全 文 ：
第 37 卷第 3 期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.37 No.3
2011 年 6 月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Jun．2011
DOI:10.3724/SP.J.1238.2011.00248
拟南芥 CBF1 基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化
刘凯 1,2，胡春华 1，魏岳荣 1，易干军 1*，邵秀红 1
(1.广东省农业科学院 果树研究所，广东 广州 510640；2.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128 )

摘 要：从拟南芥中克隆 CBF1 基因，转入到植物表达载体 pBI121 的 XbaI 和 SacI 位点，得到中间重组质粒
pBI121-CBF1，用 EcoRI 和 HindⅢ将 35S 启动子与 CBF1 基因从 pBI121-CBF1 切下，转入到植物表达载体
pCAMBIA1301 中，构建植物表达载体 p1301-CBF1。将构建的植物表达载体转入农杆菌 EHA105，采用农杆菌介
导法转化野生蕉胚性悬浮细胞，经 GUS 组织化学染色和 PCR 鉴定，证明 CBF1 基因已转入野生蕉中。
关 键 词：拟南芥；CBF1 基因；野生蕉；遗传转化；胚性悬浮细胞
中图分类号：Q785 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2011)03−0248−05

Construction of plant expression vector containing CBF1
and its genetic transformation in wild banana
LIU Kai1,2, HU Chun-hua1, WEI Yue-rong1, YI Gan-jun1*, SHAO Xiu-hong1
(1.Fruit Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Science, Guangzhou 510640, China; 2.College of
Horticulture and Landscape，Hunan Agricultural University, Changsha410128, China)

Abstract: The CBF1 gene(CRT/DRE binding factor 1) was obtained from Arabidopsis thaliana by PCR and cloned into
pMD18-T. Then CBF1 gene was sub-cloned into pBI121 vector to abtain the middle recombinant plasmid pBI121-CBF1
via XbaⅠand Sac I restriction enzyme sites. After that, the fragments containing 35S-CBF1 were digested from
recombinant plasmid pBI121-CBF1 by EcoR I and Hind III, and directionally linked to the plant expression vector
pCAMBIA1301 to get the plant expression vector p1301-CBF1. We transformed the embryogenic cell suspensions of
wild banana(Musa intinerans Cheesm) with p1301-CBF1 via Agrobacterium-mediated transformation. Results from
histochemical GUS assay and PCR suggested that CBF1 gene has been transferred into the wild banana.
Key words: Arabidopsis thaliana; CBF1 gene; wild banana; genetic transformation; embryogenic cell suspensions(ECS)


收稿日期：2010−11−22
基金项目：国家自然科学基金项目(31000903)；广东省自然科学基金项目(10451064001006326)；广东省农业科学院院长基金项目(20090104)
作者简介：刘凯(1982—)，男，江西宁都人，博士研究生，主要从事果树分子育种研究，胡春华为并列第一作者；*通信作者，yiganjun@163.com
寒害给香蕉生产造成巨大的经济损失，培育抗
寒优质品种成为香蕉育种的一个重要目标。由于多
数香蕉栽培种是三倍体，具有高度不育特性，常规
育种难以培育抗寒优质品种，而利用组织培养并结
合基因工程技术有望实现这一目标。近年来，利用
转基因技术改良植物性状已取得较多成果[1−4]。CBF1
是从拟南芥中克隆得到的抗寒基因[5]。已有研究[6−7]
表明，CBF 家族基因在植物抗寒、抗旱及抗盐碱方
面起着重要作用，在拟南芥中过量表达 CBF1 或
CBF3 基因，其抗寒性大大提高[8−9]；将 CBF1 基因
转入草莓[10]和番茄[11]，转基因植物对低温胁迫的抵
抗力明显增强。笔者克隆了拟南芥的 CBF1 基因，
并采用农杆菌介导法将其转入野生蕉中，旨在获得
高效的遗传转化体系及再生植株，通过分析转基因
野生蕉的抗寒性，为进一步将抗寒基因转入香蕉栽
培品种提供技术参考。


