全 文 ：2002-07-02收到 , 2002-11-08 接受。
国家自然科学基金(No.30070395)项目资助。
＊通讯作者(E-mail:xuyuquan@hotmail.com)。
一种改进的诱发拟南芥产生系统抗病性的方法
何逸建 戚益平 许煜泉＊
(上海交通大学生命科学技术学院 , 上海 200240)
摘要:报告了诱发拟南芥产生系统抗性的改进的方
法。通过直接用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluores-
cent)M18 菌悬液浇灌植株根际代替收集菌体与土壤混
合的方法 、以直接播种替代移苗以及以病原菌喷雾接
种法替代蘸叶接种法 , 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)
生态型 Columbia 中 , 有效地建立了诱导性系统抗性
(induced sy stemic resistance , ISR)的实验模式。这种改
进的方法简化了操作步骤 ,缩短了试验周期 ,使大规模
筛选 IS R突变体成为可能 , 同时还能避免因移栽引起
的各种其他抗性反应的干扰。
关键词:拟南芥;荧光假单胞菌;诱导的系统性抗病
(ISR)
中图分类号:Q945
诱发植物产生系统性抗病的途径分为两条 。
经典的途径是通过接种病原菌 ,植物体产生超敏反
应(hypersensitive reaction ,HR),在其未接种的其它
部位产生对病原体的广谱抗性 ,称为系统获得性抗
性(systemic acquired resistance , SAR)(Hammer-
schmidt和 Kuc 1995)。病原菌诱导的 SAR途径与
水杨酸的内源性合成有关(Malamy 等 1990), SAR
途径还伴随有一系列与病程相关(pathogenesis-re-
lated ,PR)蛋白的表达 , 这常被看作 SAR 的标志
(Van Loon 1997)。另一条诱导系统性抗病的途径
是根际细菌诱发的诱导性系统抗性(induced sys-
temic resistance , ISR)。根际细菌大量存在于植物
根系表面 ,以植物根部的分泌物和溶解物为营养物
质。某些根际细菌具有促进植物生长的作用 ,被称
为植物促生根际菌(plant g row th-promo ting rhi-
zobacteria , PGPR),其中一些株系能够诱导植物产
生系统抗性 , 称为根际细菌诱发的系统抗性 。目
前 , IS R现象已经在黄瓜 、烟草以及模式植物拟南
芥等多种植物上观察到。 ISR与 SAR 很相似 , 都
能有效地使植物在诱导处以外的部位获得广谱抗
性。但是 ,与 IS R相比 ,致病菌诱导的系统抗病性
往往与植株的损伤反应相联系 ,抗损伤反应的信号
分子与抗病性信号分子 ,会交叉在一起 ,难以严格
区分 , IS R由非致病性的 PGPR诱导 ,相对来讲 ,该
系统较为单一 ,更有利于分析系统抗性发生的信号
传递途径 。
Pieters等将短日照条件下生长的拟南芥幼苗
移栽入混有 PGPR菌 WSC417r 菌体的土壤中 ,诱
导植株产生 ISR抗性 ,使用蘸叶接种法在植株上接
种病原菌 ,通过评估发病严重程度判别植物是否产
生了 IS R抗性 ,建立了以拟南芥为基础的模式系统
用于研究 ISR 发生的分子机制 , 取得了重要进展
(Pieterse等 1996)。利用对各种拟南芥 IS R突变体
分析 ,已经证明 IS R是一条独立于 SAR的新的信
号传递途径(Pieterse等 1998),它与茉莉酸甲酯的
内源性合成有关。目前 ,深入开展 ISR分子机制研
