全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 2期，第 196-200页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.2, 196-200
研究报告
Research Report
拟南芥 DG1参与叶绿体早期光合蛋白合成功能
陈娜 1,3 温泽文 1 左然 2 周翠燕 2 胡建成 1*
1兰州大学生命科学学院,兰州, 730020; 2山东省能源生物遗传资源重点实验室,中科院青岛生物能源与过程研究所,青岛, 266101; 3唐山市
农业科学研究院,唐山, 063001
*通讯作者, zhangdy@qibebt.ac.cn
摘 要 拟南芥中已有 466个 PPR蛋白，已有研究证实许多 PPR蛋白参与细胞器基因表达的转录后调
节，但大部分 PPR蛋白分子作用机制尚不清楚。Delayed greening 1 (DG1)是定位于叶绿体中的的 PPR蛋
白，研究结果证实该蛋白是通过与 SIG6因子相互作用降低 PEP转录活性从而影响叶绿体早期发育。本研
究利用拟南芥 Dg1基因功能缺陷型突变体研究了 DG1蛋白对光系统蛋白复合体组成及其光转化效率的
影响。77K荧光发射光谱分析发现 dg1突变体幼叶 PSⅡ中电子传递速度明显低于野生型，而成熟叶片与
野生型基本一致；蓝绿温和胶分析结果表明：相对于野生型在 dg1突变体新生叶中 PSⅡ、PSⅠ及其超聚复
合物含量均有不同程度降低；进一步温和胶二向电泳及蛋白免疫印迹分析显示，在 dg1突变体新生叶中，
由叶绿体编码的光系统蛋白复合物组成亚基含量显著降低，而核编码复合物组成亚基含量与野生型相比
没有明显区别。上述实验结果进一步确定了 DG1蛋白是通过调控叶绿体编码基因的表达进而调节光系统
复合物的生物合成与组装，最终影响拟南芥叶绿体早期发育。因此，我们认为 DG1蛋白对于叶绿体发育早
期光合蛋白的合成是必需的。
关键词 拟南芥, DG1,叶绿体发育, PPR蛋白
DG1 Participates in the Photosynthetic Protein Synthesis at the Early Stage
of Chloroplast Development of Arabidopsis
Chen Na 1,3 Wen Zewen 1 Zuo Ran 2 Zhou Cuiyan 2 Hu Jiancheng 1*
1 College of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou, 730020; 2 Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Institute of
BioenergyandBioprocessTechnology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao, 266101; 3TangshanAcademyofAgricultural Sciences,Tangshan, 063001
* Corresponding author, zhangdy@qibebt.ac.cn
DOI: 10.3969/gab.032.000196
Abstract There are at least 466 PPR proteins identified in Arabidopsis, and a number of which are involved in
the regulation of posttranscriptional modification of organelle genes. However, the mechanism of most PPR
proteins remain unclear. Delayed greening 1 (DG1) is one of PPR proteins located in the chloroplast, whose
interaction with SIG6 had been proven to down-regulates the PEP-dependent chloroplast gene transcription and
subsequently affects the early development of the chloroplast. To further investigate the impact of the DG1 on
chloroplast photosystem protein complexes and the light conversion efficiency, we detected the 77K fluorescence
emission spectra in the dg1 mutant and wild-type plant, and discovered that the fluorescence emission spectral
peak which represented PSⅡ electronic transmission speed was obviously decreased in the young leaves of the
dg1 mutant; while there was no significant difference within the mature leaves of the dg1 mutant and wild-type
plant. The blue native page analysis indicated that the amount of PSⅡ , PSⅠ and supercomplex in thylakoid of
young leaves in the dg1 mutant should decrease to varying degrees compared to the wild-type plant; further two
dimensional electrophoresis and western blot analysis s howed that the amount of subunits of photosystem
基金项目：本研究由国家自然基金面上项目(31070217)和兰州大学博士研究生学术新人奖项目“内生真菌与宿主植物互作机
理研究”(2010~2011年)共同资助
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
complexes encoded by chloroplast decreased severely in young leaves of the dg1 mutant while the amount of
nucleus-encoded subunits was similar to the wild-type plants. In conclusion, the above results confirmed that DG1
affected photosystem complex synthesis by regulating the expression of the chloroplast encoded genes, which
eventually influenced the early development of the chloroplasts. Our results suggested that DG1 should be essen-
tial for the synthesis of photosynthetic protein in the early development of chloroplasts in.