第 37 卷第 3 期 刘凯等 拟南芥 CBF1 基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化 249
1 材料与方法
1.1 材 料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子、野生
蕉(Musa intinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系、农杆
菌 EHA105、植物表达载体 pBI121 以及 pCAMBIA
1301 等，均为广东省热带亚热带果树研究重点实验
室保存；克隆质粒 pMD18−T、各种限制性酶购于
Takara 公司。
1.2 方 法
1.2.1 抗寒基因 CBF1 的克隆
根据 GenBank 公布的拟南芥 CBF1 序列设计
引物：5′-gactctagaatgaactcattttcagc-3′和 5′-cggagctctt
agtaactccaaagcgac-3′，其中上游引物引入 XbaⅠ内切
酶位点并加保护性碱基，下游引物引入内切酶 SacⅠ
位点并加保护性碱基，以拟南芥 DNA 为模板进行
PCR 扩增，获得的目的片段经回收后克隆到载体
pMD18−T 上，筛选阳性克隆提取质粒，质粒样品
送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.2 植物表达载体 p1301−CBF1 的构建
利用限制性酶SacⅠ和XbaⅠ从pMD18-T载体上
切下CBF1基因，将其克隆到植物表达载体pBI121的
XbaⅠ和SacⅠ位点。重组质粒用PCR和双酶切进行鉴
定，鉴定正确的质粒重命名为pBI121-CBF1。再利用
限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ完全双酶切pBI121-CBF1，
回收双酶切小片段(35S−CBF1−NOSt)，并将其克隆
到经过相同酶切的pCAMBIA 1301上，转化大肠杆菌
DH5α 感受态，提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴
定，将经过鉴定的重组子命名为p1301−CBF1。
1.2.3 工程菌的制备、转化、筛选和植株再生
采用液氮冻融法[12]，将质粒p1301−CBF1转化到
农杆菌EHA105中。挑阳性单克隆农杆菌在含有50
mg/L Kan的LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇菌
过夜。菌液6 000 r/min 离心5 min，用新鲜LB (含有
相同的抗生素浓度)重新悬浮，调节OD600约为0.2，
以相同的条件摇菌至OD600约为0.6~0.8。6 000 r/min
离心10 min，收集菌体，用新鲜的M2培养基[13]重新
悬浮菌体，调整OD600约为0.2，并加入乙酰丁香酮(AS)
至终浓度100 µmol/L, 作为工程菌用于转化。
取50 mg继代7 d的野生蕉胚性悬浮细胞，加入
到10 mL已制备的农杆菌中浸染30 min。液体共培
养 [14]后，用M2清除多余的农杆菌，再转入液体
筛选培养基M2(含有300 mg/L的头孢菌素和20
mg/L的潮霉素)中。每2周继代1次，1个月后转入到
含有相同浓度的筛选剂和抗生素的M3培养基[13]中
进行胚诱导。胚成熟后，将胚转入含有抗生素，筛
选剂的终浓度适当降低的M4[13]中诱导胚的萌发。
萌发后的植株转入RM[13]中生根，获得完整植株，
即为拟转基因植株，利用PCR进行分子鉴定。
1.2.4 转化组织的 GUS 分析及 PCR 验证
以共培养3 d的悬浮细胞和潮霉素抗性成熟胚
为材料，用无菌水清洗干净后，加入一定量的磷酸
缓冲液(含10 mmoL/L的EDTA，1%TritonX−100)，
1%DMSO和0.5 mg/L的X−Gluc反应底物。混合均匀
后，37 ℃水浴处理4 h以上至过夜。以没有转化的
悬浮系作为对照。
利用CTAB法 [15]提取转化野生蕉叶片基因组
DNA，以CBF1基因的特异引物分别对叶片基因组
DNA及阳性对照质粒p1301−CBF1 DNA进行PCR扩
增。PCR反应体系(20 µL)：双蒸水14.1 µL，10 ×Buffer
2.0 µL，dNTP (10 µmol/L) 0.8 µL，引物(10 µmol/L)
各0.8 µL；DNA 1 µL (约40 ng)；Taq酶0.5 µL (1 U)。
PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，
55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环，最
后72 ℃终延伸10 min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶
上电泳分析。
2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆
利用设计的引物，以拟南芥DNA为模板的PCR
扩增，得到1条约660 bp的扩增条带 (图1)，与预期
的 大 小 一 致 ， 序 列 与 GenBank 中 登 录 的 拟 南 芥
CBF1(NM_118681)基因同源性为100%，所获得的
基因即为CBF1基因。


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M 100 bp DNA 分子量标记；1~4 CBF1 基因。
图 1 CBF1 基因的 PCR 扩增片段
Fig.1 PCR of the CBF1 with the specific primers
2.2 拟南芥 CBF1 基因植物表达载体
利用酶切获得的 CBF1 基因克隆到 pBI121 的
XbaI 和 SacI 位点，转化大肠杆菌感受态 DH5α，挑
阳性菌落摇菌提取质粒，经双酶切鉴定，可以释放
出 1 条约 660 bp 的条带(图 2)。重组质粒即为植物
表达载体 pBI121−CBF1。

M 100 bp DNA 分子量标记；1~3 pBI121−CBF1 质粒 SacI 和 XbaI
双酶切。
图 2 SacⅠ和 XbaⅠ对质粒 pBI121−CBF1 的双酶切电泳结果
Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pBI121−CBF1 with digestion
利用 EcoRI 和 Hind III 对质粒 pBI121−CBF1 进
行完全双酶切，将 35S 启动子与 CBF1 一起切下，
片段大小为 1 800 bp 左右，符合预期(图 3)。

