全 文 ：第３９卷第２期
２０１６年３月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２　０　１　６
文章编号：１０００－１５７３（２０１６）０２－００１５－０６　 ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１６．００２７
拟南芥ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的制备
张晓娅，　张国芳，　司　琪，　崔素娟，　赵红桃
（河北师范大学 生命科学学院，河北石家庄 ０５００２４）
摘要：ＮＦ－ＹＣ９是模式植物拟南芥核因子Ｙ家族成员之一，在开花调控等过程中发挥重要作用，但其蛋白的特
性及其作用的分子机制尚待探究。本文首先扩增获得了ＮＦ－ＹＣ９基因的序列，采用重组技术构建了与麦芽糖
结合蛋白 ＭＢＰ编码基因融合的重组表达载体，将其转化到大肠杆菌ＢＬ２１中，进行了 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９融合蛋白
的诱导表达，并借助直链淀粉亲和层析介质纯化技术获得了电泳纯的 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白，以备进一步对
ＮＦ－ＹＣ９蛋白的生化特性进行全面检测。
关　键　词：拟南芥；ＮＦ－ＹＣ９；重组蛋白；工程菌；ＭＢＰ；亲和纯化
中图分类号：Ｑ７８　　 文献标志码：Ａ
　　收稿日期：２０１５－１１－２０
　　基金项目：河北省普通高等学校高层次人才科学研究项目（ＧＣＣ２０１４０２９）；青年拔尖人才项目（ＢＪ２０１４０４０）部分资助．
　　作者简介：张晓娅（１９９１－），女，河北省沧州人，河北师范大学２０１５届本科生．张晓娅和张国芳为同等贡献作者．
张国芳（１９８９－），女，河北省邢台人，在读博士生，从事植物发育生物学研究．
　　通讯作者：崔素娟（１９６６－），女，河北省石家庄人，教授，从事植物发育生物学与表观遗传学研究．
赵红桃（１９８３－），女，河北省石家庄人，博士，从事表观遗传学与植物抗逆研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｈｏｎｇｔａｏ３２５＠１２６．ｃｏｍ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＮＦ－ＹＣ９　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ
ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｙａ，ＺＨＡＮＧ　Ｇｕｏ－ｆａｎｇ，ＳＩ　Ｑｉ，ＣＵＩ　Ｓｕ－ｊｕａｎ，ＺＨＡＯ　Ｈｏｎｇ－ｔａｏ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｂｅｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈａｎｇ　０５００２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＦ－ＹＣ９，ａｓ　ｏｎｅ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ＮＦ－Ｙ　ｆａｍｉｌｙ，ｐｌａｙｅｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＮＦ－ＹＣ９　ｗａｓ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
（ＭＢＰ）ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　Ｇａｔｅｗａｙ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＢＬ２１．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９ｗａｓ　ｅｓ－
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａｍｙｌａｓｅ－ｒｅｓｉｎ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｌ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｏｕｒ
ｆｕｒｔｈｅｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ａｂｏｕｔ　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＮＦ－ＹＣ９．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＮＦ－ＹＣ９；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ＭＢＰ；
ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　核因子Ｙ（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　Ｙ，ＮＦ－Ｙ）家族是广
泛存在于动植物中的转录因子家族之一［１］，具有发
育及逆境胁迫适应等多种生物学功能［２－５］。与动物
相比，高等植物基因组中含有较多的 ＮＦ－Ｙ成员编
河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
码基因，其中模式植物拟南芥中预测含有３６个ＮＦ－
Ｙ成员，分为 ＮＦ－ＹＡ、ＮＦ－ＹＢ和 ＮＦ－ＹＣ三个亚家
族［６］。ＮＦ－ＹＡ可以通过其Ｎ端的２个功能保守的
结构域与ＮＦ－ＹＢ以及ＮＦ－ＹＣ相互作用，而Ｃ端结
构域可以与 ＤＮＡ相互作用，ＮＦ－ＹＢ和 ＮＦ－ＹＣ的
保守结构域也包括一些和ＤＮＡ相互作用的基序，
并且三个亚家族成员间可通过蛋白质直接相互作用
形成三聚体［７－１０］。已有文献报道，ＮＦ－Ｙ亚家族成员
具有不同的组织表达特异性［１１］，一些成员功能冗余
地参与模式植物拟南芥的开花调控［２］。但在植物
中，ＮＦ－Ｙ成员是如何参与植物的生长发育调控的
过程，尚不清楚。ＮＦ－ＹＣ９是拟南芥１３个 ＮＦ－ＹＣ
成员之一，在拟南芥的根、叶及花等组织中广泛表
达［１１］，这预示着它可能参与植物多个器官生长发育
过程。本实验室前期酵母双杂交文库筛选研究表
明，植物特有转录因子家族成员ＬＣＵ（Ｌｅａｆ　Ｃｕｒｌｉｎｇ
Ｕｐｗａｒｄ）及其突变蛋白ｌｃｕ与拟南芥多个 ＮＦ－ＹＣ
成员可能存在直接的相互作用，其中就包括 ＮＦ－
ＹＣ９［１２］。本试验将借助工程菌重组表达、亲和层析
纯化获得可溶性的 ＮＦ－ＹＣ９与麦芽糖结合蛋白
（Ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）的重组融合蛋白，
将用于进一步分析 ＮＦ－ＹＣ９与ＬＣＵ／ｌｃｕ或其它转
录因子蛋白或靶基因ＤＮＡ序列的结合，这将利于
对ＮＦ－ＹＣ９的生化特性及生物学功能分子机制的
了解。
１　材料与方法
１．１　材料
所用的拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）幼苗ｃＤ－
ＮＡ，大肠杆菌菌种Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α和ＢＬ２１及其感受
态菌为本实验室保存；入门载体ｐＥＮＴＲＴＭ／ＳＤ／Ｄ－
ＴＯＰＯ ，Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ和Ｇａｔｅ－
ｗａｙ　ＬＲ　Ｃｌｏｎａｓｅ Ⅱ Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ 为ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）产品；目标载
体ＧＷ－ｐＭａｌ－ｃ２　Ｘ 由河北师范大学汤文强教授提
供；引物合成及 ＤＮＡ 测序由上海生工（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｓａｎｇｏｎ．ｃｏｍ）完成；直链淀粉树脂（Ａｍｙｌａｓｅ
ｒｅｓｉｎ）为ＮＥＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＮＥＢ．ｃｏｍ）产品。
１．２　方法
１．２．１　ＴＯＰＯ定向克隆ＮＦ－ＹＣ９编码序列　以１０ｄ
龄拟南芥幼苗的ｃＤＮＡ为模板，以５′端添加了ＣＡＣＣ
的正向引物ＧＷ－ＮＦ－ＹＣ９Ｆ（５′－ｃａｃｃＡＴＧＧＡＴＣＡＡ－
ＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＣ－３′）及 反 向 引 物 ＧＷ－ＮＦ－
ＹＣ９Ｒ（５′－ＣＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣ－
３′）为引物对，用ＦａｓｔＰｆｕ进行ＰＣＲ扩增。用胶回
收试剂盒回收目的片段，利用ｐＥＮＴＲＴＭ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ
ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔｓ，与入门载体ｐＥＮＴＲＴＭ／ＳＤ／
Ｄ－ＴＯＰＯ进行ＴＯＰＯ　ｃｌｏｎｉｎｇ反应，热激法转化Ｅ．
ｃｏｌｉ　ＤＨ５α感受态［１３］，在含有５０μｇ／ｍＬ 卡那霉素
（Ｋａｎｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎａ＋）的 ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ，１％
Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ）固体培
养基上筛选阳性克隆，采用菌体ＰＣＲ鉴定［１３］及提
取质粒的ＰｓｔⅠ和ＮｃｏⅠ双酶切鉴定是否获得入门
载体ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９，若符合预期，再经 ＤＮＡ测
