全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.23No.62007June
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铁是植物吸收最多的一种微量元素，在植物生长
发育中起着非常重要的作用。植物缺铁失绿黄化是农
业生产中面临的一个普遍问题。据统计，全世界有1/3
土壤属石灰性，都是潜在性缺铁土壤，地域性缺铁失绿
所造成的经济损失已经成为世界性问题[1,2]。缺铁严重
制约着作物产量、品质的提高及人类的健康状况。据统
计世界上有20多亿人缺铁，中国缺铁性贫血人数也相
当可观。中国某些地方的缺铁性贫血高达20%以上，
预计今后10年如果不采取措施，由于成人缺铁性贫血
造成的生产能力下降而导致的经济损失将高达7020
一种筛选拟南芥低铁响应突变体的有效方法
胡海洲 1,孙菲菲 2,李 报 2,王幼宁 2,李科学 2,贾会珍 3,张文胜 2,李斯深 1,李 霞 2
(1山东农业大学农学院，山东泰安271018；2中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，
河北石家庄050021；3石家庄学院，河北石家庄050035)
摘 要:铁是植物必需的一种微量营养元素。农作物的产量及品质经常因土壤缺铁而降低。研究植物
在低铁条件下生长发育及对铁缺乏响应的分子机制,有助于揭示植物铁营养的遗传基础,有利于改
良和培育耐低铁的农作物。笔者根据野生型拟南芥在低铁条件下的生长和生理表型确定了遗传筛选
突变体的指标,并建立了筛选拟南芥与缺铁信号及信号转导相关突变体的方法。利用这种方法,笔者
筛选出 11株突变体并克隆了一个可能与植物耐低铁胁迫相关的基因,证明该方法适用于鉴别铁营
养相关的重要基因以及分子遗传学的研究。
关键词:拟南芥;低铁;突变体;筛选;遗传基础
中图分类号:Q-33 文献标识码:A
AnEficientMethodforScreeningMutantsWithAlteredResponsesto
IronDeficiencyinArabidopsis
HuHaizhou1,SunFeifei2,LiBao2,WangYouning2,LiKexue2,JiaHuizhen3,
ZhangWensheng2,LiSishen1,LiXia2
(1ColegeofAgronomy,ShandongAgriculturalUniversity,TaianShandong271018;
2CenterforAgriculturalResourcesResearch,InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,
CAS,ShijiazhuangHebei050021;3ShijiazhuangUniversity,ShijiazhuangHebei050035)
Abstract:Feisanessentialmineralnutrientforplantgrowthanddevelopment.Irondeficiencydirectly
afectscropyieldandquality.However,themolecularmechanismofironnutritionislargelyunknown.To
understandhowplantresponsetoFedeficiencystress,inthispaper,wehavedevelopedaneficient
methodforgeneticscreeningArabidopsismutantsrelatedtothestressbasedonthephenotypesin
morphologyandphysiology.Usingthisscreeningmethod,wehaveisolated11putativeT-DNAtagged
mutantswithalterationsinsensitivityinresponsetoirondeficiency.Wehaveclonedonegene,which
mutationcausedincreasedsensitivitytoFedeficiency.Identificationandcharacterizationthedeterminants
inFenutritionofplantwilfurtherourunderstandingongeneticbasisofplantinresponsetonutrient
stress.Itwilprovidenewinsightsonmolecularimprovementofcrops.
