全 文 ：２０１５年１１月 四川大学学报（自然科学版） Ｎｏｖ．２０１５
第５２卷　第６期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．６
收稿日期：２０１４－０２－２６
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；国家转基因重大专项（２０１１ＺＸ０８００９－００３－００２）
作者简介：杨昊（１９８９－），男，硕士，研究方向为植物遗传与分子生物学．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．１１．２９
拟南芥中参与盐胁迫应答的基因
Ａｔ１ｇ１４２６０的功能初探
杨　昊，杨凤玺，袁德志，刘志斌，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：拟南芥中未知基因Ａｔ１ｇ１４２６０的表达受到多种非生物胁迫的诱导，特别是在 ＮａＣｌ
的诱导下，Ａｔ１ｇ１４２６０的表达量明显增加．对Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ａｔ１ｇ１４２６０（ｓａｌｋ－１１８４０６）的
分析表明，敲除了基因Ａｔ１ｇ１４２６０的拟南芥相比野生型对盐胁迫更加敏感．此外，构建了融
合表达载体ＰＢｉ２２１－Ａｔ１ｇ１４２６０－ＧＦＰ并且成功转入拟南芥原生质体中，在荧光显微镜下观察
到融合蛋白定位于原生质体细胞核中．因此，Ａｔ１ｇ１４２６０可能参与了拟南芥中盐胁迫的过程．
关键词：拟南芥；盐胁迫；萌发率；幼苗生长；根长；亚细胞定位
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１５）０６－１３４７－０６
Ｐｒｉｍａｒｙ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　Ａｔ１ｇ１４２６０　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＹＡＮＧＨａｏ，ＹＡＮＧ　Ｆｅｎｇ－Ｘｉ，ＹＵＡＮ　Ｄｅ－Ｚｈｉ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｇｅｎｅ　Ａｔ１ｇ１４２６００ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ａｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔ１ｇ１４２６０ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＮａＣｌ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ａｔ１ｇ１４２６０ｗａｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔ－
ＤＮＡ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ａｔ１ｇ１４２６０（ｓａｌｋ－１１８４０６）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｋｎｏｃｋｉｎｇ　ｏｕｔ　Ａｔ１ｇ１４２６０ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ＮａＣｌ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｆｕｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ＰＢｉ２２１－Ａｔ１ｇ１４２６０－
ＧＦＰ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ．Ｔｈｅ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉ－
ｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎｎｕｃｌｅｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，Ａｔ１ｇ１４２６０
ｍａｙ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；Ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ；Ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ；Ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ；Ｓｕｂｃｅｌ－
ｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
１　引　言
土地盐渍化是由于自然因素和人为不合理的
措施而引起的．目前，土壤盐渍化已经成为困扰
多行业专家的一个世界性问题，盐渍化的土地严
重影响了当地的农作物生产和经济的发展，选育
对盐耐受的植物品种从而适应盐碱化的土地，是
一种从根本上解决土壤盐渍化的方法．据数据统
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
计，我国现有的耕地中，有多于８００万ｈｍ２的土地
由于不科学的灌溉、施肥，导致土壤中大量盐分积
累，从而形成了土壤盐渍化，进而严重影响了农
作物的正常生产［１］．
同时大量研究表明，植物对高盐土壤环境的
应答涉及多基因家族的复杂调控网络［２－５］．大量研
究发现，含有ＲＩＮＧ结构的基因与植物抗逆性关
系密切．比如，含有ＲＩＮＧ结构的ＲＧＬＧ２基因对
拟南芥的干旱胁迫具有负调控作用［６］，ＤＲＥＢ２Ａ
是含有ＲＩＮＧ结构的一个基因，它编码的蛋白与
其它蛋白相互作用，对拟南芥的干旱胁迫具有负
调控作用［７］，ＲＨＡ２ａ是含有ＲＩＮＧ结构的一个基
因，在种子萌发于以及幼苗的生长阶段起作用，
在盐胁迫与干旱胁迫下以及对 ＡＢＡ的响应起到
正调控的作用［８］．本研究发现拟南芥中未知功能
基Ａｔ１ｇ１４２６０含有一个保守的 Ｃ３ＨＣ４的 ＲＩＮＧ
结构域，且该基因在高温，干旱，盐，渗透胁迫等
多种条件胁迫下表达量均有所改变，而在盐胁迫
条件下，表达量明显升高．以ＮａＣｌ作为盐胁迫因
子，探讨其对野生型及突变体拟南芥生长的影响．
研究结果发现，Ａｔ１ｇ１４２６０突变后对盐胁迫非常
敏感．突变体种子萌发率明显低于野生型，且萌
发后的根长伸长也比野生型要短，在幼苗的生长
过程中，突变体幼苗更容易出现萎黄，枯萎的症
状．这些结果说明该基因在拟南芥盐胁迫应答过
程中起重要的作用．同时，该基因亚细胞定位发
现其集中在细胞核内表达，为进一步功能分析奠
定基础．
２　材料和方法
２．１　实验材料
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）野生型采用
Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型，其种子为本实验室保存．突变体
种子是从拟南芥生物资源中心（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏ－
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｒｅ，ＡＢＲＣ）购买的编号为
ＳＡＬＫ＿１１８４０６拟南芥种子．
各种 ＤＮＡ 内切酶、连接酶、聚合酶均购于
Ｔａｋａｒａ公司．植物ＲＮＡ提取试剂盒和反转录试剂
盒购自天根生化科技有限公司．引物合成与测序由
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术有限公司完成．
２．２　试验方法
２．２．１　植物培养　将营养土与蛭石按照１∶２的
比例混合拌匀后用高压湿热灭菌２５ｍｉｎ，取出冷
却．将要花钵洗净、晾干后高压灭菌２５ｍｉｎ，取出冷
却．将营养土分装到花钵中备用．将消毒后的拟南
芥野生型种子和突变体ａｔ１ｇ１４２６０的种子于 ＭＳ
平板上，在组培室中生长５～７ｄ后，分别移栽至花
钵中，培养于２２℃恒温，光照１６ｈ，黑暗８ｈ的组培
室中．
２．２．２　生物信息分析　利用ＮＣＢＩ资源库找到基
因 Ａｔ３ｇ４７５５０（ＴＲ１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＴ０２９５２５．１）和
Ａｔ５ｇ６２４６０（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿１２５６４０．
３）的同源基因Ａｔ１ｇ１４２６０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ０５９０９０．１）
和Ａｔ２ｇ０２９６０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０９１３３５．１），并利用软件
ＭＥＧＡ分析四个相关基因的同源关系．之后利用序
列分析软件预测了目标基因Ａｔ１ｇ１４２６０及相关基因
序列中可能存在的调控元件，并比对了四个同源基
因的蛋白质序列．
２．２．３　ＲＴ－ＰＣＲ　将饱满的拟南芥种子春化处
理，然后消毒洗净．将处理后的种子播种于 ＭＳ培
养基平板上生长５ｄ后，将幼苗分别移至ＭＳ，Ｍｓ＋
３００ｍＭ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，Ｍｓ＋１０μＭ　ＡＢＡ，ＭＳ＋２５０ｍＭ
ＮａＣｌ的平板上处理８ｈ，并将一个 ＭＳ平板置于
３７℃烘箱中热处理８ｈ．分别提取各种处理后幼苗
的ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因在几种处理下
的表达情况．ＲＴ－ＰＣＲ中所使用引物序列为上游引
物 ｓ （５′－ＴＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＣＣＡ－
ＧＡ－３′）与 下 游 引 物 ａｓ （５′－ＣＣＧＡＧＴＧＧＣ－
ＣＡＡＧＴＣＣＧＣＴＧ－３′）．内参引物 Ｔｕｂ－２上游引物
（５′－ＡＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧ －３′）与
下 游 引 物 （５′－ＧＣＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＧＧ－
ＴＡＣＴＣＴ－３′）．使用荧光定量ＰＣＲ仪，数据经电
脑分析直接生成较为直观的柱状图．
２．２．４　突变体的鉴定　ＤＮＡ水平的检测：剪下生
长一个月的突变体幼苗叶片，提取总ＤＮＡ并以之
为模板采用三引物ＰＣＲ法，进行ＰＣＥ扩增检测．
Ａｔ１ｇ１４２６０基因特异的引物 ＬＰ （５′－ＣＣＡＡＧＧ－
ＧＡＧＡＧＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣ－３′）、ＲＰ （５′－ＴＡＴＴＧＣ－
ＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＴＣ－３′）与 Ｔ－ＤＮＡ 的 ＬＢ
（５′－ＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴ－３′）进行
ＰＣＲ扩增反应．
ＲＮＡ水平检测：利用提取植物 ＲＮＡ试剂盒
提取拟南芥突变体ａｔ１ｇ１４２６０幼苗ＲＮＡ，将提取
的ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，用突变基因ａｔ１ｇ４２６０的
特异引物ＬＰ与ＲＰ进行扩增，同时以ａｃｔｉｎ基因表
达作为对照，ａｃｔｉｎ基因引物为（５′－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴ－
ＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３′）和 （５′－ＧＴＴＧＧＴＧＡＴ－
ＧＡＡＧＣＡＣＡＡＴＣＣＡ－３′）．
８４３１
第６期 　　 杨昊，等：拟南芥中参与盐胁迫应答的基因Ａｔ１ｇ１４２６０的功能初探 　
２．２．５　盐胁迫处理　在预实验中，将拟南芥野生
型与突变体的种子在加有 １００ｍＭ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，
１０μＭ　ＡＢＡ，２５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上做表型实
验，结果只有在 ＭＳ＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ的平板上观察
到了野生型与突变体表型的明显差异．因此主要对
盐胁迫下的拟南芥野生型与突变体进行表型实验
分析．
将同一时期收取的拟南芥野生型和突变体
ａｔ１ｇ１４２６０的种子春化后消毒洗净，播种于 ＭＳ平
板，在 ＭＳ平板生长５ｄ后，分别将幼苗移苗至 ＭＳ＋
１２５ｍＭ　ＮａＣｌ和 ＭＳ＋１４５ｍＭ　ＮａＣｌ和空白对照的
ＭＳ培养基平板上，在组织培养室中培养１０ｄ，观察
苗期生长情况及根长差异并拍照，实验重复３次．
将处理后的种子播种于 ＭＳ平板，在 ＭＳ平板
生长５ｄ后，分别将、幼苗移苗至 ＭＳ＋１２５ｍＭ
ＮａＣｌ和 ＭＳ＋１４５ｍＭ　ＮａＣｌ和空白对照的 ＭＳ培
养基平板上，在组织培养室中培养１０ｄ，观察苗期
生长情况及根长差异并拍照，实验重复３次．
２．２．６　数据分析　萌发率试验、幼苗生长试验及
根长试验均使用软件ＳＰＳＳ分析数据的统计学差
异，ｘ２ 检验Ｐ＜０．００１，统计学上有明显差异，所有
试验均重复３次以上．
２．２．７　构建融合载体Ａｔ１ｇ１４２６０－ＰＢｉ２２１－ＧＦＰ定
位目标基因　构建融合载体Ａｔ１ｇ１４２６０－ＰＢｉ２２１－
ＧＦＰ．利用植物原生质体试剂盒提取正常生长３ｗ
的拟南芥野生型幼苗的原生质体．在已构建好的融
合载体转入原生质体，在共聚焦显微镜下观察荧光
的位置．
３　结果与分析
３．１　Ａｔ１ｇ１４２６０的表达谱分析
拟南芥基因Ａｔ４ｇ１９４３０位于１号染色体上，
全长 ７９８ｂｐ．利 用 ＭＥＧＡ 软 件 的 分 析 基 因
Ａｔ１ｇ１４２６０，发现其与本实验室之前发现的耐热基
因Ａｔ３ｇ４７５５０（ＴＲ１）具有高度同源性（图１－Ａ）．相
关基因序列中的调控元件分析（图１－Ｂ），蛋白质多
重序列比较（图１－Ｃ）也显示了他们之间的联系．
３．２　野生型拟南芥在非生物胁迫下的表达情况