Keywords Arabidopsis, Delayed greening 1 (DG1), Development of chloroplast, PPR protein
叶绿体(chloroplast)是植物细胞进行光合作用的
细胞器。叶绿体正常发育对于植物生长和发育至关
重要，叶绿体基因组仅仅包含约一百个基因，而叶绿
体正常功能的运行与维护需要超过 2 000 个蛋白
(Zybailov et al., 2008)。因此叶绿体的正常发育依赖
于核基因和叶绿体基因的协调表达。
在叶绿体发育过程中质体编码基因的转录水平
决定于质体的发育阶段，意味着转录水平的调节对
于叶绿体发育的调节具有重要意义。在高等植物叶
绿体中，有两种 RNA聚合酶：质体编码 RNA聚合酶
(PEPs)和核编码 RNA 聚合酶(NEPs) (Maliga, 1998;
Hajdukiewicz et al., 1997; Hedtke et al., 1997)，PEPs
由 rpoA、rpoB、rpoC1和 rpoC2基因编码的亚基构成，
而 NEPs则由单个亚基组成(Liere and Maliga, 1999)。
这两种 RNA聚合酶负责不同类型叶绿体基因的转
录，PEPs主要转录叶绿体编码的光合相关基因，如
psbA、psbD和 rbcL基因等；NEPs主要负责转录翻译
装置元件的一些基因，例如 rpoB仅由 NEPs转录，另
外有些持家基因可由 PEPs和 NEPs同时转录完成。
因为 NEPs主要转录涉及转录翻译的质体基因，PEPs
则转录光合相关基因，在叶绿体发育过程中光合基
因的正确时空表达依赖于 PEP酶转录活性(Mullet,
1993; Demarsy et al., 2006)，因此，PEPs在叶绿体发
育早期阶段具有重要的作用。
PPR (pentatricopeptide repeats)蛋白是由富含保
守氨基酸残基的 35个氨基酸构成的 PPR基序串联
构成的蛋白家族。在高等植物中普遍存在，在拟南芥
中有 466个 PPR家族成员(Lurin et al., 2004)。其中
大部分 PPR蛋白定位于叶绿体和线粒体，在细胞器
基因表达的转录后调节具有重要作用，如 RNA剪接
(Hashimoto et al., 2003; Meierhoff et al., 2003)、RNA
编辑(Kotera et al., 2005; Okuda et al., 2007; 2009;
2010)、RNA 加工(Fisk et al., 1999)和核糖体的积累
(Williams and Barkan, 2003)。
DG1 (delayed greening 1)是定位于叶绿体中的
PPR蛋白，在拟南芥 dg1突变体中，子叶的绿化延期，
新生叶黄化，虽然叶绿体发育受到延迟，但最终能发
育为成熟叶绿体，这些表型与 sig6突变体一致。通过
酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀等实验证
实该蛋白是通过与 SIG6因子相互作用降低 PEP转
录活性从而影响拟南芥叶绿体的早期发育(Chi et al.,
2008; 2010)。然而，关于此基因是否对叶绿体光系统
蛋白复合物造成影响却未见报道。
本研究中，我们从蛋白水平上深入分析和探讨
了 dg1突变体中叶绿体含量变化及蛋白生化特性，
以期为植物叶绿体基因表达和叶绿体生物合成过程
提供新的资料。
1结果与分析
1.1表型观察及 77K荧光光谱
在正常生长条件下，相比于野生型，dg1突变体
的成熟老叶和新生叶具有明显的不同，新生叶片颜
色呈现淡黄色，成熟老叶的叶片颜色则与野生型相
同(图 1A)。经过一段时间生长后，dg1突变体叶片颜
色全部趋于正常，但是植株总体比野生型小。
然后对 dg1 突变体和野生型各叶龄叶片进行
77K低温发散荧光波谱分析，发现 dg1突变体的成
熟老叶和野生型的光谱曲线没有明显差异，而 dg1突
变体新生叶片在 685 nm荧光峰值有明显的降低，该
峰值为 PSⅡ反应中心荧光发射光谱，而代表 PSⅠ荧
光发射光谱的 725 nm峰值却没有明显差异(图 1B)。
因此，可以看出，DG1蛋白的缺失对 dg1突变体成熟
老叶中 PSⅠ和 PSⅡ的分配和电子传递没有影响，但
对新生叶中的 PSⅡ则造成了显著的影响。