序确定 ＰＣＲ 扩增的编码序列（Ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，
ＣＤＳ）是否正确。
１．２．２　Ｇａｔｅｗａｙ系统的ＬＲ反应　将鉴定正确的
入门载体ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９与目标载体ＧＷ－ｐＭａｌ－
ｃ２Ｘ 进 行 ＬＲ 重 组 反 应，热 激 转 化 大 肠 杆 菌
ＤＨ５α［１３］，在含有５０μｇ／ｍＬ氨苄霉素（Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ，
Ａｍｐ＋）的ＬＢ平板上筛选阳性克隆，菌体ＰＣＲ鉴
定［１３］及对提取的质粒进行 Ｈｉｎｄ Ⅲ和ＮｃｏⅠ双酶
切鉴定，对符合预期的单克隆质粒再次进行 ＤＮＡ
测序检验序列及阅读框是否正确。
１．２．３　重组蛋白的诱导表达　挑取热激法转入重
组表达载体的大肠杆菌ＢＬ２１的阳性单克隆于３
ｍＬ含有Ａｍｐ＋的ＬＢ培养液中，３７℃过夜，第２天
接种于１５０ｍＬ含有Ａｍｐ＋的ＬＢ培养液中，３７℃
下进行扩培，直至ＯＤ６００吸光值达到０．４～０．６之
间，取出１ｍＬ作为诱导前的样品，之后分别添加诱
导剂异丙基硫代半乳糖苷（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａ－
ｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ），使其终浓度为０．１或０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ，分别在不同温度下诱导培养５ｈ，每小时
留取１ｍＬ培养物。余下的菌体离心后去上清，沉
淀冻存在－２０℃。
１．２．４　大肠杆菌蛋白的制样及电泳　全蛋白（Ｔｏｔａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔ）的快速制样：将收集的１ｍＬ大肠杆菌各种
样本经１２　０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心２ｍｉｎ，去上清，加１００
μＬ　２×蛋白样品缓冲液重悬菌体沉淀，充分振荡混匀
后，于１００℃水浴５～１０ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５
ｍｉｎ，上清即可进行蛋白质的十二烷基磺酸钠－聚丙烯
酰胺凝胶电泳（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）［１４］。
６１
　第２期 张晓娅等：拟南芥ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的制备
可溶性上清蛋白及包涵体沉淀蛋白的制样：菌
体裂解采用溶菌酶分解细菌壁和超声波破碎ＤＮＡ
方法，具体操作如下：取－２０℃冻存的菌体，冰浴中
用１０ｍＬ　ＣＢ （Ｃｏｌｕｍｎ　ｂｕｆｆｅｒ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－
ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、
１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ及１ｍｇ／ｍＬ溶菌酶）重悬菌体，
４℃放置３０ｍｉｎ后使用细胞超声破碎仪破碎ＤＮＡ
（３０Ｗ 功率、超３ｓ、停５ｓ）约１０～１５ｍｉｎ（冰上操
作，注意勿产生气泡），至菌破碎液可成滴滴下为止。
将超声后的样品于４℃１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，
将上清（ｓｏｌｕｂｌｅ，ｓ）与沉淀（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ，ｉ）蛋白分别进
行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳。
采用Ｌａｅｍｍｌｉ系统的非连续胶ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电
泳［１４］，其中浓缩胶为４％，分离胶为１２％。电泳后
的凝胶经考马斯亮蓝Ｇ２５０染色、脱色后，进行凝胶
扫描取图。
１．２．５　直链淀粉介质亲和层析　参照ＮＥＢ生产商
提供的 ＭＢＰ亲和纯化使用手册进行实验（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅ８２００－ｐｍａｌ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｕ－
ｓｉｏｎ－ａｎｄ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍ）。
２　结果与分析
２．１　ＮＦ－ＹＣ９基因的编码序列分析及蛋白特性
预测
