全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(7): 1216−1220 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2009AA101102)，陕西省 13115科技创新工程重大科技专项(2007ZDKG-02)和国家杨凌农业
生物技术育种中心专项基金项目(99-1A)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张改生, E-mail: zhanggsh@public.xa.sn.cn
Received(收稿日期): 2009-10-26; Accepted(接受日期): 2010-04-21.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01216
利用荧光原位杂交技术分析新合成异源四倍体拟南芥
位 芳 张改生*
西北农林科技大学 / 陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室 / 小麦育种教育部工程研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 在植物异源倍化育种中或者通过异源多倍化导入有利基因时, 初级杂交后代异源多倍体减数分裂期间, 避
免部分同源染色体干扰, 使同源染色体正常联会和配对以及正确分离是产生功能性雌雄配子的细胞学基础。本研究
通过种间杂交技术, 获得初级杂交后代异源四倍体拟南芥 A. suecica, 并重点分析其花粉母细胞减数分裂期同源染色
体联会和配对情况。利用 DAPI 技术染色证明了花粉母细胞减数分裂期间核内染色体数目的正确性和均等分裂; 而
用荧光原位杂交技术进一步证明了核内染色体组的来源的正确性和同源染色体联会和配对的精准性。该结果证实新
合成异源多倍体能进行正常的减数分裂和产生功能性雌雄配子, 为种属间杂交和异源多倍体育种以及植物杂种优势
利用提供了有利的细胞遗传学证据。
关键词: 拟南芥; 新合成; 异源四倍体; DAPI; 荧光原位杂交
FISH Analysis of Resynthesized Allotetraploid Arabidopsis
WEI Fang and ZHANG Gai-Sheng*
Key Laboratory of Crop Heterosis of Shaanxi Province, Wheat Breeding Engineering Research Center, Ministry of Education, Northwest A&F Uni-
versity, Yangling 712100, China
Abstract: Allopolyploidy breeding or introduction of preferential gene(s) via allopolyploidization is widely attempted in produc-
tion of new crops. Thus at the onset of establishment of new allopolyploids, the functional gametes are reproduced conditioning
that normal events such as synapsis and pairing and correct segregation of homologous chromosomes are guaranteed with the
avoidance of possible interference of homoeologous chromosomes during meiosis. In the present study, we reported on meiotic
synapsis and pairing of homologous chromosomes during the development of pollen mother cells in the newly resynthesized al-
lotetraploid Arabidopsis aided with DAPI staining and FISH technique. The results showed that the correct number of nuclear
chromosomes and balanced segregation were frequently observed with DAPI staining, and FISH analysis further provided the
improved resolution of synapsis and pairing of homologous chromosomes, and the investigated nuclear chromosomes derived
from different parental lines had no interference with each other, and the synapsis and pairing of homologous chromosomes were
clearly identified. Therefore, the results indicated that the newly resynthesized allotetraploid Arabidopsis may achieve the normal
meiosis and propagate the functionalized gametes for fertilization, confirming a potential vigor of intra/interspecific hybridization
and a cytological basis for allopolyploid breeding.
Keywords: Arabidopsis; Allotetraploid; Resynthesized; DAPI; FISH
自然界中, 种属间物种通过有性杂交(hybridization)
和基因组加倍(genome doubling)产生异源多倍体后代[1]。
研究表明, 异源多倍体与二倍体祖先相比, 首先, 在表型
上, 如器官大小、花期发育、以及某些其他形态发生了许
多的变化[2-3]; 其次, 在基因组成上, 不同来源的基因组相
互作用, 导致某些基因序列重排和基因组序列的缺失[4-6];
此外, 往往伴随一系列的表观遗传上改变, 如部分 DNA
发生甲基化, 转座子激活等现象[7-8]。在这些变化中, 有些
发生在异源多倍体形成过程中 , 有些是在多倍体不断演
化的过程中逐步发生的, 因此, 不易被察觉。然而, 在异
源多倍体中, 不同来源的染色体组, 即部分同源染色体组,
由于受到相关基因产物的严格控制 , 而能进行正常减数
分裂, 产生功能性配子, 进行有性生殖。例如, 在小麦异
源四倍体(AABB)和异源六倍体(AABBDD)中, 由于位于
5B 染色体上 Ph1 基因座的存在, 抑制了部分同源染色体
间的联会和配对 , 该位点的突变导致染色体联会和配对
第 7期 位 芳等: 利用荧光原位杂交技术分析新合成异源四倍体拟南芥 1217


的混乱, 进而干扰减数分裂[9-10]。然而, 对于新合成的异
源多倍体来说, 虽然有类似 Ph1基因(Ph1-like)控制, 但由
于“基因组冲突”(genomic shock), 减数分裂期同源染色体
联会和配对的机制是否受到影响 , 以及部分同源染色体
能否实现瞬时联会(transient synapsis)或配对(pairing)并不
十分清楚[11]。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)
是在分子及细胞水平上检测外源染色质的一种十分有效
的方法, 因其具有直观、安全可靠、灵敏度高、可放大信
号、可定量或非定量分析等优点, 在高度或中度重复 DNA
序列的鉴定、低或单拷贝 DNA序列及遗传标记的物理定
位、异源染色质和非整倍体的鉴定、染色体物理图的构建、
比较基因组研究、物种进化、转基因检测等方面得到广泛
的应用[12-15]。本研究利用荧光原位杂交技术, 分析人工合
成初级异源四倍体减数分裂期染色体行为 , 以期待为种
属近缘物种杂交和异源多倍体育种以及作物杂种优势利
用提供细胞学证据[16]。同时, 也为揭示异源多倍体基因组
稳定性进化(evolution of genome stability)在细胞遗传学水
平上提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
拟南芥属同源四倍体 A. thaliana (2n=4x=20)和 A.