1.2类囊体膜蛋白复合体分析
为了研究 dg1 突变体类囊体膜蛋白复合体变
化，尤其是 PSⅡ蛋白复合体结构，我们利用 BN/SDS-
PAGE分离类囊体蛋白复合体。
经过 BN-PAGE分离 dg1与野生型类囊体膜蛋
白，有 5个色素蛋白复合体被分离并且都经过特异
性抗体免疫杂交分析确定。如图 2A所示，条带Ⅰ为
PSⅠ单体和 PSⅡ多聚体，条带Ⅱ为 PSⅡ单体，条带
Ⅳ为 CP43缺失的 PSⅡ单体，条带Ⅵ为 LCHⅡ的三
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聚体和 LCHⅡ单体。结果表明相对于野生型在 dg1
突变体新生叶中 PSⅡ、PSⅠ及其超聚复合物含量均
有不同程度降低。
为了进一步分析 dg1突变体中类囊体蛋白质复
合物的组成变化，我们进行了双向电泳分析。如图 2B
所示，在 dg1突变体中，复合物各蛋白质亚基可以被
清楚地分开，进一步证实了上述结果。而且，dg1突变
体新叶类囊体膜上的光合蛋白复合体结构都受到不
同程度影响，尤其是 PSⅡ受到影响显著，PSⅡ各亚基
D1、D2、CP43、CP47均有不同程度的降低。
1.3免疫印记分析
为了深入地研究 dg1突变体中光系统蛋白复合
物的变化情况，分别用 PsbO、PsaA、CP47和 CP43特
异性识别抗体对 dg1突变体内囊体中相关蛋白进行
免疫印记定量分析，结果显示(图 3)，在 dg1 突变体
新生叶中，由叶绿体编码的光系统蛋白复合物组成
亚基含量都有显著降低。
2讨论
叶绿体包含可以自主性复制的遗传基因组
DNA，其中大部分蛋白都是由核基因编码，其余蛋白
则由叶绿体 DNA编码并通过叶绿体转录翻译机制合
成。由于光合作用发生在叶绿体内，因而全面了解和
探究叶绿体的生成机制及对光合作用的影响，对今后
深入研究和充分发挥叶绿体功能具有重要意义。
通过对 PPR蛋白相关基因突变体的研究，发现
已知的多数 PPR蛋白对参与叶绿体基因表达的转录
后调节具有重要作用。拟南芥 At5g67570基因编码
DG1蛋白，这是一种 PPR蛋白。已有研究从转录水
平上证明，该蛋白主要作用方式为通过结合 SIG6因
图 1 dg1 突变体与野生型的表型及 77K荧光发射光谱曲线
注: A: dg1 突变体与野生型的表型; B: dg1 突变体与野生型
77K荧光光谱曲线
Figure 1 Phenotypes and 77K fluorescence emission spectra of
the dg1 mutant and wild-type (WT) plants
Note: A: Phenotypes of dg1 mutant and wild-type; B: 77K fluo-
rescence emissionspectra curve of dg1 mutant and wild-type
plant
图 2类囊体膜蛋白复合物及亚基分析
注: A:类囊体蛋白的蓝绿温和胶实验; B: dg1突变体与野生型
植物类囊体膜蛋白的 BN胶第二向电泳
Figure 2 Analysis of thylakoid membrane proteins
Note: A: Blue native gel analysis of thylakoid membrane pro-
teins; B: SDS-PAGE analysis follow the blue native gel of photo-
synthesis protein in dg1 mutant and wild-type (WT) plants
图 3野生型与 dg1突变体的类囊体膜相关光合蛋白分析
Figure 3 Western blotting analysis of thylakoid membrane pro-
teins in wild-type and dg1 mutant
拟南芥 DG1参与叶绿体早期光合蛋白合成功能
DG1 Participates in Photosynthetic Protein Synthesis at Early Stage of Chloroplast Development of Arabidopsis
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