究的主要障碍仍然是缺乏大量的可供研究的突变
体 ,新的突变体是从分子生物学上研究并阐明 ISR
生命过程的最有价值的材料 。但是 , Pieterse 的方
法试验周期较长 ,工作量大 ,容易产生伤害等其他
抗性的干扰 ,不适用于开展大规模的突变体筛选。
为此 ,本实验室对 Pieterse的方法进行了改进 ,直接
用 PGPR菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas f luores-
cent)M18菌悬液浇灌植株根际代替收集菌体与土
壤混合的方法 ,减轻了工作量;病原菌喷雾接种法
取代了蘸叶接种法 ,简化了操作步骤;采用直播幼
苗替代移栽苗 ,避免因移栽所引起的各种其他抗性
的干扰;用长日照取代了短日照 ,缩短了试验周期。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型 Columbia
上建立了 IS R模式系统 ,使大规模筛选 ISR突变体
成为可能 。采用本方法对 6 000多株 M2 代拟南芥
个体展开筛选 ,已经获得了 ISR抗性明显改变的突
变个体。
1 材料与方法
1.1 拟南芥的种植
将拟 南 芥 (Arabidosis thal iana)野 生 型
Columbia(Col-0)种子直接播于人工土中 , 4℃下春
化 72 h , 然后转入人工培养室(相对湿度 80%,温
度控制在 20 ～ 24℃,光照强度 80 ～ 200 μmol m-2
75植物生理与分子生物学学报 , Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2003 , 29(1):75-79
s-1 , 光照周期:短日光照为 9 h/d ,长日光照为 15
h/d)
1.2 微生物培养
非病原性根际细菌荧光假单胞菌 M18 的培
养 ,使用 King氏 B培养基(King 等 1954), 28℃培
养过夜 ,离心收集菌体 ,悬浮于 MgSO4 10 mmol/L
溶液 ,菌悬液稀释成 107 cfu/ml。
病原菌丁香假单胞菌番茄变种(Pseudomonas
syringae pv.tomato)DC3000(由 Andrew Bent 提
供)的培养使用 King 氏 B培养基 , 28℃培养过夜 ,
离心收集菌体 ,溶液悬浮菌体 ,稀释成一定浓度的菌
悬液。
1.3 诱导处理
本试验采用根部处理诱发拟南芥产生 ISR。
拟南芥苗龄为 2周 ,将终浓度为 107 cfu/mL 的荧光
假单胞菌(Pseudomonas f luorescent)M18菌悬液浇
灌于植株根部(每株浇菌悬液约 5 mL)。空白对照
组用 MgSO410 mmol/L 溶液作根部处理 。
1.4 病原菌接种及发病状况的评估
根部处理的植株 ,经 3周短日照或 2周长日照
后进行病原菌接种 。接种前保湿(RH 为 100%)24
h 。使用病原菌 DC3000 的菌悬液(含0.01%(V/
V)表面活性剂 Silwet L-77 ,终浓度 2.5×107 cfu/
mL进行叶片喷雾或蘸叶接种 。病原菌接种 4 d
后 ,每个处理组随机选取 16株进行发病状况的评
估。植株叶片的发病状况按照严重程度分成 4个
级别(图 1),计算植株的病情指数(方中达 1998):
病情指数=(病级叶数×级数)/(叶数总和×发
病最重级的级数)。
图 1 发病的分级标准
Fig.1 Ranking of the severity of disease
A:First rank;B:Second rank;C:Third rank;D:Fourth rank.
