全 文 ：科 学 五 叙 第 4 6卷 第 21期 2 0 01年 1 1月 简 宁及
di e f
e r n ti a ti o n o fK 5 6 2e e l ls wi t h d o we n r gu la ti o n o fe ry th r oi da n d
m e gak a ry c oy ti e t ra s c n ri P ti o n fa e t os r :a n oe v le x Pe ri m e n ta m l o de l
fo r he m o P oi e ti e i le a n ge e rs t ri c ti o n
.
E x P He m a t o l
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19 9 3
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5 2 5 ~ 5 3 1
王鑫 , 陈兴 , 王敦成 , 等 . 两个新的红细胞分化相关因子的 c D N A
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周海军 , 黄晓玮 , 人 H G L P c D N A 的克隆和原核表达 . 科学通报 ,
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4 6 ( 2 ) : 116 一 12 0
A It s e h u l 5 F, S r e Ph e n F, Th o m a s L
,
e t a l
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G a P Pe d B L A S T a n d
P S I
一
B L A S T : a n e w g e n e r a t i o n o f P r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h
P r o g r a m s
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N u c l e i c A c i d s R e s
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19 9 7
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p a r t i n g亡o n G A , aP 七ie n t R K
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Ph o s P h o yr ) a t i o n o f G
J八下入一 j 导n e r e a s e s
i t s D N A
一
b i n d i n g a f i n i t y a n d 15 c o r r e l a t e d w i t h i n d u e t i () n (一f h u m a n
K 56 2 e r y t h or l e u k a e m i a c e l l s
.
N u e l e i e A e id s R e s
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199 9 2 7 ( 4 ) : 116 8一
1 175
P a u l s e n 1 T, S k u r r a y R A
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T h e P O T af m i ly o f t r a n s Po r t P r o te i n s
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T r e n d s B i o e h e m S e i
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19 9 4
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N e r l o v C
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Q u e r fu r t h E
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K u l e s s a H
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e t a l
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G A T A
一
1 i n t e r a e t s w i rh
th e m y e lo id PU
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l t r a n s c r i Pt i o n f a e t o r a n d r e P r e s s e s P U
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l
-
d e P e n d e n t t r a n s e r iP t i o n
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B l o o d
,
2 0 0 0
,
9 5 ( 8 )
: 2 54 3 一 2 55 1
G r e e n A R
,
D e L u e a E
,
B e g l e y C G
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A n t i s e n s e S C L s u P P r e s s e s
s e l-f r e n e w a l a n d e n h a n c e s s Po n t a n e o u s e r y t h r o id d ife
r e n t i a t i o n o f
the h u m a n l e u k a e m i e c e l l l i n e K 5 6 2
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E M B O J
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19 9 1
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( 20 0 1
一
0 7
一
0 4 收稿 , 2 0 0 卜0 8一 2 9 收修改稿 )
拟南芥根特异表达转录因子 A tM Y B 3 05 的鉴定
及功能研究
王 栋 李利红 陈志玲 夏桂先 `
(中国科学院微生物研究所 , 北京 10 0 80 . * 联系人 , E 一 m a i l x i a g x @ s u n注m沮 c ￡n )
摘要 A Mt YB 了仍是拟南芥M YB 基因家族的成员之一 , 对其蛋白结构和 D N A 结合活性进行 了分析鉴定 ,
并对其表达特征和细胞 内功能作 了初步分析 . IA M Y B 305 含 R Z 和 R 3 两个重复序列及 M Y B 蛋 白特有的
其他氨基酸组成 . 凝胶阻滞实验证 明 , G S T 一 A tM Y B 305 融合蛋白能与含有 M Y B 识别位点 (T A A C T G ) 的
D N A 片段发生特异结合 . 在裂殖酵母中过量表达 AI M Y B 3 05 蛋白产生单核长细胞 , 其染色体异常凝缩 .
半定量 R T 一 P c R 分析表明 A Mt YB 了。万基因在拟南芥的根器官中特异表达 .
