在细微变化 ,如花粉的表面结构及萌发能力等 ,这些可以通过扫描电镜及荧光显微镜
进行细致的细胞学观察 ,以及花粉的体外萌发来进行表型分析.
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IdentificationofT-DNAlinesforanalyzingpolencoat
proteinsinArabidopsisthaliana
YISu-hua, ZHANGChen, SHIZhi-hao, YANGZhong-nan, ZHANGSen＊
(ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:Pollencoatproteins(PCPs)areimportantproteinsinvolvedinAngiospermreproductivedevelopment.Theseproteins
areinvolvedintheprocessesofrecognition, adhesion, andhydrationbetweenpolenandstigma, anddirectlyrelatedwithpollen
germination.Inourwork, basedonthedatabaseofArabidopsispollencoatproteinswehaveestablished, weorderedseedsofT-
DNAtaggedArabidopsisthalianaSALKlinesfromArabidopsisBiologicalResourceCenter, USA, andidentifiedtheT-DNAin-
sertionsitesintheseslines.Theseresultswillsetbasesforthefurtherstudyofpolencoatproteins.
Keywords:pollencoatproteins;Arabidopsisthaliana;SALKlines;T-DNA
(责任编辑:郁　慧)
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