对接种病原菌叶片中的 DC3000 细菌计数:每
个处理组中随机取 10片叶 ,称重 ,用无菌水洗涤后
在 MgSO410 mmol/ L溶液中匀浆 ,适当稀释后涂布
在 King 氏 B培养基(含利福平 50 mg/ L 和放线菌
酮 100 mg/ L)上 ,28℃培养 48 h后统计菌落数 ,计
算出每克病叶所含病原菌数目(Pieterse 等 1998)。
1.5 根际细菌M18的计数
取土壤 0.5 g 放入 50 mL MgSO4 10 mmol/L
溶液的三角瓶中 ,瓶中含玻璃珠 , 剧烈振荡 , 适当
稀释后 , 涂布于含有 M18抗生素标记(amp50 rif 10
tet10sp100)的培养基上 ,28℃培养 ,48 h后统计菌落
数 ,计算出每克土壤所含 M18数目 。
每个处理组各取 10株植株 ,取根部称重 ,放入
含玻璃珠的 10 mL M gSO4 10 mmol/L 溶液中剧烈
震荡 ,稀释后涂布于 M18的抗性培养基上 ,28℃培
养过夜后统计菌落数 ,计算出每克根系上定植的
M18菌数。
2 结果
2.1 M18在植株根际的定植
用浓度为 107 cfu/mL 的 M18菌悬液浇灌植株
根际后 ,土壤中 M18的含量可以在较长一段时间
里保持在 105 cfu/mL 这个数量级上。植株根部定
植的 M18也可以达到 105 cfu/mL 这个数量级 ,并
保持一个阶段(图 2)。
图 2 M18 在土壤及植株根部的含量变化
Fig.2 Population changes of M18 in soil and rhizosphere
76 植物生理与分子生物学学报 29 卷
2.2 病叶中的病原菌 P.s.tomato DC3000含量
无论在何种光照条件下 ,与使用 MgSO4 10
mmol/L 溶液处理的对照组相比 ,经过 M18根部处
理的植株可以明显地抑制病原菌 P.s.tomato
DC3000在叶部的繁殖(图 3 、4),与统计得到的病
情指数的差别相符合 ,表明植株产生了对病原菌的
ISR抗性。短日照条件下经过 M18根部处理的植株
的病情指数明显下降 ,与对照组相比 ,差异极显著(图
5)。
图 3 长日照条件下叶部病原菌群数的变化
Fig.3 Population changes of phytopathogen on leaf under long-day
condition
图 4 短日照条件下叶部病原菌群数含量变化
Fig.4 Population changes of phytopathogen on the leaf under
short-day condition
图 5 不同光照条件下病情指数的变化
Fig.5 Disease index changes under different day lengths
P<0.01 , compared with the control(Long:F =46.96 , F0.01=
7.56;Short:F=40.16 , F0.01=7.56)(n=16).
2.3 不同接种方法对发病状况的影响
比较两种不同的病原菌接种方法 ,使用蘸叶接种
法的植株病情指数比喷雾接种的略高些 ,但差异不明
显。无论采用何种接种方法 ,经过M18根部处理的植
株的病情指数明显下降 ,与对照组相比 ,差异极显著
(图6 、7)。
图 6 不同接种方法对病情指数的影响
Fig.6 Disease index changes under different ways of inoculation
P<0.01 , compared with the control(Spraying:F=67.93 , F0.01=
7.56;Dipping:F=79.43 , F0.01=7.56)(n=16).
图 7 发病状况的比较
Fig.7 Effect of rot treatment with M18 on the severity of disease
A:Control;B:Root treatment with M18.
771 期 何逸建等:一种改进的诱发拟南芥产生系统抗病性的方法
3 讨论
通过吸收 、改进前人的方法(Pieterse等 1996),在
拟南芥生态型Columbia(Col-0)中 ,成功地建立了诱发
产生 ISR的实验系统。经过 M18根部处理的植株可
以明显抑制病原菌 P.s.tomato DC3000的感染 ,降低
病情指数。证明 M18能有效诱发 Col产生 ISR ,可作
为诱导 ISR的一种模式系统。
Pieterse等(1996)的方法主要利用已经完成基因
定位的突变体 ,深入分析突变基因在 ISR信号传递途
径中的位点和作用 ,更着重于试验结果的精确性。为
了开展大规模的 ISR突变体的筛选 ,本方法主要的改
进之处是简化了步骤 、缩短了周期 ,从而提高了筛选效
率。与 Pieterse等方法相较 ,本系统对植株生长条件 ,
诱发植株产生 ISR抗性方法以及病原菌接种技术等
三方面作了较大改进。Pieterse等人在短日照的条件
下 ,种植拟南芥植株 ,植株的莲座叶数量较多 ,叶片面
积较大 ,有利于叶部病原菌接种和发病状况的评估。
但是 ,短日照条件下生长周期较长 ,整个试验周期相应
延长。本文采用长日照生长条件 ,虽然植株的莲座叶
数量较少 ,叶片较小 ,但诱导菌诱发植株产生的 ISR抗
性并未受到影响 ,仍然可以方便地判别植株是否产生
了 ISR抗性(图 2 ～ 4),而试验周期则缩短了约两周。
本文方法采用了 M18菌悬液浇灌植株根际的方法诱
导植株产生 ISR抗性 ,与收集菌体与土壤混合的方法
相比 ,工作量大为减少 ,但同样可以在较长的时期内中
保持诱导菌在土壤中的一定浓度 ,保证了诱导菌在植
物根际定植(图1),这对于大规模的突变体筛选工作
比较有利。更重要的是用菌悬液浇灌植株根际的方法