关键词 拟南芥 M Y B 转录因子 生化活性 功能分析
转录因子在真核生物的发育和代谢程序 中起着
关键的调控作用 . 根据大多数转录因子的 D N A 结合
区域的结构特征 , 可以将它们划分为几个不同的家
族 , M Y B 蛋 白家族就是其中之一 M Y B 转录因子在
真核生物 中广泛存在 , 它们 的共同结构特点是含有
一个保守的 D N A 结合区域 , 即 M Y B 域 , 它由 l ~3 个不
完全螺旋一转角 一螺旋重复序列 (R 1 , R Z , R 3) 组成 l ’ ,2] . 动
物 M Y B 一般含有 R I , R Z 和 R 3 三个重复序列阴 , 植
物 M Y B 则主要含 R Z 和 R 3 两个重复序列 , 但最近
也不断发现含有 3 个或仅含 l 个重复序列的植物
M Y B 蛋白 {3 ] .
在动物和酵母 中 , M YB 家族所含的基因数 目较
少 , 相比而言 , 植物的M BY 基因家族则非常之大 , 如
在拟南芥 中已发现有上百个 R ZR 3 一M BY 基因 , 是 已知
最大的植物调控基因家族 4[] . 动物 M Y B 转录因子的
180 4
功能主要是控制细胞增殖 、 分化和细胞凋亡 15 } , 植物
M BY 基因的功能则复杂得多 , 已发现植物 M Y B 转
录因子在次级代谢的调控 、 细胞形态建成和分化 、 植
物激素应答 、 抗病反应 以及细胞周期调控等过程中
起重要作用 I ’ ,3] . 正是由于基因数 目众多和在植物特
异生理过程中的这些不同功能 , M Y B 家族被认为是
调控植物基因表达的一类极其重要的转录因子 .
虽然植物 M Y B 家族的研究已经取得了一些进展 ,
但迄今仅对 10 % 的植物 M Y B 的功能有所了解 , 而该
家族大多数成员 的功能还有待研究 . 本文对拟南芥
M Y B 家族的成 员之一 IA M Y B 3 05 的蛋 白结构 和
D N A 结合特性进行 了分析 , 并根据其基因在不同器
官中的表达特征和过量表达对酵母细胞周期 的影响 ,
对该转录因子的细胞 内功能进行了初步探讨 .
WWw
.
S C IC h i n a
.
O O m
简 手及 第 4 6 卷 第 2 1期 2 01 0年 1月 科 专孟 叙
1材料和方法
( i ) 实验 材 料 . ( I) 植 物 材 料 . 拟 南芥
(A a rb io d户5 15 t h a l ia n a )为 C o l u m b i a 生态型 , 由中国科
学院遗传研究所李家洋实验室惠赠 . (2 )菌种和质粒 .
根 瘤农杆菌 (A g or b a e r e r i u m r u m aef e i e n s ) L B A 4 4 o 4 ,
大肠杆菌 ( E s e人e r i c人i a e o l i ) D H 5 a , B L Z I ( D E 3 ) , 裂殖
酵母 (s e人i z o s a e e人a or m夕e e s 尸o m b e ) Q 一 0 1 ; 蛋白表达载
体 pG E x 一 ZT 及 p R E PS N 均为本实验室保存 . (3 ) 培养
基和试剂 . 裂殖酵母的 M M ( nr i n im a l m e d i u m )基本培
养基参见 文献 陌] , 其余常规培养基按文献 7[ ]配制 .
实验所用的各种限制性内切酶和 T 4 D N A 连接酶购
自 iG cb o 公司 , P fu D N A 聚合酶和 M 一M vL 反转录酶
购 自 p r o m e g a 公司 , G l u t a小 i o n e S e p h ar o s e 4 B 亲和层
析柱为 P ha rm ac i a 公司产品 . D N A 片段和其他 P C R 反
应引物由上海基康生物公司合成 , 【a 一 3 2P] d c T P 由北
京亚辉生物医学工程公司提供 . 其他常规试剂均为
国产分析纯试剂 .
( i ) D N A 序列和蛋白结构分析 . D N A 序列由人
工测序或 自动测序仪 (上海基康生物公司 )测定 , O R E
M Y B 结构域以及蛋 白可能存在的结合位点分析通过
D N A (T , 0 1
,
s M A盯 l“ ]和 P Ro s I T E 191等软件完成 , 蛋白同
源序列比较在 N C B I B l a s t 和 G e n e d o c 程序中进行 .