arenosa (2n=4x=32)是自然界存在的两个近缘种。在温室
中, 通过人工辅助去雄(开花期前, 除去幼嫩花药)和人工
饱和授粉, 最终获得种间杂交 F1代种子。将杂交 F1代种
子进行低温春化处理后(温度 4℃, 处理约 2 周), 室温播
种(温度 22℃), 获得异源四倍体拟南芥植株 A. suecica
(2n=4x=26)。试验材料来源于奥地利科学院孟德尔研究
所。将所用材料种植于温室中, 光照 18 h, 室内湿度约为
70%。
1.2 基因组 DNA提取和探针标记
取上述异源四倍体拟南芥幼龄叶片约 2~5 mg, 以液
氮迅速冷冻处理。利用改进的 CTAB 法提取基因组
DNA[17]。分别利用生物素和地高辛标记的 dUTP (包括
bio-dUTP 和 dig-dUTP, Roche公司), 通过 PCR反应标记
探针, 总反应体系含 10×PCR buffer (Mg2+) 5 μL、2.5 mmol
L−1 dNTP (包括 dATP/dCTP/dGTP) Mixture 3 μL 和 2.5
mmol L−1 dTTP以及 bio-dUTP (或 dig-dUTP)各 1 μL、5 U
μL−1 Taq 酶(Fermentas公司) 1 μL、0 μmol L−1 At-cen-F/
At-cen-R 或 Aa-cen-1-F/Aa-cen-1-F 2.5 μL, 以 ddH2O 补
足至 50 μL。PCR过程为 94℃预变性 2 min; 94℃变性 30 s;
55℃退火 30 s; 72℃延伸 30 s, 反应 35个循环。PCR产物
经离心浓缩, 用甲酰胺溶解至浓度为 150 ng μL–1待用。
引物序列为：At-cen-F: 5′-CATGGTGGTAGCCAAA
GTCCATA-3′; At-cen-R: 5′-GCTTTGAGAAGCAAGAAG
AAGG-3′; Aa-cen-1-F: 5′-AGCTTCTTATTGCTCTCAACG
G-3′; Aa-cen-1-R: 5′-TTAGAAGCTCCAAAACCGAAAA-3′。
1.3 减数分裂期染色体制片
取异源四倍体拟南芥幼龄花序, 以卡诺固定液固定,
对减数分裂期的花粉母细胞制片和观察。根据 Ross 和
Armstrong 描述的实验方法[18-19], 略有改进。取异源四倍
体植物 A. suecica花序, 大小约在 0.5~2.0 mm之间, 经清
洗后, 固定在卡诺固定液中, 常温下 2 h, 然后用清水冲
洗 3次, 柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)清洗 2次, 转至酶液(包
括纤维素酶、果胶酶、细胞解旋酶等, Sigma公司)中 37℃
酶解 30 min。将酶解后花序转移至干净载玻片上, 在解剖
显微镜下, 挑取合适幼龄花, 解剖并释放花药, 压片。然
后, 利用液氮迅速除去盖玻片, 室温晾干后, 滴加 10 μg
mL−1的 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole, Roche公司)
染色, 在显微镜下观察染色体分裂情况, 并选取较好制片,
进行荧光原位杂交实验。
1.4 荧光原位杂交过程
将挑选的制片放入 2×SSC清洗 5~10 min, 以一系列
乙醇(70%、80%、90%和 100%)脱水后晾干; 将 25 μL杂
交液 I (包括 100%去离子甲酰胺 10 μL; 50%硫酸葡聚糖 8
μL; 20×SSC 2.5 μL; 10% SDS 2.5 μL; 生物素或地高辛标
记的核酸探针 2 μL)直接滴加到染色体制片上, 盖上塑膜
盖片, 于 95℃变性处理 3 min; 将制片放入湿盒, 37℃杂
交过夜; 继之以 SF50 溶液(50%甲酰胺于 2×SSC) 42℃清
洗 3 次; 2×SSC 溶液中 42℃清洗 3 次; 4T 溶液(0.05%
Tween- 20于 4×SSC)中 42℃处理 5 min; 封阻液 37℃处理
30 min; 4T溶液中 42℃处理 5 min; 滴加 100 μL杂交液 II
(抗体 Avidin~Texas Red和封阻液)于制片上, 并于 37℃杂
交 30 min; 以 TNT 溶液 (Tris-HCl, pH 7.5 和 0.05%
Tween-20) 42℃处理 5 min; 滴加 100 μL杂交液 III (抗体
goat-anti-avidin~biotin 和 mouse-anti-digoxigenin, 封阻液),
并于 37℃杂交 30 min; 以 TNT溶液 42℃清洗 3次; 滴加
100 μL 杂交液 IV [抗体 Avidin (Texas Red)和 goat-anti-