将在 ＭＳ培养基平板上生长５ｄ后的幼苗分别
移至 ＭＳ，Ｍｓ＋３００ｍＭ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ，Ｍｓ＋１０μＭ
ＡＢＡ，ＭＳ＋２５０ｍＭＮａＣｌ的平板上处理８ｈ，利用
ＲＴ－ＰＣＲ技术分析目的基因表达量的变化．从图２
可以看出，目标基因Ａｔ１ｇ１４２６０在受到ＮａＣｌ的胁
迫时，表达量对比正常情况下的拟南芥明显上升．
说明基因Ａｔ１ｇ１４２６０受到ＮａＣｌ的诱导．
３．３　Ａｔ１ｇ１４２６０纯合突变体的获得和鉴定
为了分析基因Ａｔ１ｇ１４２６０的功能，本实验室
通过ＡＢＲＣ购得 Ｔ－ＤＮＡ插入株系，使用目标基
因两端特异性引物ＬＰ与ＲＰ扩增后，野生型中有
条带，鉴定的突变体无条带，而使用ＲＰ和突变体
特异性引物ＬＢ１作为引物扩增时突变体中有特异
条带，而野生型中没有出现（图３－Ａ）．转录水平检
测，用基因特异的引物，在野生型中能扩增出预
期大小的条带，而在突变体中则没有（图３－Ｂ）．这
些结 果 说 明 Ｔ－ＤＮＡ 的 插 入 使 得 突 变 体 中
Ａｔ１ｇ１４２６０基因完全被敲除．图中ｃｏｌ表示拟南芥
野生型，ｍｕｔ表示拟南芥突变体ａｔ１ｇ１４２６０．
３．４　盐胁迫条件下突变体ａｔ１ｇ１４２６０萌发率表型
分析
将春化３ｄ后的拟南芥野生型与突变体的种
子播于正常 ＭＳ培养基下，发现萌发率无明显差
异，播种７ｄ后的终萌发率均为１００％．而在加有
５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ 平 板 上，拟 南 芥 突 变 体
ａｔ１ｇ１４２６０的萌发率明显低于正常的拟南芥野生
型，播种７ｄ后，拟南芥野生型的终萌发率为８４％
而突变体ａｔ１ｇ１４２６０仅为７１％ （图４－Ａ，左）．为
了进一步验证，在加有７５０ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ平板
上重复试验，结果表现出更大的差异，野生型在
１ｗ后的终萌发率为６８％，而突变体的仅为３４％
（图４－Ａ，右）．表明突变体种子对盐胁迫更为敏
感．
３．５　盐胁迫条件下突变体ａｔ１ｇ１４２６０幼苗生长表
型分析
为了进一步研究Ａｔ１ｇ１４２６０在植物苗期生长
中起到的作用，将在 ＭＳ平板上生长５ｄ的幼苗移
至 ＭＳ平板、加有１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的ＭＳ平板及加有
１４５ｍＭ　ＮａＣｌ的平板上生长１０ｄ后，可以看出拟
南芥野生型和突变体在正常的 ＭＳ平板上没有显
示出明显的生长差异（图５－Ａ，左）．而在加有
１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ 平板上可以看出突变体
ａｔ１ｇ１４２６０的生长情况明显差与拟南芥野生型，并
出现枯萎、变黄的状况，而野生型的生长基本正常
（图５－Ａ，中）．这一差别在加在加有１４５ｍＭ　ＮａＣｌ
的 ＭＳ平板上显得更加明显，突变体ａｔ１ｇ１４２６０
的生长受到严重抑制，枯萎、变黄的特征非常明
显，而同样情况下的拟南芥野生型则能基本正常
生长（图５－Ａ，右）．同时观察三种生长环境下的拟
南芥野生型和突变体的根长差异， 可以看出突变
９４３１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
图１　Ａｔ１ｇ１４２６０与Ａｔ３ｇ４７５５０（ＴＲ１）同源性分析
Ａ．Ａｔ１ｇ１４２６０与Ａｔ３ｇ４７５５０（ＴＲ１）进化树关系图；Ｂ．Ａｔ１ｇ１４２６０与Ａｔ３ｇ４７５５０（ＴＲ１）及相关基因序列中的调控元件分析；
Ｃ．与ＴＲ１同源的四个基因的蛋白质多重序列比较
Ｆｉｇ．１　Ｇｅｎｅｓ　Ａｔ３ｇ４７５５０ａｎｄ　ｇｅｎｅ　Ａｔ１ｇ１４２６０（ＴＲ１）ｈａｓ　ａ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ
Ａ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ；Ｂ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ
图２　ＲＴ－ＰＣＲ分析基因Ａｔ１ｇ１４２６０及相关基因受到非
生物胁迫后的表达情况
Ｆｉｇ．２　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓＡｔ１ｇ１４２６０ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｌａｔ－
ｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ
体ａｔ１ｇ１４２６０的根长明显短于拟南芥野生型（图５－Ａ，５－
Ｂ）．进一步证实突变体种子不仅在萌发阶段，而且在