(止 ) G sT 一 tA M Y 3B 05 融合蛋白表达载体的构建
及在大肠杆菌 中的诱导表达 . 将编码 A oM Y B 3 05
O R F 的 c D N A 片段 克隆到大肠杆 菌 表 达 载 体
pG E X
一
2T 中 , 挑取含重组质粒 pG E X 一 ZT 一M Y B 的单
菌落 , 接种于含氨节青霉素 (终浓度为 50 此 /m )L 的
L B 培养基中 , 37 ℃震荡培养过夜 , 次日以 2%量接种 ,
37 ℃扩大培养 至 A 60 。 为 .0 6 时 , 用终浓 度为 0 . 1
m m ol 儿 的 IP T G 25 ℃诱导表达 3 h . 冰浴超声波破碎
细胞 , I 0 0 o o x g 离心 , 取上清液进行 S D S 一PA G E 检测 .
同时用表达载体 pG E X 一 ZT 做平行实验 .
( iv ) 凝胶 阻滞 分析 . 用 超声波破碎 上述含
p G E X
一
Z T 或 p G E X 一 ZT 一M Y B 重组质粒的 E . e o l i细胞 ,
上清液过 G l u t a t h i o n e S e p h a r o s e 4 B 柱纯化 . 根据文
献 [ 10 ]设计两个 D N A 片段 (M B S I 和 mM B S I ) , 其中
M B SI 包含 已知的 M Y B 蛋白结合位点 (T A A C T )G :
5
` 一
C G A G A C A C C C T A A C T G A C A C A C用3 , C T 一 3 `
3
’ 一
T G T G G G
J叼可G A C I , G T G T G T A A G A G C T C 一5 ’ .
m M B sl 为 M B SI 在 M Y B 蛋白结合位点中有两个碱
基突变的序列 (T 互二c T G ) :
WWW
.
S C 亩C h 云n a . C O m
5
’ 一
CG A G A C A C C C T C C C T G A C A C A C 戌TT C T 一 3 ’
3
` 一
T G T G G G A G G G A C T G T G T G T A A G A G C T C
一
5
` .
取蛋白 10 林g , s x 结合缓冲液 4 林L , 10 m g /m L 鲜精
D N A 一林L , 0 . 2 m o l / L E D狱 2 林L , ’ Z P 标记 D N A 片段
2 5 n g
, 加 d d H ZO 至 2 0 林L , 轻轻摇动混合 , 室温静置
30 m in
. 用聚丙烯酞胺凝胶 (8 % )电泳分析 , 电泳缓冲
液为 0 . l x T B E , 3 h 后压片 , 进行放射性 自显影 .
( v ) AI M Y B 30 5 在酵母细胞中的过量表达 . 将
tA M YB 了口, 的 。 D N A序列亚克隆到裂殖酵母表达载体
p RE p 5 N (内含受 V B I阻遏的启动子 n m t l )中 , 用电击
法转化酵母 , 在含 2 林m ol 几 V BI 的 M M 基本培养液
中 2 8 ℃培养至对数生长期的中期 , 菌体用 M M 培养
液洗涤数次去除 V B I , 28 ℃培养 2 h 诱导蛋白表达 .
用 D A IP 和 C al co if ou : 进行染色体 D N A 和细胞中隔
染色后 , 在荧光显微镜下观察细胞形态 ! “ j .
( vi ) 半定量 RT 一 P C R 分析 . 以土壤培养的拟南
芥根 、 叶 、 茎 、 花为材料 , 用酸性硫氰酸肌一苯酚 一氯
仿抽提法分别提取总 R N A , 用 5 林g 模板反转录合成
c D N A 第一条链 , 取相同量进行半定量 PC R . 用于检
测 A Mt YB 3口多 m R N A 的正 向引物 为 5 ’ 一 C G G G A -
T C C AT G A G T T T G T G G G G A G G G A
一
3
` , 反 向 引物 为
5
` 一
G G A A I…T C G T T A A C A G A A G G G A 入 r G A C 一 3 ’ . 检
测 a c z i n 7 m R N A 的正向引物是 5 ` 一T G G A AT G G T G A -
A G G C T G G T T T
一
3
` , 反向引物为 5 ’ 一 C T G T T G G A A G -
G T G e T G A G G G A
一
3
’ . 检测 尸八之刀zi n Z m R N A 的正向弓i
物是 5 ` 一 GAT G T C G T G G C A AT C A T A C G A 一 3 ` , 反向弓!