mouse Alexa 488, 封阻液], 37℃杂交 30 min; 以 TNT溶液
42℃清洗 3 次; 晾干后, 以 DAPI 染色封片, 荧光显微镜
下观察并照相。
2 结果与分析
在新合成异源四倍体 A. suecica (2n=4x=26) 中, 有
10条染色体来源于 A. thaliana (2n=4x=20)的基因组, 该染
色体组着丝粒染色体因含有 180 bp 的重复序列, 而被生
物素 (biotin)标记 ; 同时 , 另外 16 条染色体来源于 A.
arenosa (2n=4x=32)基因组, 因对于着丝粒含有对等的 180
bp 重复序列 , 通过特异性 PCR 扩增而被地高辛
(digoxigenin)标记。在本实验中, 利用两种不同类型的抗
体偶联荧光素 (Texas Red 和 Alexa 488), 分别标记 A.
thaliana 和 A. arenosa染色体组, 在荧光显微镜下检测出
红色和绿色荧光。
异源四倍体 A. suecica (2n=4x=26)减数分裂过程中,
通过 DAPI 染色, 见减数分裂前期(细线期至双线期)的常
1218 作 物 学 报 第 36卷

染色质部分呈细丝状并逐步联会(图 1-a); 而异染色质部
分因处于高度浓缩状态而表现为明亮的念珠状(图 1-a);
在前期末期, 由于染色质不断浓缩变短, 形成一些端部较
松散的染色体(图 1-b), 并逐渐配对; 在减数分裂中期 I,
染色体高度浓缩, 同源染色体间完全实现配对, 而出现在
赤道板上 (图 1-c), 然后配对的同源染色体逐渐解离 (图
1-d), 在后期 I 并向细胞两极移动, 最终末期 I 形成二体
(图 1-e), 经历第二次减数分裂在末期 II形成四体(图 1-f)。
然而通过这种 DAPI染色技术, 只能大概观察到染色体分
裂行为, 以及减数分裂中染色体数目, 而对染色体组的亲
本来源并不能鉴定和分析。
荧光原位杂交分析表明 , 异源四倍体拟南芥 A .
suecica花粉母细胞进入减数分裂间期, 在 S期 DNA复制
后, 丝状的染色体(染色质)逐步浓缩, 异染色质部分浓缩
的速度较快, 程度较高。进入减数分裂期后同源染色体
(质)在前期 I 的偶线期开始逐步联会, 异染色质部分联
会较早(图 2-a); 到了前期末, 常染色质不断浓缩, 缩短变
粗, 逐渐形成端部较松散的二价体(图 2-b), 至中期 I早期,
浓缩程度逐步增强, 染色体进一步缩短(图2-c); 至减数分
裂中期 I, 同源染色体配对(图 2-d~e), 分列在赤道板上;
到减数分裂后期 I, 同源染色体在纺锤体的拉动下逐步
向两极移动, 实现均等分裂(图 2-f); 第二次减数分裂完成
后, 形成四体(图2-g~h)。通过对染色体行为的观察和染色
体数目的统计表明, 新合成异源四倍体 A. suecica (2n=4x
=26)可以进行正常的减数分裂 , 并最终形成功能性雌雄
配子。



图 1 异源四倍体 A. suecica 减数分裂期染色体行为 DAPI 染色
Fig. 1 Chromosome (chromatin) behavior during meiosis in allotetraploid A. suecica stained with DAPI
a: 减数分裂前期, 染色质呈丝状; b: 至前期末, 染色质逐步浓缩化, 同源染色体配对; c: 减数分裂中期 I同源染色体配对, 排列在赤道板上; d:
减数分裂中期 I末, 配对染色体逐步分裂; e: 末期 I染色体进入两极, 形成二体; f: 第二次减数分裂完成后, 形成四体。
a: thread-like chromatin at prophase I; b: condensed chromatin and homologous chromosomes gradually paired at late prophase I; c: at metaphase I
homologous chromosome completely paired with their partners located at the equatorial plate. d: the paired chromosomes disassociated at late meta-
phase I; e: at anaphase I the separated chromosomes distributed in two opposite pole and formed into dyad; f: after the meiosis II the chromosomes
equally distributed in four micronuclei and formed a tetrad.

