全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 5期，第 1065-1069页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.5, 1065-1069
研究报告
Research Report
拟南芥 AtCYP1基因亚细胞定位及生理功能分析
范继业 1,2 张静 1* 李楠 1 韩继红 1
1河北化工医药职业技术学院,石家庄, 050026; 2河北师范大学,生命科学学院,石家庄, 050016
*通讯作者, 13832301120@139.com
摘 要 通过农杆菌浸染的转基因技术获得拟南芥转基因株系，亚细胞定位研究发现 AtCYP1在细胞膜
和细胞核中有明显表达。利用过表达技术，对转基因过表达、共抑制株系进行研究，结果表明，AtCYP1转基
因共抑制株系在开花时间和抽苔时间均较野生型晚 2~3 d，且抽苔前叶片始终多于对照，而过表达株系则
相反，说明 AtCYP1基因参与了拟南芥开花时间的调控。另外，悬浮细胞培养表明，AtCYP1基因的过量表
达提高了细胞的最高相对增长率，共抑制则反之，生长周期也发生了变化，说明 AtCYP1基因对拟南芥悬
浮细胞的增殖有调控作用。
关键词 拟南芥, AtCYP1,转基因,过表达
Sub-cellular Localization and Physiological Functional Analysis of At-
CYP1 in Arabidopsis thaliana
Fan Jiye 1,2 Zhang Jing 1* Li Nan 1 Han Jihong 1
1 Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College, Shijiazhuang, 050026; 2 College of Life Science, Hebei Normal University, Shi-
jiazhuang, 050016
* Corresponding author, 13832301120@139.com
DOI: 10.13417/j.gab.033.001065
Abstract In order to understand physiological function of AtCYP1, we obtained Arabidopsis transgenic lines by
Agrobacterium-mediated transformation. It was found by subcellular localization studies that AtCYP1 was ex-
pressed mainly in nucleus and on membrane. While we also characterized the transgenic over-expressed and co-in-
hibit lines through gene over-expression technology. The results showed that AtCYP1 transgenic AtCYP1 co-in-
hibited homozygous lines postpone flowering time later 2 or 3 days later than that of wild-type plant, and their
rosette leaves at bolting stage produce more than that of wild-type (blank control) and negative control (empty vec-
tor). Whereas the transgenic AtCYP1 over-expression lines exhibit complete contrary phenotypes. Therefore we
deduced that AtCYP1 might be involved in the regulation of flowering time. Additional, the result from cell sus-
pension culture showed that over-expressed AtCYP1 gene will enhance the maximal cell proliferation rate as well
as change the growth period, but the co-inhibited homozygous lines did contrary, which would imply that AtCYP1