可以代替移苗的方法 ,这样既简化操作步骤 ,也避免了
因移苗而必然造成的根系损伤以及各种生理反应对实
验结果的干扰。Pieterse采用病原菌蘸叶接种法 ,这种
方法侵染效果好且对每株植株的侵染效果较为均一 ,
但操作较复杂 ,不利于大规模采用。本文改用喷雾接
种法 ,病原菌的致病性没有明显变化(图 5),通过病情
指数的统计检验植株是否产生 ISR ,工作量大大减少。
不足之处是造成假阳性的可能增加 ,但通过严格操作
步骤可以降低这种可能性。以上改进的 ISR诱发模
式更加适合于大规模的突变体筛选。利用该系统对经
甲基磺酸乙酯(EMS)、快中子以及γ射线诱变的拟南
芥Columbia M2代进行了大规模筛选 ,已获得了若干
株诱导抗性发生明显变化的突变体(数据另文发表)。
目前 ,正对突变体进行遗传分析研究 ,并将进行图位克
隆 ,以期找到相关基因 ,探索根际细菌诱导 ISR途径的
分子机理。
致谢:中国科学院植物生理生态研究所黄海研究员对本文阅
改及提供人工培养室。
参考文 献
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Hammerschmidt R, Kuc J(1995).Induced Resistance to Disease in
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Malamy J , Carr JP, Klessig DF , Raskin I(1990).Salicylic acid:a
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Pieterse CMJ , Van Wees SCM , Hoffland E , Van Pelt JA , Van
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Pieterse CMJ , Van Wees SCM , Van Pelt JA , Knoester M , Laan
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Van Loon LC(1997).Induced resistance in plants and the role of
pathogenesis-related proteins.Eur J Plant Pathol , 103:753-
765
78 植物生理与分子生物学学报 29 卷
An ImprovedMethod for Inducing Systemic Resistance in Arabidopsis thaliana
HE Yi-Jian , QI Yi-Ping , XU Yu-Quan＊
(College of Biotechology and Life Science , Shanghai Jiaotong Universi ty , Shanghai 200240)
Abstract:This report describes an improved
method for inducing systemic resistance in
Arabidopsis thaliana.This includes irrigating
plants directly w ith Pseudomonas f luorescent
suspension instead of combining collected M18
w ith soil sow ing seeds derectly w ithout the ad-
ditional step to t ransplant seedlings to soil , and
pathogen spraying instead of leaf-dipping inoc-
ulation(Fig.5).With treatment of M18 , this
improved method set up the induced systemic
resistance(ISR)model effectively under long-
day and short-day conditions(Figs.2-4).Be-
cause of the simplification of the operation and
shortening of the experiment periods , it makes
the large scale screening of ISR mutants possi-
ble.In addition , this method can avoid the
disturbance caused by other resistants caused
by the transfer of seedlings.
Key words:Arabidopsis thaliana;Pseudomonas f luorescent ;
induced systemic resistance(I SR)
＊Corresponding author(E-mail:xuyuquan@hotmail.com).
2002年《植物生理学报》审稿人名单
我刊 2002年来稿由以下专家审查。公布本名单(按姓氏拼音为序)以表示衷心的感谢。
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赵广荣 赵世杰 赵毓橘 郑 重 郑光华 种 康 周 燮 周人纲 朱 祯 邹 琦 左元梅
79Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2003 , 29(1):75-79