首先从拟南芥研究数据平台ＴＡＩＲ网（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ａｒｓｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）中获得如下信息，拟南芥
ＮＦ－ＹＣ９ （ＮＵＣＬＥＡＲ　ＦＡＣＴＯＲ　Ｙ，ＳＵＢＵＮＩＴ
Ｃ９）蛋白也被称为 ＨＡＰ５Ｃ（ＨＥＭＥ　ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ
ＰＲＯＴＥＩＮ　５Ｃ），其基因编号为ＡＴ１Ｇ０８９７０，蛋白编
码序列ＣＤＳ包括６９６个碱基，预测编码的蛋白包括
２３１个氨基酸（图１），蛋白相对分子量为２５．６４
ｋＤａ，等电点４．８８。这些均为后续的引物设计、ＣＤＳ
序列克隆及载体构建酶切分析及蛋白的诱导表达提
供了理论依据。
借助Ｏｍｉｇａ软件翻译的ＮＦ－ＹＣ９蛋白的氨基酸信息（上行），氨基酸以单字母表示．
图１　ＮＦ－ＹＣ９的ＣＤＳ及氨基酸序列信息
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＮＦ－ＹＣ９
２．２　ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ片段的扩增
以拟南芥幼苗ｃＤＮＡ为模板，采用方法１．２．１
给出的引物对，经过ＰＣＲ获得ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ的扩
增产物，扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳进行检测
（图２），在约７００ｂｐ处有明显的特异条带，与预期条
带大小一致，并对该条带进行了回收，回收产物量
８２９．５ｎｇ，浓度约为２３．７ｎｇ／μＬ。 泳道１，ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；泳道２，ＰＣＲ扩增产物。＾ 示上样孔；
＃示约７００ｂｐ的ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ条带；＊示引物二聚体．
图２　琼脂糖凝胶电泳示ＮＦ－ＹＣ９　ＣＤＳ序列ＰＣＲ扩增产物
Ｆｉｇ．２　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＮＦ－ＹＣ９
ＣＤＳ　ａｆｔｅｒ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
７１
河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
２．３　ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９入门载体的鉴定
将目的片段与入门载体ｐＥＮＴＲＯ／ＳＤ／Ｄ－ＴＯ－
ＰＯ（图３Ａ）进行定向反应，产物转化大肠杆菌感受
态，对克隆进行菌体ＰＣＲ（图３Ｂ）。在检测的２１个
克隆菌中，除１、５、１２、１６、１９外均在７００ｂｐ左右处
扩增出目的条带；选取４、２１号单克隆菌提取质粒，
进行ＮｃｏⅠ和ＰｓｔⅠ双酶切鉴定（图３Ｃ），结果显示
４和２１号克隆菌质粒均可切出约５５０ｂｐ大小条带，
符合预期条带大小；利用 ＴＯＰＯ载体上 Ｍ１３正向
及反向引物进行ＤＮＡ测序，结果显示２１号质粒中
ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ序列完全正确。至此获得了ｐＴＯＰＯ
ＮＦ－ＹＣ９入门载体。
Ａ．ｐＴＯＰＯ／ＳＤ／Ｄ－ＴＯＰＯ图谱（左）及部分序列信息（右）；Ｂ．ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９菌体ＰＣＲ电泳图，Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；１～２１，菌体单克隆的编
号；Ｃ．４和２１克隆的ＮｃｏⅠ和ＰｓｔⅠ双酶切产物电泳。＾ 示上样孔；＃菌体ＰＣＲ扩增条带；＊示引物二聚体；＊＊示酶切后的载体片段；＊＊＊示酶
切下的目的片段．
图３　ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９入门载体的构建及酶切鉴定
Ｆｉｇ．３　ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．４　ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９表达载体的鉴定
方法２．２所述的ＬＲ反应之后，菌体ＰＣＲ鉴定
获得了较多的ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９可能的阳性克隆（图
４Ａ）。随后通过限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ 和ＮｃｏⅠ对
其中的８号克隆进行双酶切鉴定（图４Ｂ），切出约
８００ｂｐ大小条带，符合预期条带大小。进一步ＤＮＡ