could involve in the regulation of cell proliferation pathway.
Keywords Arabidopsis thaliana, AtCYP1, Transformation, Over-expression
基金项目：本研究由河北省科技厅自筹经费项目(12222906)资助
亲环素(cyclophilins, CyPs)是一类胞浆蛋白，属
于亲免素家族(Chou and Gasser, 1997)存在于所有生
物体，并广泛分布于细菌、动物、真菌和高等植物的细
胞核、细胞质、内质网、线粒体、分泌通道、高尔基体等
各种细胞器以及细胞外基质及共质体，在进化的过程
中具有高度保守性(Ref) (Jackson and Soll, 1999)。亲环
素在植物体中具有丰富的含量和多样的类型，暗示
着亲环素在蛋白折叠、mRNA过程、蛋白降解、信号
转导或者在发育和胁迫反应中起到关键作用(Fischer
et al., 1984; Handschumacher et al., 1984; Ivery et al.,
2000;李剑等, 2006)。
AtCYP1 (AtCYP18-4)是单结构域亲环素，仅含
有一个 PPIase功能域，由 172个氨基酸组成，分子量
大小为 18.4 kD (Trandinh et al., 1992)。到目前为止，
在拟南芥亲环素中，功能研究还停留在推导和假设
水平，只有少数报道说亲环素在胁迫下和活性生长
的细胞中表达旺盛(Saito et al., 1999)。而对于 AtCYP1
生理功能研究目前未见报导。
本研究通过研究转基因过表达株系和转基因
共抑制株系，对 AtCYP1进行亚细胞定位，并观察
AtCYP1基因在拟南芥体中过表达或转录本降低后
与野生型相比的表型及悬浮系差异，为 AtCYP1的
生物学功能研究提供依据。
1结果与分析
1.1 pCAMBIA1300-35s::cyp1-yfp表达载体的鉴定
本研究构建了转基因表达载体(图 1)，目的基因
PCR扩增产物电泳条带显示目标 DNA片段大小正
确(516 bp)，其重组质粒酶切鉴定及阳性克隆菌体
PCR的电泳条带大小均与其相符。
1.2 AtCYP1过表达拟南芥植株的分子鉴定
取转基因拟南芥纯合体株系、野生型株系 3~4
周左右的叶片，通过半定量 RT-PCR 分析(图 2)，转
基因株系 CYP-OE-1和 CYP-OE-2，发生了 AtCYP1
基因的过表达，CYP-OI 株系中 AtCYP1 表达量降
低，为共抑制株系。
1.3 AtCYP1基因的表达模式分析
通过 EST技术建立的组织表达模式分析结果
(图 3)，根据图中 TPM值的大小差异可知 AtCYP1
基因在拟南芥各个组织中的表达水平，其中在分生
组织和花器官中表达量最高，TPM值分别为 1 421
和 1 107，AtCYP1基因在芽、根、花序、长角果、叶和
种子等组织中的表达量依次降低。
1.4 AtCYP1基因亚细胞定位
通过Confocal对转基因过表达纯合体 10 d小苗
根部的观察，结果见图 4，细胞内 AtCYP1在细胞的
核和膜中表达较强，推测 AtCYP1主要定位于细胞
的核和膜中，细胞质中也有定位，但是相对较少。
图 1 35s::cyp1-yfp的载体构建
注: A: AtCYP1 基因 PCR扩增产物; M: 100 bp DNA Marker;
B:酶切验证目的基因; M: 200 bp DNA Marker; C:农杆菌菌体
PCR鉴定; M: 100 bp DNA Marker
Figure 1 35s::cyp1-yfp vector construction
Note: A: Atcyp1 gene cloned by PCR from Arabidopsis cDNA; M:
100 bp DNAMarker; B: The constructed vector validated with en-
zyme digestion; M: 200 bp DNA Marker; C: Agrobacterium with
35s::cyp1-yfp validated by PCR; M: 100 bp DNAMarker
图 2半定量 RT-PCR鉴定转基因拟南芥纯合体株系 AtCYP1
基因表达
Figure 2 Expression of ytransgenic atcyp1 homozygous lines vali-
dated by semi-quantificational RT-PCR
图 3 EST统计结果分析示意图
Figure 3 Expression profile based on analysis of EST counts
图 4 CYP1在拟南芥的根中表达模式
Figure 4 CYP1 expression mode in roots of Arabidopsis