物为 5 ’ 一 G C A C T T T G A G T G A A C T T A G A G 一 3 ` . 反应条
件 : 9 4℃ , 3 m in ; 9 4℃ , 1 m i n , 6 0℃ , 1 m i n , 7 2℃ , 1 m i n ,
4 5 个循环 ; 7 2℃ , 1 0 m i n .
2 结果
2
.
1 A tM Y B 3 0 5 蛋白的结构分析及同源性比较
ix a 等人 I” !曾利用裂殖 酵母 系统 , 从 拟南芥
c D N A 文库筛选到一个与金鱼草 A ; n M BY 了仍 基因高
度同源的 c D N A 克隆 . 本研究将其所代表的基因命名
为 A tM BY 3 o s , 并对其编码蛋 白的结构和功能展开了
进一步的研究 . 首先 , 对该 c D N A 的全序列进行了测
定 , 然后对其编码蛋白的结构和氨基酸组成特点进
行了分析 , 结果如下 : c D N A 全长 10 7 4 b p , 其 O R F 含
2 6 9 个氨基酸 , 推测分子量约为 31 ku . 5 `端非编码 区
为 4 4 b p , 3 `端包括 2 0 5 b P 的非编码区和 1 5 b p 的
oP ly A 序列 . AI M Y B 30 5 蛋白含有 R Z 和 R 3 两个重复
1 80 5



简 手及 第 4 e 卷 第 2 1 期 2 0 0 1 年 1 1 月 科 考 立 叙
M e Do we J l lM
,
A n Y Q
,
H u a n g S
,
e t a l
.
T h e A r a b id o P s i s A C T 7
a e t in g e n e 15 e x P r e s s e d in r a P id l y d e v e l o P i n g t i s s u e s a n d r e s P o n d s
t o s e v e r a l e x t e r n a l s t im u l i
.
P l a n t P h y s io l
,
19 9 6
,
11 1 : 6 9 9 一7 1 1
C h r i s t e n s e n H E
,
R a m a e h a n d r a n S
,
aT
n C T
,
e t a l
.
A r a b i do P s i s
P r o f i l i n s a r e f u n e t i o n a l ly s i m i l a r t o y e a s t p r o f i l i n s : I de n t i f i e a t i o n
o f a v a s e u l a r b u n dl e
一
s P e e iif e P r o if l i n a n d a Po l l e n
一
s Pe c i if e Pro if l i n
.
T h e P l a n t J o u r n a l
,
19 9 6
,
10 : 2 6 9一 2 7 9
M e i s s n e r R C
,
J i n H
,
C o m i n e l l i E
,
e t a l
.
F u n e t i o n s e a r e h i n a l a r g e
t r a n s e r iP t i o n f a c t o r g e n e fa m i l y i n A r a b id o P s i s : A s s e s s i n g t he
P o t e n t i a l o f r e v e r s e g e n e t ic s t o id e n t i f y i n s e r t i o n a l m u t a t i o n s in
R Z R了一M YB g e n e s
.
T h e P l a n t C e l l
,
19 9 9
,
1 1 : 18 2 7 ~ 】84 0
T h e A r a b id o P s i s G e n o m e In i t i a t i v e
.
A n a ly s i s o f t h e g e n o m e
s e q u e n e e o f t h e fl o w e r i n g P l a n t A r a b id op
s i s rh a l i a n a
.
N a t u r e
,
2 0 0 0
,
4 0 8 : 7 9 6 一8 15
( 2 00 一 0 6 一 2 5 收稿 , 2 0 0 1一 0 8一 2 4 收修改稿 )
小麦线粒体肌球蛋白的纯化和特性分析
赵和平①② 刘 爱校① 刘 国琴① ` 阎隆飞 ①
(①中国农业大学生物学院 , 农业部植物生理生化实验室 , 北京 】0 0 0 9 4 ; ②北京师范大学细胞生物学研究所 , 北京 10 0 8 7 5 . * 联系人 )
摘要 通过 D E一 52 离子交换层析和 S eP h ac r yl S 一 3 0 凝胶过滤等方法从小麦线粒体中纯化出了一种肌球
蛋白, 其重链分子量约为 21 0 k u , 与骨骼肌肌球蛋 白 H的分子量相近 ( 20 5 k u) , 并且可以被抗人骨骼肌
肌球蛋白多克隆抗体识别 . 小麦线粒体肌球蛋白的 A T P 酶活性可以被鸡骨骼肌肌动蛋白丝激活 , 达到
20 2
.