Keywords:Arabidopsis,Low-iron,Mutant,Screen,Geneticbasis
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目“农业基因资源发掘与种质创新利用研究”和中国科学院“百人计划”基金项目。
第一作者简介:胡海洲，男，1980年出生，山东济宁人，硕士，主要从事植物分子生物学研究。E-mail:hzhu0103@yahoo.com.cn。
通讯作者:李霞，女，1964年出生，河北石家庄人，研究员，博士，主要从事植物分子生物学研究。通信地址：050021河北省石家庄市槐中路286号，Tel：
0311-85871744，E-mail:xli@genetics.ac.cn。
收稿日期:2007-03-28，修回日期：2007-03-30。
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亿元，儿童缺铁性贫血造成的损失高达21787亿元。可
见，目前人体微量元素缺乏的状况十分严重。所以，加
强植物铁营养分子生物学的研究，通过生物学手段强
化作物尤其是农产品中铁含量对农业发展和人民的健
康有着极其重要的意义[3]。
植物铁素吸收机制的研究已经取得了极大的进
展，并克隆了一些关键性基因，如 FRO2、IRT1、IRT2、
YS1和Nramp等。其中FRO2蛋白属于电子跨膜运输
的细胞色素上游家族，FRO2基因受缺铁诱导表达加
强[4,5]；研究表明IRT1和IRT2是相对非特异性的二价
阳离子转运体，能够转运 Fe和 Zn这类金属 [6,7]；而
YS1可能是一种具有12个跨膜结构域的MAs-Fe3+转
运体，它不仅是根中吸铁的重要组分，也是植物体内铁
吸收和分布的转运体 [8,9]；Nramp作为一种全新的高亲
和性铁转运蛋白，它有着广泛的底物范围，能够转运
锰、铁、锌、钴、镉、铜离子等[10,11]。这些研究为解决植物
缺铁失绿症及提高作物食品的营养价值提供了坚实的
理论基础。
但是人们对植物铁营养的分子机制的了解还很
少。目前存在的主要问题与挑战包括：(1)植物吸收铁
素的机理还没完全弄清楚，尤其是Nramp基因在金属
离子胞内转运的具体作用机制还没有完整的理论体
系[10]。(2)植物铁素吸收利用相关基因的表达条件及部
位、调控因子及酶活性研究等仍处于探索阶段[12,13]。(3)
植物根部和叶片感知铁素水平的受体还未被分离，感
知铁素的机制还不完全清楚[4,14]。目前，正向遗传学方
法是发现基因和研究基因功能的非常有效的手段。利
用模式植物拟南芥筛选突变体和突变基因的功能研究
使植物分子遗传学的研究有了突飞猛进的发展。一个
特异、有效的筛选方法是其成败的关键。因此，建立一
个适用于鉴别和铁素营养及分子调控机制相关基因的
遗传筛选方法对加快铁营养遗传机理的研究至关重
要。笔者根据拟南芥缺铁黄化和生长表型建立了一种
有效的筛选方法，并通过初步筛选获得11个对缺铁敏
感性变化了的候选突变体。本文以拟南芥低铁超敏突
变体的筛选为例，介绍一种简单、有效、通用的拟南芥
突变体的筛选方法。
1材料与方法
1.1植物材料
材料为拟南芥 (Arabidopsisthaliana)野生型
Columbia0(Col0)和T-DNA插入突变体库[15,16]。
1.2实验方法
1.2.1培养基的选择 基本培养基：MS培养基[17]，0.2%
phytagel(w/v)，2%蔗糖(w/v)，pH5.7。
选择培养基(去铁培养基)：除微量元素中不添加
铁元素外，其余条件同MS。
1.2.2播种方法及培养条件 拟南芥种子用 50%漂白
水表面消毒5min，再用无菌水漂洗5~6次；然后用吸
管将种子吸出，均匀地直接播种到培养基上。播种后将
培养皿置于暗下4℃低温处理48h，之后转入培养室
(21±2℃，日光灯光照度50μE/m·s，16h光照/8h黑
暗，相对湿度70%)中培养。试验于2006年1月至9月
在中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究
中心进行。
1.2.3突变体筛选的原则 一般来说，筛选突变体均以
在一定的筛选条件下，突变体植株与正常型植株在某
一性状上呈现明显差异时，确定其为可能的突变体[18]。
本文筛选的是与低铁胁迫有关的拟南芥突变体，确定
其是否为突变体的标准为，在确定的试验条件下(在选
择培养基上生长两周)，按拟南芥植株对低铁的敏感程
度不同所表现出的表型差异选择。
2结果
2.1筛选条件的确立
植物在缺铁条件下表现出一些生理和形态表型的
变化。为了了解拟南芥野生型Col0对缺铁的反应，笔
者首先将Col0种子播种在MS(对照)和选择培养基