子参与叶绿体早期的合成过程。本研究中，我们从蛋
白水平上深入分析和探讨了 DG1蛋白的缺失对叶
绿体的影响。
在正常生长条件下，对 dg1突变体与野生型的
表型进行了观察。结果显示，相比于野生型，dg1突变
体的成熟老叶和新叶具有明显的不同，新生叶片颜
色呈现淡黄色，成熟老叶的叶片颜色则与野生型相
同，表明 DG1蛋白参与了叶绿体早期的发育。
随后对 dg1 突变体和野生型各叶龄叶片进行
77K低温发散荧光波谱测定和分析。77K荧光光谱
能够反映光吸收能量在 PSⅠ和 PSⅡ之间的分配关
系。其发射峰值 F686和 F734分别为 PSⅡ和 PSⅠ的特
征峰。F686/F734比值可以反映能量在 PSⅡ和 PSⅠ之
间电子传递效率。结果发现 dg1突变体幼叶 PSⅡ中
电子传递速度明显低于野生型，而成熟叶片与野生
型基本一致，因此可以看出 DG1蛋白的缺失对新叶
的 PSⅡ能量分配和电子传递造成了显著的影响。
研究表明光系统膜蛋白在叶绿体的生物发生和
结构稳定方面起着异常重要的作用。为了研究 dg1
突变体中类囊体膜蛋白复合体特结构是否发生变
化，我们使用 BN/SDS-PAGE分离类囊体蛋白复合
体，结果表明(图 2A)，相对于野生型，dg1突变体新生
叶中 PSⅡ、PSⅠ及其超聚复合物含量均有不同程度
降低。随后我们进一步进行了温和胶二向电泳及蛋
白免疫印迹分析，发现在 dg1突变体新生叶中，由叶
绿体编码的光系统蛋白复合物组成亚基含量显著降
低，而核编码复合物组成亚基含量与野生型相比没
有明显区别(图 2B;图 2C)。
通过本研究，我们进一步确定了 DG1蛋白是通
过调控叶绿体编码蛋白的表达进而影响光系统蛋白
复合物的生物合成与组装，从而调节叶绿体早期发
育。因此，我们认为 DG1蛋白对于叶绿体发育早期
光合蛋白的合成是必需的。
3材料与方法
3.1实验材料
实验材料为拟南芥(Arabidopsis thaliana) dg1突
变体及其野生型(WT) (Columbia type)。
3.2拟南芥材料的培养
拟南芥种子置于 EP管中，在超净工作台下，1%
的次氯酸钠消毒 5 min，再用 70%的乙醇漂洗 1 min，
然后用灭菌 ddH2O 漂洗 4 遍，均匀地将种子撒在
1/2MS培养基平板上。于 4℃春化 2 d，在光照培养箱
中萌发，待长出 2片真叶后移栽到土壤中。植株置于
短日照(14 h光照 /10 h黑暗)光照环境下生长，温度
为 22℃，光照强度 100 μmol·s-1·m-2。
3.3 77K荧光光谱的测定
同时播种 dg1突变体和野生型拟南芥 Columbia
(Col-0)进行直观表型观察。待叶片长到合适大小时，
将类囊体膜按照叶绿素浓度定量为 5 mg/mL (含
50%甘油)，然后进行荧光激发光谱(685 nm, 695 nm,
730 nm)测定，在波长 650~780 nm 区间每隔 0.1 nm
进行读数；然后将数据导入 origin，进行曲线的拟合。
3.4蓝绿温和胶与双向电泳分析
分别提取 dg1突变体与野生型拟南芥的类囊体
膜，按李贝贝等(2003)进行蓝绿温和胶(blue-native
gel, BN gel)实验。
SDS双向电泳：将经过第一向蓝绿温和胶电泳
后各上样孔的胶条切下，SDS样品缓冲液(8 mol/L尿
素 , 5% SDS, 20%甘油 , 10%巯基乙醇 , 50 mmol/L
Tris-HCl, pH 6.8)室温下处理 30 min，进行第二向电
泳，电泳结束后，考马斯亮蓝 R250染色。
3.5免疫印记实验
SDS-PAGE主要采用 Laemmli (1970)系统。电泳
在恒流 10 mA进行，在溴酚蓝跑出胶条时停止，电泳
后利用垂直电泳槽进行转膜。用封闭液封闭，加入相
应蛋白抗体，过夜。TTBS洗涤后，加入二抗。超敏化
学发光的操作按照试剂操作手册进行。
作者贡献
陈娜负责突变体鉴定及培养；温泽文负责实验
的结果分析及写作，左然和周翠艳参与实验研究的
执行及部分实验结果的分析，胡建成负责研究实验
思路的设计。
致谢
本研究由国家自然基金面上项目(31070217)和
兰州大学博士研究生学术新人奖项目“内生真菌与
宿主植物互作机理研究”(2010~2011年)资助。
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