拟南芥 AtCYP1基因亚细胞定位及生理功能分析
Sub-cellular Localization and Physiological Functional Analysis of AtCYP1 in Arabidopsis thaliana 1066
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
1.5 AtCYP1过表达拟南芥悬浮细胞的表型
制备 AtCYP1过表达植株的悬浮培养细胞，通
过对转 AtCYP1基因过表达与共抑制拟南芥悬浮系
生长曲线的测定，研究 AtCYP1过表达对悬浮细胞
生长的影响，如图 5所示，结果表明，过表达与共抑
制悬浮系的生长曲线与对照相比有明显区别，过表
达细胞的生长周期提前了 2 d，细胞的相对增长率最大
值也有提高，反之共抑制细胞的生长周期延迟了 2 d，
细胞的相对增长率最大值相应降低。过表达拟南芥
悬浮细胞从第一天就开始快速增殖，第 13天达到峰
值，此后细胞数开始快速减少，而共抑制悬浮细胞第
9天才开始高速增殖，第 17天达到峰值。
图 5 cyp1过表达与共抑制拟南芥悬浮细胞生长曲线
Figure 5 Growth curves of cyp1 overexpression and co-inhibition
in suspension cell culture of Arabidopsis thaliana suspension
1.6 AtCYP1过表达拟南芥植株的表型
通过对过表达植株的悬浮培养细胞生长曲线
的观察，证明 AtCYP1对细胞增殖具有调节作用，为
了进一步研究 AtCYP1在拟南芥中的生理功能，对
AtCYP1过表达拟南芥植株正常培养条件下的表型
进行观察，比较 AtCYP1转基因过表达株系与野生
型(WT)生长发育上的差异，结果见图 6。
结果表明，AtCYP1 转基因过表达株系表现为
早花，其抽苔时间提前 1~2 d，且其抽苔叶片数也少
1~2片，反之 AtCYP1转基因共抑制株系表现为晚花，
其抽苔比野生型晚 2~3 d，且抽苔叶片数也多 2~3片。
同时 AtCYP1转基因过表达株系和共抑制株系的开
花时间、结出第一个种荚的时间和株高等方面也与
对照存在明显差异，此结果说明 AtCYP1可能参与
了拟南芥的早花发育过程。
2讨论
通过农杆菌浸染的转基因技术构建了拟南芥
AtCYP1过表达和共抑制的转基因株系。AtCYP1亚
细胞定位主要在拟南芥细胞的细胞膜和细胞核中，
在细胞质中也有表达，但是相对较少。拟南芥过表
达悬浮细胞生长曲线表明，AtCYP1过量表达时提高
了细胞的最大相对增长率，生长周期也提前 2 d，而
AtCYP1表达量降低时则体现出相反的趋势，说明
AtCYP1参与了细胞增殖的调控过程。通过对拟南芥
图 6过表达拟南芥植株与共抑制植株的表型统计
注: A:过表达拟南芥纯合植株与共抑制纯合植株抽苔前叶片
发育; B:过表达拟南芥纯合植株与共抑制纯合植株抽苔后株
高; C:过表达拟南芥纯合植株与共抑制纯合植株抽苔,开花和
结荚时间
Figure 6 Phenotypes counted in over-expressed and co-inhibited
lines
Note: A: Leaf development in over-expressed and co-inhibited
lines before bolting; B: Plant height in in over-expressed and
co-inhibited lines after bolting; C: Bolting time, flowering time
and podding time in over-expressed and co-inhibited lines
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AtCYP1过表达和共抑制的转基因株系进行表型观
察，确认 AtCYP1基因参与了拟南芥开花时间的调
控过程。基因的表达量增高时引起早花。
总之，通过对 AtCYP1在拟南芥生长发育中的生
物功能的研究，可以证明，AtCYP1是一个参与拟南
芥开花时间调控的重要蛋白，它的过表达和缺失都可
以引起拟南芥植株表型上的变化。但是，对于 AtCYP1
发挥生物学功能具体的机制还有待进一步研究。
3材料与方法
3.1植物材料
实验所用的植物材料为拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)。生态型(ecotype)是 Columbia (Col)，为本室
保存。
3.2质粒和菌种
E. coli DH5琢 由本实验室保存；根癌农杆菌
GV3101由美国耶鲁大学邓兴旺教授惠赠。表达载体
pCAMBIA1300由中国科学院遗传研究所周华林博士