上，并对其在萌发和幼苗阶段的变化进行了跟踪观察。
结果发现两周培养后缺铁条件下拟南芥幼苗表现出明
显的黄化(图1)。这个症状也是作物在自然条件下缺铁
的典型表型，说明该表型是对缺铁特异的反应。而且该

图1拟南芥野生型Col0在MS培养基(左图)和选择培养基(右图)上生长情况
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在缺铁情况下，除了黄化(包括花)表型外，还具有植株
矮小、生长发育缓慢、生长周期长、育性差等明显的表
型特征，转移到正常培养基上黄化症状得到明显改善。
说明该突变体的表型确与铁营养相关。该突变体在土
壤中生长也表现出了与野生型不同的症状。
2.3突变体的鉴定
根据T-DNA插入诱导突变原理，真正的突变体
里一定会有预先设定的报告基因。本试验所用突变体
库包含的报告基因为NPTⅡ[15,16]。所以笔者使用PCR
的方法检测所筛选到的可能突变体，其结果见图4。由
图4可以看出，虽然笔者得到的可能突变体表型突出，
但PCR检测结果表明这其中仍有少部分是假突变体。
方法操作简单，重复性好。以无铁培养两周植物叶色和
生长表型为指标进行与缺铁胁迫响应相关突变体的筛
选，有可能筛选出与铁信号感知和信号转导相关的重
要基因。在筛选方法建立后，笔者对该筛选方法进行了
测试。
2.2突变体的筛选和表型分析
利用上述方法，笔者在选择培养基上筛选了8000
粒含有T-DNA标签的突变库种子，共得到11株与铁
营养相关的候选突变体(图2)。其中有一株的表型特别
突出，表现为对缺铁超敏症状。如图3所示，该突变体

图2拟南芥野生型Col0和T-DNA插入突变体库在MS培养基(左图)和选择培养基(右图)上生长情况注:Col0为野生型,P-43、
P-56为T-DNA插入突变体库,箭头所示为候选突变体

原因可能是在筛选中有些种子的状况不好导致了后期
发育的不良。因此，严格的复筛是非常重要的。
2.4突变基因的克隆
由于遗传分析显示该突变为一个核基因突变造
成，笔者根据 T-DNA插入诱导突变的原理运用
TAIL-PCR技术克隆出T-DNA插入片断及部分相邻
拟南芥基因组序列[15,16,19](图5)。测序后，笔者根据测序
结果运用生物信息学手段分析找到了突变的基因
AT3G10290。该基因编码一个功能未知的蛋白。其开
放阅读框架为1814bp，包含4个外显子和3个内含
子，T-DNA插在第一个内含子内，距翻译起始点为
650bp处。据生物信息学预测它可能定位于叶绿体中，
但尚无试验证据。该基因产物与Brassicaoleracea中叶
绿体前体中的磷酸丙糖/磷酸盐转运蛋白有较低的相
注:图A(左)、B、C分别为野生型Col0的苗、茎和花的情况,图A(右)和D、E、F分别为P43的苗、茎、花的情况
图3一株候选突变体P43的表型
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似性。至于该基因如何参与Fe营养及缺铁导致的黄化
表型调控需要进一步的研究。目前笔者正在对该突变
体做功能鉴定、遗传分析和生理生化分析等。
3讨论
筛选拟南芥突变体能否成功，快捷有效的筛选方
法和筛选指标非常关键[20]。越是专一的筛选条件，就越
有机会直接获得所期望的突变体。如正选择法，即设计
一定的培养基或一定的培养条件，使得只有所期望的
突变体能够成活或正常生长。Parks等巧妙地利用正选
择法筛选出phyA缺陷型突变体[21]。用这种方法的两
个关键环节是选择压力和筛选指标[22]。
选择压力是筛选营养胁迫相关突变体的必要条
件，包括筛选浓度和胁迫时间，这两者应当综合考虑运
用。笔者对拟南芥幼苗对缺铁的反应作了详尽的观察，
设计一系列的筛选浓度和胁迫时间 (结果未显示)，目
标是既能使突变体的表型得到发挥，又能使野生型受
到足够的压力而不能表现。在本研究的基础上笔者确
定了对筛选非常关键的指标——幼苗的叶色变化和生
长变化。这些指标不仅与铁营养特异相关，而且形象、
直观，使筛选过程简单、快速、有效。该筛选方法的有效
性在后续突变体的筛选和克隆中得到了验证。因此，笔
者建立的这种方法是具有广泛应用性的、可用于鉴别
与铁营养分子机制相关基因的拟南芥突变体筛选方
法。
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(责任编辑：王运琼)

注:1、2泳道为突变体P43的差异片断,
M:DL-2000DNAMarker
图5TAIL-PCR分离鉴定差异片断图4PCR检测报告基因NPTⅡ
注:C为Col0,1~6为检测的六株候选突变
体,M:DL-2000DNAMarker
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