全 文 ：文章编号:1000-1573(2006)01-0054-05
拟南芥感染灰霉病菌后差异表达基因分析
邢继红 , 　翁巧云 , 　董金皋
(河北农业大学 真菌毒素实验室 , 河北 保定 071001)
摘要:利用 SSH(抑制性消减杂交)技术 , 对接种灰霉病菌后不同拟南芥生态型差异表达的基因进行了分析 ,对
SSH 产物条带进行回收和二次扩增 , 得到 6 个差异表达条带。经反式 Northern 杂交检测均为阳性片段。对其进
行克隆 、序列测定 , 获得了 7 个差异表达的序列。同源性分析表明 , 它们与转录 、膜内外物质转移 、蛋白合成 、信
号传递等生命活动相关的基因有一定的同源性 , 其中 1 个片段的序列与拟南芥乙烯信号传递途径有关 , 推测其
可能关联到拟南芥对病菌的抗性。对这些基因片段进行深入的分析和功能研究 ,将会对拟南芥与灰霉病菌互作
的分子机理有更进一步的认识。
关　键　词:拟南芥;生态型;灰霉病菌;基因表达
中图分类号:S 432.1　　　　　　　　文献标识码:A
Analysis on differential expression genes of Arabidopsis
infected by Botrytis cinerea
XING Ji-hong , WENGQiao-yun , DONG Jin-gao
(Mycotoxin Lab., Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:SSH technology w as utilized to study the differential expression genes in dif ferent Ara-
bidopsis eco types after being infected by Botryt is cinerea , 6 differentially expressed cDNA frag-
ments w ere found af ter recovery cDNA in agarose gel bands and secondary PCR amplification of SSH
production.These fragments were detected by reverse Northern blot ting and 6 fragments w ere
show n to be posi tive dif ferential fragments.Seven dif ferential expression sequences were found af ter
being cloned then sequenced , and they w ere homolog to genes related to reverse transcription , sub-
stance t ransmission in cell membrane , protein synthesis and signal t ransduct ion.Among them , one
sequence might relate to ethylene signal t ransduction in Arabidopsis.We speculated that this se-
quence might relate to disease-resistance of Arabidopsis to B .cinerea.All these results will give
us better understanding to the molecular interaction between Arabidopsis ecotypes and Botry tis
cinerea.
Key words:Arabidopsis thaliana;ecotype;Botrytis cinerea;gene expression
　　研究发现 ,拟南芥的不同生态型对不同病原菌
的反应有所不同 ,如:拟南芥 Columbia(Col)生态型
对丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)表现抗
病 ,而 Nd -0 、Wu -0 生态型却对该病菌表现感
病[ 1 , 2] ;Col生态型对马铃薯晚疫病菌(Phy tophthora
infestans)表现抗病 ,而 Est -1 、Bay-0 生态型对马
收稿日期:2005-09-13
基金项目:河北农业大学“ 9816”科技重点项目资助
作者简介:邢继红(1977-), 女 ,河北东光人 , 博士 ,从事分子植物病理学研究.
通讯作者:董金皋(1963-), 男 ,河北邢台人 , 教授 ,博士生导师.E-mail:shmdjg@mail.hebau.edu.