惠赠；T载体购于 promega公司。
3.3试剂及培养基
LB培养基成分购自 Oxiod公司；RNArose 购自
上海华舜生物工程有限工司；两步法 RT-PCR试剂
盒、Taq 酶、限制性内切酶购自 TaKaRa公司。
培养细菌所用 LB 培养基、培养农杆菌所用
YEB培养基均按照《分子克隆实验指南》配制同时加
入所需抗生素。培养拟南芥用MS固体培养基加入
潮霉素 25 mg/L。
3.4 pCAMBIA1300-35s::cyp1-yfp表达载体的构建
以 NCBI中的基因序列为模板，用 OMIGA 2.0
软件，设计引物序列用于扩增 AtCYP1基因，上游引
物：5-GGATCCATGTCGAACCCTAGAGTTTTCTT
C-3引入 BamH玉位点；下游引物：5-GAGCTCCTA
AGAAAGCTGACCACAATCAG-3 引入 Sac 玉位
点，以拟南芥 cDNA为模板 PCR 扩增 AtCYP1 基
因。扩增条件：反应条件为 94℃预变性 5 min，94℃变
性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min；23个循环。
所得扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收正
确的 DNA片段，连入 T-vector，转化大肠杆菌 DH5琢
(Xgal/IPTG)，挑出阳性克隆(白色菌斑)，提取质粒，酶
切鉴定、DNA测序。测序正确后，把目的片断连接到
pCAMBIA1300载体上，农杆菌转化挑出阳性克隆，
PCR鉴定正确条带。
3.5拟南芥基因转化及筛选
选择拟南芥刚开花，形成 1~2个长角果时，将角
果及已完全开放的花蕾剪去，仅留下幼嫩花蕾，用于
转化。将含农杆菌的转化介质倒入 200 mL烧杯中，将
处理后的的拟南芥花序浸浸泡 5 min后取出，用薄膜
覆盖避光保湿培养 24 h，正常培养后，收获种子，转化
后的种子用含 500 mg/L羧苄的无菌水浸泡 10 min，
播种在含 25 滋g/mL潮霉素的 MS培养基上光照培
养，继代 2次后不发生抗性分离的为纯合体。
3.6 AtCYP1转基因纯合体分子鉴定
取培养2周的拟南芥转基因苗叶片，分别提取总
RNA，逆转录成 cDNA，利用拟南芥泛素基因 UBi确
定反转录样品之间 cDNA量的比例，再扩增 AtCYP1
检测表达量，表达量上升的为过表达，表达量下降的
为共抑制。
3.7 AtCYP1基因的表达模式分析
为了研究 AtCYP1基因的组织表达模式，进行
了表达序列标签(EST)分析。将 AtCYP1的基因号
At4g34870提交至 NCBI数据库，得到通过 EST技
术建立的组织表达模式分析结果。
3.8转基因拟南芥根部观察亚细胞定位
将转基因拟南芥 10 d的无菌苗的根置于载玻片
上，滴上水或 DAPI染液，盖好盖玻片，轻压后，在
Confocal下观察荧光在细胞中定位情况。
3.9 AtCYP1过表达拟南芥悬浮细胞的制备
将 AtCYP1过表达、共抑制拟南芥转基因纯合
株系，与野生型WT的种子在加入激素的固体 MS
培养基上诱导愈伤，每 14 d继代一次。挑选生长状态
良好的固体愈伤组织转入到加入激素的新鲜液体MS
培养基中，置于暗室摇床上培养，130 r/min，每 7 d继
代一次。
3.10过表达拟南芥悬浮细胞生长曲线的绘制
继代 2~3 次后，挑选分散均匀，状态良好的悬
浮系，用无菌的纱网滤得适量固体愈伤组织，转入
到 30 mL加入激素的新鲜液体MS培养基中，每 24 h
取匀浊液，血球计数板计数，计算细胞密度及细胞相
对增长比例((细胞密度 -初始细胞密度)/初始细胞密
度)，绘制生长曲线。
拟南芥 AtCYP1基因亚细胞定位及生理功能分析
Sub-cellular Localization and Physiological Functional Analysis of AtCYP1 in Arabidopsis thaliana 1068
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
作者贡献
范继业和张静是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；范继业、张静及李楠完成数据分析和论文
初稿的写作；韩继红参与实验设计和试验结果分析；
范继业是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数
据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的文本。
致谢
本研究由河北省科技厅自筹经费项目(12222906)
资助。
参考文献
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