3 讨论
异源多倍化在植物进化过程中有着极为重要的作用,
是物种形成和多样化的重要途径之一[20]。因此, 探索和研
究异源多倍化效应对于揭示物种形成和进化具有十分重
要的意义。异源多倍化可以导致基因沉默、转座子激活、
染色体重排和丢失等 [21 -22], 还发生表观遗传方面变化 ,
如 DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化等[8]非 DNA序列
的变化。通过 A. thaliana和 A. lyrata杂交获得的异源四倍
体拟南芥, 在表型上十分类似于 A. lyrata, 并能自花授粉,
表现出 A. lyrata核仁显性(nucleolar dominance)特征和部
分 DNA甲基化[23], 此外, 对异源四倍体拟南芥 A. suecica
的全基因组转录和表达分析发现, 非累加性基因表达和
调控对异源四倍体内物质代谢和生殖生长调控有着重要
作用[24]。然而, 异源多倍化后, 在细胞遗传学水平上, 对
减数分裂期同源染色体行为的研究报道不很多, 尤其对
种属间杂交产生的异源多倍体, 由于不同亲本来源的染
第 7期 位 芳等: 利用荧光原位杂交技术分析新合成异源四倍体拟南芥 1219




图 2 以 FISH 分析异源四倍体 A. suecica 减数分裂期染色体行为
Fig. 2 FISH analysis of chromosome (chromatin) behaviors during meiosis in allotetraploid A. suecica
a: 减数分裂前期, 染色质呈丝状, 常染色质为松散丝状, 部分异染色质浓缩化, 如 At-CEN(红色)和 Aa-CEN(绿色), 蓝色为 DAPI染色; b和 c:
前期末至中期 I, 染色质逐步浓缩化, 同源染色体配对, 5对染色体(红色荧光)来自 A. thaliana, 8对染色体(绿色荧光)来自 A. arenosa; d和 e: 减
数分裂中期 I 同源染色体配对, 排列在赤道板上; f: 从减数分裂中期 I末至后期 I, 配对同源染色体逐步分裂, 向两极移动; g和 h: 至减数分裂
II结束, 均等分裂的染色体形成四体。
a: thread-like chromatin at prophase I, regularly diffused euchromatin and highly condensed heterochromatin, At-CEN(red) and Aa-CEN(green); b and
c: condensed chromatin and homologous chromosomes gradually paired at late prophase I (five pairs from A. thaliana and eight pairs from A. arenosa);
d and e: at metaphase I , homologous chromosomes completely paired with their partners located at the equatorial plate; f: after metaphase I the paired
chromosomes separated into two opposite poles; g and h: after meiosis II, four nuclei formed with equal number of chromosomes.

色体具有较高的同源性 , 减数分裂期间同源染色体能否
正常分裂决定着多倍体物种能否形成新的功能性配子。比
如, 在新合成异源四倍体小麦中, Moore 等 [25]研究发现,
伴随异源多倍化, Ph1 基因(pairing homoeologous 1)的出
现是不同来源基因组(ABD)进化的结果, 而在其二倍体祖
先中, 并没有检测到 Ph1基因。因此, 伴随着多倍化进程,
多倍体物种本身进化出一种严格监督机制 , 以确保有性
生殖的正常进行[1]。
利用特异性探针标记 , 结合荧光原位杂交技术 , 本
研究结果表明, 与异源多倍体小麦相比较, 异源四倍体拟
南芥 A. suecica中, 可能在某条染色体上存在类似 Ph1基
因(但须进一步证实), 因此, 异源四倍体形成后, 能进行
正常的减数分裂过程, 并实现同源染色体联会和配对, 保
证了同源染色体间的等位基因交叉互换 , 产生功能性配
子, 保证了物种的延续, 为物种进化提供物质基础。
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