M 100 bp DNA 分子量标记; 1~3 EcoRI 和 HindⅢ对
质粒 pBI121−CBF1 的双酶切。
图 3 EcoRI 和 Hind Ⅲ对质粒 pBI121−CBF1 的双酶
切电泳结果
Fig .3 Identification of recombinant plasmid pBI121−CBF1 with digestion
将 1 800 bp 左右片断克隆至 pCAMBIA1301 的
EcoRI 和 Hind III 酶切位点，酶切鉴定后，获得了
大小一致的片段(图 4)，证明植物表达载体 p1301
−CBF1 构建成功。

M 100 bp DNA 分子量标记；1~2 质粒 p1301−CBF1；
3~4 EcoR I 和 HindⅢ对质粒 p1301−CBF1 的双酶切。
图 4 EcoR I 和 Hind Ⅲ对质粒 p1301−CBF1 的双酶切电泳
Fig.4 Identification of recombinant plasmid p1301−CBF1 with digestion
2.3 抗性植株的获得及组织 GUS 分析
野生蕉胚性悬浮细胞在 10 mL 的农杆菌悬浮液
中浸染 30 min 后转入共培养，共培养至第 3 天后，
取少量进行 GUS 染色(图 5−A)。结果表明，共培养
3 d 后的大部分胚性悬浮细胞 GUS 染色后呈阳性，
初步表明 CBF1 基因已转入到胚性悬浮细胞中。转
入液体筛选 4 周后，再转入 M3 固体培养基中诱导
胚的形成，约 2 个月左右可得到成熟的潮霉素抗性


A B

C D
A 转化ECS的GUS基因瞬间表达；B 成熟抗性胚的GUS染色；
C 抗性胚的萌发；D 完整的转基因苗。
图 5 转化 ECS、抗性胚的 GUS 染色以及转基因苗的再生
Fig.5 GUS gene expression in transformed ECS and mature resistance
embryos and regeneration of transgenic plants
M 1 2 3 4
2 000 bp
M 1 2 3
2 000 bp
500 bp
M 1 2 3
M 1 2 3 4
500 bp


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体胚，对部分胚进行 GUS 染色分析，发现均为阳
性转化(图 5−B)。将得到的抗性胚转入到 M4 固体
培养基中，1 个月左右体胚萌发成植株(图 5−C)，再
将萌发的植株转入到生根培养基中，4 周左右获得
了 18 株完整的再生抗性苗(图 5−D)。
2.4 转基因野生蕉的分子鉴定
为了进一步验证 CBF1 基因在野生蕉基因组中
的整合情况，提取具有 GUS 活性的转基因野生蕉
叶片 DNA，用 CBF1 基因特异引物进行 PCR 检测。
结果发现，转化苗 DNA 均可扩增出 660 bp 左右
的目的条带，而对照则无扩增(图 6)，说明外源基因
已整合到野生蕉基因组中。

M 100 bp DNA marker；1 质粒p1301−CBF的PCR扩增；
2 非转基因植株的PCR扩增；3~8 转基因植株的PCR扩增。
图 6 部分转基因植株的 PCR 检测
Fig.6 Detection of some transgenic plants by PCR
3 讨 论
CBF1 基因是 Stockinger 等[5]在研究拟南芥低温
驯化期间调节 COR 基因表达的分子机理时发现的，
其编码产物能识别 COR 基因启动子区的 CRT/ DRE
元件并与之结合，以后又陆续发现了 CBF 家族基因
的其他基因 CBF2 和 CBF3[6]、CBF4[7]、CBF5 和
CBF6[16]。研究表明，CBF 家族基因在调节植物抗
寒性方面起着“总开关”的作用。CBF 转录激活因子
的过表达能引起许多生理生化反应，包括编码产生
LEA 蛋白或亲水多肽、脯氨酸和多种可溶性糖类的
合成积累，这些物质已被证明对植物的低温耐性起
重要作用。拟南芥 CBFs 基因转化到烟草[17−18]、小
麦[19]、水稻[20]等农作物，这些作物的抗寒性得到较
大的改善。笔者构建的组成型表达载体，目的是使
CBF1 基因在植物体内过表达，GUS 染色证明了
CBF1 基因已转入到野生蕉内。表达量的高低有待
于进一步的分析。
获得的植物表达载体 pBI121−CBF1 本可以直接
转化农杆菌介导转化胚性悬浮细胞，但由于该载体
上的 GUS 报告基因被 XbaⅠ和 SacⅠ切除，不利于转
化过程中的验证，只有在获得植株后通过分子鉴定
方知是否为转化植株；因此，笔者以 pBI121−CBF1
作为中间载体，结合质粒 pCAMBIA1301 作进一步
的改进，构建了一个既含 GUS 报告基因，又有潮霉
素抗性基因的植物表达载体 p1301−CBF1，已获得了
较理想的转化效果，不仅提高了转基因植株的阳性
筛选率，且减少了分子验证的工作量。
野生蕉与香蕉栽培品种相比，具有较好的耐寒
性，但是持续低温也会对野生蕉造成伤害。本研究
已获得转 CBF1 基因野生蕉，转基因野生蕉与非转
基因野生蕉的耐寒性是否有明显的差异，后续工作
将进行验证。
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责任编辑：罗慧敏