测序结果显示其中的ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ序列正确，并且
以正确的阅读框融合在麦芽糖结合蛋白编码基因
（ｍａｌＥ）后，至此获得了ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组表达
载体。ＭＢＰ与ＮＦ－ＹＣ９蛋白间的连接氨基酸有２５
个，预测 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９融合蛋白的分子量应为
７０．２ｋＤａ。
Ａ．菌体ＰＣＲ产物琼脂糖电泳图．Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；１～２０，菌体单
克隆的编号，２０和２１分别为阳性和阴性对照；Ｂ．８号克隆的 Ｈｉｎｄ
Ⅲ和ＮｃｏⅠ双酶切鉴定电泳图。＾ 示上样孔；＃示菌体ＰＣＲ扩增目的
条带；＊示引物二聚体；＊＊示酶切后的载体片段；＊＊＊示酶切下的目
的片段．
图４　ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９的鉴定
Ｆｉｇ．４　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９
２．５　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的诱导表达条件摸索
及纯化
　　将构建好的工程菌进行培养，加不同浓度的
ＩＰＴＧ诱导剂，分别在３０℃和３７℃条件下振荡培
养，每小时取样一次，制样后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（图
５），结果显示３０℃和３７℃下，ＩＰＴＧ浓度为０．１或
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的条件下诱导１ｈ，在约７０ｋＤａ处有明
显的诱导条带，随着温度的升高、ＩＰＴＧ浓度的增加
及诱导时间的延长，该诱导蛋白条带量明显增加。
图５　温度、诱导剂ＩＰＴＧ及培养时间
对 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９表达的影响
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＩＰＴＧ　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
图Ａ和Ｂ分别为３０℃和３７℃条件下诱导 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白
的菌体全蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图。图Ａ中１为诱导前；图Ａ中２和
图Ｂ中３为标准分子量蛋白（１７０、１３０、１００、７０、５５、４０、３５、２５ｋＤａ）；
图Ａ中３、５、７、９、１１和图中Ｂ中１、４、６、８、１０为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ
诱导１～５ｈ；图 Ａ中４、６、８、１０、１２和图Ｂ中２、５、７、９、１１为０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导１～５ｈ．
８１
　第２期 张晓娅等：拟南芥ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的制备
采用溶菌酶及超声破碎仪破碎诱导５ｈ的细
菌，离心分别获取上清和沉淀蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
检测表明（图６），在３０℃和３７℃条件下，与０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导相比，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ时诱导蛋白
的可溶性较好；３７℃０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ 诱导时蛋
白的可溶性有减少趋势；３０℃ＩＰＴＧ 浓度为０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ时可溶性蛋白较多，但可能是这一孔道蛋
白上样量明显增多造成的，因此综合表达总量和可
溶性蛋白量，拟选３０℃条件下，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ
诱导为后续纯化蛋白时的表达条件。
泳道ｓ和ｉ分别表示菌体裂解后离心获得的上清可溶性及沉淀重组
蛋白；Ｍ标准分子量蛋白；＜示 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白．
图６　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ示可溶性 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９