5 n m ol m/ i
n · m g
. 此外 , 其 A T P 酶活性还可以被 c a +2 激活 , 却不被高浓度的 C a +2 抑制 . 结果表明小
麦线粒体肌球蛋白与骨骼肌肌球蛋 白具有一些相似的生化特性 .
关键词 肌球蛋白 线粒体 纯化 A T P 酶
线粒体是真核细胞 中最重要 的细胞器 之一 , 在
细胞发育过程中线粒体的形状和胞内分布都在不断
的变化 [ ’ ] . 动物细胞中已经肯定微管马达蛋 白参与驱
动线粒体运动 ! ’ ] , 但微丝马达在线粒体运动中起什么
作用并不清楚 . 植物细胞 中线粒体运动的报道则更
少 . 此前 , 我们的研究结果表明肌动蛋白丝可以结合
到线粒体上 , 并能够激活线粒体的 AT P 酶活性 , 表明
线粒体表面存在肌球蛋白 , 可能参与线粒体的运动 ,
免疫印迹结果表明线粒体蛋 白中只有一个 Z 10 ku 的
蛋 白能够和抗 骨骼肌肌球蛋 白重链 多克隆抗体反
应 12] . 在此 , 进一步对 2 10 k u 肌球蛋白的纯化和特性
进行分析 , 结果表明该蛋 白确实是一微丝马达蛋白 ,
并且具有与肌球蛋 白 n 相近的一些生化特性 .
依据同源性序列肌球蛋白至少可以分为 巧 种类
型 . 其中深人研究的只有肌球蛋白 I 和肌球蛋白 n ,
而其他 的肌球蛋 白的研究大部分只是停留在基因序
列上 , 其结构 、 亚基组成 、 功能和在细胞内的位置都
不清楚 . 肌球蛋白 1 可以进一步分为肌细胞肌球蛋
白 n 和非肌细胞肌球蛋 白 n . 非肌细胞肌球蛋白 n
存在于所有动物细胞和真菌中 , 其中包括酵母细胞 3[] ,
但是植物细胞中是否存在非肌细胞肌球蛋 白 n , 目
前还未见有说服力的报道 .
在高等植物中只有个别肌球蛋 白被纯化出来 !4一6] ,
这些为数不多的肌球蛋白是在植物组织水平纯化的 ,
因而无法确定其在细胞 内的确切来源 , 其确切功能
也就不得而知 . 而高等植物线粒体肌球蛋 白的纯化
与特性研究还未见报道 , 即使动物线粒体马达蛋白 ,
无论是微丝马达或是微管马达蛋白的纯化研究也罕
有报道 . 所以 , 本实验选定一确定的细胞器 , 即线粒
体 , 为肌球蛋白纯化材料 , 因此可以肯定该肌球蛋白
来 自于线粒体 .
1 材料和方法
( i ) 植物材料 . 小麦 (升i r i c u m a e s t i v u m L )黄化
苗 .
( 11 ) 试剂 与抗体 . TA M E ( N 一 to s y l一 l 一 a r g in i n e -
m e t h y l e s t a r )
,
T PC K (N
一
t o s y l
一
L
一
P h e n y l a l a n i n e e h lo r o
-
m e t h y l k e to n e )
,
P IP E S ( P IP e r a z i n e
一
N
` ,
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b i s Z e t h a n e
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s u l fo n ic a e i d )
,
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一
b i s [ p
一 a m i n o e
-
th y l e t h e r卜N , N , N ’ , N ` 一 t e t r a a e e t i e a e i d )和抗人骨骼 肌
肌球蛋白重链多克隆抗体购 自 S ig m a 公司 . P M S F
(P h e n y l
一
m e th y l
一 s u l of n y l
一
fl u o r i d e )
,
D T T (d i t h i o th r e i t o l )
,
与碱性磷酸脂酶连接的抗兔 Ig G , N B T (p 一 n it r 。 b l u e
te tr a z o l i u m e h lo r id e )和 B C Ip (5一b r o m o 一4 一 e h l o r o 一 3一 in do l y l
p h o s p h a t e )为 p r o m e g a 产品 .
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.
S O IC h in a
.
C O m
1 8 0 9