第 29卷第 1期
2 0 0 6年 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 Vol.29 No.1
Jan .2 0 0 6
铃薯晚疫病菌表现感病[ 3] 。灰霉病菌(Botryt is
cinerea)是一种寄主范围较广的兼性寄生菌 ,能侵染
多种农作物 。笔者在前期研究中发现 ,灰霉病菌可
以侵染拟南芥 ,且不同拟南芥的生态型被灰霉病菌
侵染后表现的症状也不尽相同 ,如:Col生态型表现
免疫症状 ,Ws-0 生态型表现过敏性坏死症状 ,而
Ler生态型表现为明显的感病症状。推测可能是由
于不同生态型对病原菌互作的分子机制不同导致了
症状的差异 ,但缺乏足够证据 。基于此 ,本试验以接
种灰霉病菌后不同时间的拟南芥 Col 、Ws-0和 Ler
生态型为材料 ,应用抑制性消减杂交(suppression
subtract ive hybridization ,简称SSH)技术研究拟南芥
与灰霉病菌互作后的基因差异表达 ,为研究互作机
理和进一步克隆抗病相关基因奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料处理
选取拟南芥抗灰霉病生态型 Col、Ws-0 和感
灰霉病生态型 Ler的 4周龄植株 ,用微量移液器在
叶片上接种 ,每叶片接种灰霉病菌 5 μL(4×106 ～ 8
×106 个/mL)孢子悬浮液 ,接种后将植株置于 23℃
光照培养室内保湿培养(每天 8 h光照 ,16 h黑暗),
以不接种的为空白对照 ,分别在接种后 3 、6 、12 、24 、
36 、48 、72 h和 96 h与不接种样品同时取样 ,样品装
入 1.5 mL 离心管中 ,置于-80℃冰箱中保存备用。
1.2　拟南芥mRNA的提取和抑制性消减杂交
将-80℃冰箱中保存的样品根据 RNeasy plant
mini试剂盒(Qiagen)提取总 RNA 。用 QIAGEN 的
Oligo tex mRNA Mini试剂盒从总 RNA中分离 mR-
NA。本试验以接种处理的拟南芥的 mRNA 作为
tester ,以未接种的拟南芥的 mRNA 作为 driver;同
时以接种处理的抗病生态型 Col 的 mRNA 作为
tester ,而接种处理的感病生态型 Ler的 mRNA作为
driver 。应用PCR-selectTM cDNA Subtraction Clon-
tech试剂盒进行抑制性扣除杂交 。采用 Agarose Gel
DNA Purif icat ion(TaKaRa)试剂盒进行 SSH 产物的
琼脂糖凝胶回收。将回收片段进行二次扩增 ,利用
1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。应用 DIG DNA La-
beling and Detection(Roche)试剂盒进行差异片段的
反式 Northern杂交检测。
1.3　差别表达序列片段的克隆 、测序及同源性分析
取 SSH 差异片段的二次 PCR产物 3 μL ,连接
到 pMD18-T 载体上 , 16℃过夜。第 2 天 ,取连接
产物 5μL 转化感受态 DH5α上 ,在涂有 IPTG/X-
gal的含氨苄的 LB平板上 ,37℃避光恒温培养 12 ～
16 h ,出现大量小白斑后放于 4℃冰箱使菌落显色 ,
挑取白色克隆进行克隆片段的 PCR检测。经上海
生工用 ABI PRISM 377 DNA Sequencer-E 测序仪
对含有目的 DNA 片段的质粒进行测序 。利用
BLAST 软件对该片段与 GenBank 中的已知基因进
行功能和结构上的同源性分析。
2　结果与分析
2.1　抑制性消减杂交分析
经测定拟南芥总 RNA在 260 nm 和 280 nm 的
吸光度值 ,发现 OD260/OD280的比值为 1.8 ～ 2.0 ,说
明总 RNA纯度较高 。用琼脂糖凝胶电泳法检测总
RNA的完整性 ,28S 条带的亮度约为 18S 条带的 2
倍 ,表明 RNA 的完整性良好 ,可用于后续试验。
mRNA完整性和大小也通过琼脂糖凝胶电泳检测 ,
呈现弥散条带 ,表明纯化效果良好 ,可用于 cDNA合
成 。抑制差减杂交后 ,取第二次 PCR产物 8 μL ,用
2.0%琼脂糖电泳分析差减杂交是否成功 。从图 1A
可知第一次 PCR产物为弥散条带(smear),其上没
有明显条带 。而第二次 PCR产物呈现清晰的条带
(图 1B),表明差减杂交后 tester 和 driver 的一些共
有 cDNA片段己被扣除掉 。
将差异片段回收后进行二次扩增 ,通过琼脂糖
电泳检测 ,Ws-0 、Ler 和 Col/Ler 的二次扩增可以
得到较清晰的单一条带(图 1C),且分子量大小与回
收前均一一对应 ,说明差异片段回收技术和二次扩
增条件较为适宜 ,所得的二次扩增产物可以进行下
一步试验 。Col 生态型的二次扩增产物呈弥散现
象 ,试验对差异片段进行再次回收 ,通过调整退火温
度 、延伸时间等扩增条件 ,减少非特异的扩增条带。
将接种后的 3个生态型的 cDNA制备探针 ,分
别与其回收片段的二次扩增产物进行反式 Northern
杂交 ,发现所得的差异片段均为阳性片段 ,阳性率为
100%(图 1D)。下一步试验将对这些差别表达片段
进行克隆 、测序及序列分析 。试验通过 PCR扩增检
测克隆片段 ,结果如图 1E ,所有的样品均能获得目
的条带 ,说明转化成功 ,可以用于测序 。
55　第 1期　 邢继红等:拟南芥感染灰霉病菌后差异表达基因分析
A.SSH 的第一次 PCR扩增;B.SSH 的第二次 PCR扩增;C.SSH 产物的二次扩增;D.反式 Northern杂交结果;
E.克隆片段的 PCR检测;Col/ Ler.Col为 Tester , Ler为 Driver.