表达的适宜条件
Ｆｉｇ．６　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｆｏｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９
　　对３０℃０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导２ｈ的可溶性
上清蛋白，进行了直链淀粉的亲和层析纯化条件摸
索（图７），ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表明，获得了纯度及浓度
较高的可溶性 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白。
　　泳道１和２分别指示诱导前后的菌体全蛋白；泳道３和４分别
指示诱导菌体裂解后的离心上清及沉淀蛋白；泳道５表示上样时亲
和柱的流出液；泳道６和７分别指示分步洗涤时的第１及６次流出
液；泳道８～１２为分步洗脱蛋白＜示 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白；★示
杂蛋白或降解的重组蛋白．
图７　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的纯化过程
的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测
Ｆｉｇ．７　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ
３　讨论与结论
Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术是ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的专利，
是基于λ噬菌体的位点特异性重组反应开发出来
的。本研究通过Ｇａｔｅｗａｙ系统的ＴＯＰＯ定向克隆，
快速获得了ｐＴＯＰＯ　ＮＦ－ＹＣ９入门载体，通过入门
载体与目的载体的ＬＲ重组反应，获得了工程菌表
达载体ｐＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９。Ｇａｔｅｗａｙ系统的重组载体
构建与经典克隆的酶切－连接等多步骤相比，只需一
步在重组酶催化下的生化反应便能达到目的，但对
于本身含有与重组位点类似的片段或结构复杂的片
段可能还会受影响。本研究表达载体的成功构建说
明ＮＦ－ＹＣ９ＣＤＳ序列适用于Ｇａｔｅｗａｙ系统，这为后
续ＮＦ－ＹＣ９各种原核及真核表达载体的构建提供
了便利。
ＭＢＰ是一种工程菌表达蛋白常用的大分子融
合标签蛋白，其分子量约为４０ｋＤａ，该标签蛋白有
助于融合蛋白的可溶性，借助直链淀粉亲和介质也
较容易进行纯化，并且作为对照的 ＭＢＰ蛋白自身
也很容易获得，因此本文选择构建、成功诱导并纯化
获得了一定量的可溶性 ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９融合蛋白。
通过对诱导剂浓度、培养时间及温度等诱导条件的
摸索，表明ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白在菌体中存在着
可溶性形式，更多的存在于包涵体沉淀中，但通过亲
和层析富集仍然可以获得一定量、能够满足后续的
蛋白互作或与ＤＮＡ序列结合分析。卫静等采用经
典的酶切连接方式，获得了拟南芥 ＮＦ－ＹＣ的另一
个成员 ＮＦ－ＹＣ２（ＡＴ１Ｇ５６１７０）的工程菌表达载体
ｐＥＴ－４８ｂＮＦ－ＹＣ，通过诱导表达仅获得了包涵体中
存在的融合 Ｈｉｓ标签蛋白的重组蛋白［１５］，虽然后续
可进行包涵体蛋白的复性，但程序复杂，抗体制备尚
可用，但若用于分子间互作分析难度更大。
虽然本试验纯化获得了一定量的可溶性的
ＭＢＰ－ＮＦ－ＹＣ９的融合重组蛋白，但纯化体系还需要
进一步优化，如洗涤时有很多的目标蛋白也被洗去，
这可能是蛋白样品过载，也可能是洗涤缓冲液中添
加的Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００带来的 ＭＢＰ与直链淀粉介质的
亲和力降低造成的，这可以通过增加不影响 ＭＢＰ
与柱介质结合的ＮａＣｌ盐浓度或延长洗涤时间来代
替；洗脱峰管不集中的问题，则可以通过提高麦芽糖
的浓度来尝试能否解决；对于纯化蛋白条带中还含
有的小分子蛋白，通过免疫印迹判断是杂蛋白还是
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河 北 农 业 大 学 学 报 第３９卷　
降解的目的蛋白，并注意纯化过程中保持低温及蛋
白酶抑制剂的使用。总之，本研究应是首次报道可
溶性ＮＦ－ＹＣ９重组蛋白的纯化，这将对深入认识
ＮＦ－ＹＣ９的生化特性及生物学作用分子机制及其它
ＮＦ－Ｙ家族成员的重组蛋白制备提供参考。
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