图 1　拟南芥不同生态型与灰霉病菌互作的基因表达差异
Fig.1　Differential Expression of interaction between Arabidopsis ecotypes and Botrytis cinerea
2.2　差异表达片段的测序结果
　对含有插入片段的质粒 DNA进行测序 ,结果如下。
Ws-0(515 bp):
TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTGTTGAGCCTTCTACGCTCTCGAGCGTACTAAACGAC
GCGCTGTCACCTGAGATCGGTGCTCAAGTACTTCGCGAGTA TCGCTCTCGCAAGTAAG
CGCGCGGCTCAAAGGCCGCCGCAAAGAAAGTTCAGGTCCCCACCGCAGAACATCCAG
CTGGTAGTGCTGCGACAGAGATTCCAAATCCTGTACAGCTCCAG TTGAACGCTGCTGA
TCCTGCCGGCCT TGGGTGAAGACTGATGCCTGCGAAGGGTGCAACCCGAGGCGCACTG
AACTGAATGG TCAGGACTCCATTTCCAGGGTTGTAGTTGACTATCGCT TTTGCCGCATG
GGCGG TTGTCGCTAGCATCTCA TCGGACAGCCGCGGGTAGCGGCGGTCCTTCTGCATC
GCGACCTCAACAAAGGCCTGAACAGGCCTCACCGCTTCGAGGGCGCGTGCTACTCTTT
CCTTGCGT TGATGCTCGAGGTACAGAGGCCCACCTCGGCCGCGACCACGCT
Col-1(160 bp):
TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCAAGAACCTCTACTCGCTCGACCCTATAGTGGG TCG
TATTAGGCCCTA TAGTGAG TCGTATTAACCTCGGCCGCGACCACGCTACCCTATAGAC
CTCGGCCGCGACCACGCT TCCCTATAGACCTCGGCCGCGACCAC
Col-2(227 bp):
TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCAAGAACCTCTACTCGCTCGACCCTATAGTGAGTCG
TATTAGGCCCTA TAGTGAG TCGTATTAGGCCCTATAG TGAGTCGTAT TAGGCCCTATAG
TGAG TCGTATTAGACCCTATAG TGAGTCGTAT TAGACCCTATAGTGAGTCGTATTAGGC
CCTATAGTGAGTCGTATTAGGCCCTATAGTGACCTCGGCCGCGACCACGCT
Col-3(496 bp):
AGCGTGGTCGCGGCCGAGGTGCCGGCGGAGCACGACTACGACTACGAAGATGATCCCG
AGCCGCAGGCCGGCCCCGGAATGGCGCGTTGAACTGAGAAGCGGTAGTGCGCAT TCCT
TCTAAGCCAGCGCCCGGCA TGGTCCTCAGCTAT TCCTACCCCTGGTATAGGGAAAAGGA
AGAAGGGGAGACCGATGGGCGCAAGGATCGGCCCGCAACCGTCGTACTCGTGGCGAA
CCGATTGGGATTCGGCGATG TCGTTTACGT TCTGCCGATCACGACCAGCGAGCCAGCAT
CGGACGATCCTTGGAAGATAGAAATTCCGCGATCCATCAAAGAACGGATTGGACTTGAT
GAGCAGCGACCATGGATCGACGTCACCGAGTTCAACATTTTT TCGTGGACCGGATATCA
CCTTCGCGCCACCAAGAAACCGTACGGCAAAGCAAACAGCGAGCAGGAGACTTGCCTCT
ACGGATACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA
Ler(470 bp):
AGCGTGGTCGCGGCCGAGGTTCTCCGCGCCGGGAT TACCTAAGCCGATGACCAGCCAT
GGAGTCACTCCTGCGGGGAAAGTAGGCATGGCATTCGCAGACTCGGAAGCCGGAGTA
56　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 29卷
GAAGTAGAACCAGCGCCGAAAATGCGGGAGATGAAATCCTTGAGTG TAGCCACGAGC
TCTAGTG TGGCACAGGCCTGCT TCGCCCAGGAAAAGGCAAGCGTGT TTTAGGACTGGA
TGAGCTGTTCTGCTGCGTCGCTTGCGTCGGCACAAAGAATCGCAACATCCGCGGCGGC
CGAGGAGGCAAACGGCTTGAGGACGTAGGCGGCCGGATCCATGCGGCCAGGTGGGCG
GCCGATTCCGCAGGACAAACGGTAGTAGTCCTTGGTGCCCAGGGCCT TGGTGATGGAC
T TCAGGCCGTTGTGTCCCTTGTCCCCGCCACCACT TTTCAGTCGCACCTGCCCGGGCGG
CCGCTCGA
Col/ Ler(359 bp):
AGCGTGGTCGCGGCCGATGTCAGACTGGGCGTGCGCGAGACGCCGCTGGCCACATCCT
TCTGCGCCCATGCCCTGCTGCTGGAAGACGGAATGCAGGTGCCGGACGCCACGGTGGA
CCCAAGG TTCGAATGCAATCCCTTGGTGACGGGCGACACCCATCTGCGG TCCTACGCC
GGACAGTTGCTGAAGACCCAGGACGGTCTGCCGCTGGGCACCCTGTGCGTGCTGGACA
CCCAGACCCGGCCTGAGGGGCTGACCGAGGTTCAGGTCATGGCGCTGAGAACCCTGGC
TGGGCAGGTGATGACCCAGCTGGAGCTGCGCCGCACCCTGATCCAGCACCTGCCCGGG
CGGCCGCTCGA
2.3　差异表达序列的同源性分析结果
经 BLASTX和 BLASTP 软件与 GenBank 中的
已知序列进行同源性分析。结果发现 ,Ws-0(515
bp)序列与奇 球菌(Deinococcus geothermalis)的调
节蛋白 、外周质结合蛋白或转录调节因子(regulato-
ry protein , LacI:Periplasmic binding pro tein/LacI
transcriptional regulator)有 54%的同源性 ,与 Ex-
ophiala dermati tidis的转录因子(transcriptional fac-
tor)有 33%的同源性;Col -3-1(372 bp)与果蝇
(Drosophila melanogaster)的依赖于 ATP 的 RNA
解旋酶有 26%的同源性 ,与嗜极细菌(Kineococcus
radiotolerans)的乙酰基转移酶(Acetylt ransferases)
和ABC多种药物转移系统 、ATP 酶和通透酶成分
(ABC - type multidrug t ranspo rt sy stem , ATPase
and permease components)的同源性分别为 36%和
37%;Col-3-2(496 bp)与深红红螺菌(Rhodospir-
il lum rubrum)的一种假定蛋白 Rrub02002313 有
35%的同源性;Ler(470 bp)序列与谷氨酸棒状杆菌
(Corynebacterium glutam icum)和嗜极细菌(Kineo-
coccus radiotolerans)的肽酰 tRNA 水解酶(peptidyl
-tRNA hydrolase)有 63%和 60%的同源性;Col/
Ler(359 bp)含有 GAF 保守区域 ,与一种可制造磁
铁微粒的细菌(Magnetospiril lum magnetotacticum
MS-1)的 GAF 区域有 69%的同源性 ,与 Xan-
thomonas campestris pv. campestris str.ATCC
33913的组氨酸激酶传感器(sensor histidine kinase)
有 71%的同源性;而 Col-1(160 bp)和 Col-2(227
bp)序列与已知的序列没有同源性 ,可能为新基因 。
3　讨论
抑制性消减杂交(SSH)技术是一种高效的差异
克隆技术 ,它不仅克服了差异显示(Differential Dis-
play ,DD)技术假阳性率高和表达性差异显示分析
(Representational Difference Analysis , RDA)技术消
减杂交轮次较多的缺点 ,而且由于 SSH 技术中采用
了均等化和富集目标基因片段的方法 ,也保证了低
丰度 mRNA 的检出[ 4] ,在第一轮杂交即可使稀有基
因富集 1 000倍[ 5] ,具有假阳性低 、高敏感性 、差异
基因分离速度快等特点[ 6] ,是目前大批量研究差异
表达基因的适用方法。最常见的做法是应用该技术
构建 SSH 文库 ,进行大规模的基因差异表达研究 ,
本试验通过对 SSH 扩增产物中较明显的条带进行
回收 、二次扩增 ,大大减少了差异表达基因的研究数
量 ,避免了 SSH 文库构建的烦琐。
本试验对 SSH 产物的琼脂糖凝胶检测较为明
显的条带进行回收 、二次扩增 ,得到 6个差异表达条
带 。对其进行克隆 、序列测定 ,获得了 7个差异表达
的序列。其中 ,Col生态型 Col-3片段为 2个差异
表达序列 ,分析其原因可能是琼脂糖凝胶切取的一
条差异条带包含迁移率一样的 2个 cDNA片段。对
6个 cDNA片段进行同源性分析 ,结果发现 ,拟南芥
接种灰霉病菌后 ,诱导了一些与转录 、膜内外物质转
移 、蛋白合成 、信号转导等有关的基因表达 ,并有可
能启动多种调控机制 ,尤其是转录过程中的的调控。
其中 ,Col/Ler(359 bp)含有GAF 保守区域 ,与 Xan-
thomonas campestris 的组氨酸激酶传感器(sensor
57　第 1期　 邢继红等:拟南芥感染灰霉病菌后差异表达基因分析
histidine kinase)有 71%的同源性 。研究发现 GAF
和组氨酸激酶与拟南芥乙烯信号传递途径有关[ 7] ,
拟南芥有 5个乙烯受体基因 ,其相应的受体蛋白都
与原核生物的组氨酸-激酶有同源性[ 8-11] 。ERT1
是第一个被鉴定出来的拟南芥植物激素乙烯受体基
因 ,ERT1的 N 端是信号的输入区 ,ERT1结合乙烯
到转膜区 ,其 3个转膜区是 GAF 区 ,GAF 区的具体
功能还不清楚 ,在原核生物中明确了其参与 GTP 循
环[ 12] 。ERT1的 C端可能与信号输出有关 ,该区域
与激酶区域和接受区的序列同源[ 5] 。研究证明了
ERT1具有组氨酸激酶活性[ 13] 。然而最近的研究
表明 ERT1的规范组氨酸激酶活性对于受体信号传
递不是必需的[ 14 ,15] 。大量的研究表明乙烯参与调
节植物的防御反应 ,乙烯能诱导多种植物碱性 PR
基因的表达;茉莉酸(JA)和乙烯能协同诱导烟草
PR基因的表达和拟南芥防卫素基因 PDF1.2 的表
达;JA 和乙烯还协同介导植物的诱导系统抗性
IS R。因此初步判断 Col/Ler(359 bp)序列可能与拟
南芥的诱导抗病性有关。对所获的基因片段在功能
和结构上做进一步的分析 ,并获得这些基因片段的
全长将会对拟南芥与灰霉病菌互作的分子机理有更
全面的认识。
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(编辑:梁　虹)
58　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 29卷