萌发后生长阶段也对盐胁迫处理超敏感．表明
Ａｔ１ｇ１４２６０在拟南芥盐胁迫应答过程中发挥重要作用．
３．６　Ａｔ１ｇ１４２６０的亚细胞定位
为进一步研究 Ａｔ１ｇ１４２６０亚细胞定位，采用
ＧＦＰ作为报告基因构建ｐＢｉ２２１－Ａｔ１ｇ１４２６０－ＧＦＰ载
体．将生长３ｗ的幼苗使用试剂盒制作原生质体，将
构建好的载体转入，通过共聚焦显微镜观察观察到
Ａｔ１ｇ１４２６０－ＧＦＰ的荧光集中在细胞核的位置（图６）．
图３　突变体ａｔ１ｇ１４２６０的纯合分析鉴定
Ａ．ＤＮＡ水平下检测突变体ａｔ１ｇ１４２６０的纯合性分析；
Ｂ．转录水平下突变体ａｔ１ｇ１４２６０的纯合分析
Ｆｉｇ．３　Ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａ．ＤＮＡ　ｌｅｖｅｌｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ａ－
ｎａｌｙｓｉｓ；Ｂ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｌｅｖｅｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｈｏ－
ｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ
０５３１
第６期 　　 杨昊，等：拟南芥中参与盐胁迫应答的基因Ａｔ１ｇ１４２６０的功能初探 　
图４　拟南芥野生型和突变体ａｔ１ｇ１４２６０在ＮａＣｌ胁迫下
萌发率的对比
Ａ．加有５０ｍＭ　ＮａＣｌ和７５ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ平板上，拟南芥
野生型和突变体ａｔ１ｇ１４２６０的萌发情况；Ｂ，大量拟南芥野生型
和突变体ａｔ１ｇ１４２６０种子萌发情况统计，星号表示ｘ检验，对比
野生型而言生存率显著降低
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｏｆ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ
Ａ．Ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕ－
ｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｉｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　５０ｍｍ　ＮａＣｌ　ａｎｄ　７５ｍｍ　ＮａＣｌ；
Ｂ．ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｏｆ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ－
ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０ｓｅｅｄ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗ－
ｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ｔｈａｎ　ＷＴ　ｐｌａｎｔｓ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙχ２　ｔｅｓｔ（Ｐ＜０．００１）
图５　拟南芥野生型与突变体ａｔ１ｇ１４２６０苗期生长情况
对比
Ａ．为正常生长５天后移至加有１２５ｍＭ　ＮａＣｌ（中）１４５ｍＭ
ＮａＣｌ（右）和的 ＭＳ平板上的拟南芥野生型与突变体ａｔ１ｇ１４２６０
生长差异，左图为对比；Ｂ．三种环境下生长的拟南芥野生型和
突变体ａｔ１ｇ１４２６０根长统计，星号表示Ｘ检验，对比 ＷＴ型而
言生存率显著降低
Ｆｉｇ．５　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔ１ｇ１４２６０
Ａ．Ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆｏｒ　ｆｉｖｅ　ｄａｙｓ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｅｄｌｉｎｇ
ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　１２５ｍＭ　ＮａＣｌ　ＭＳ（ｍｉｄｄｌｅ），１４５ｍＭ　ＮａＣｌ　ＭＳ（ｒｉｇｈｔ）
ａｎｄ　ＭＳ（ｌｅｆｔ）；Ｂ．Ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅｓ　ｔｈａｎ　ＷＴ　ｐｌａｎｔｓ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ｂｙ　ｘ２　ｔｅｓｔ（Ｐ＜０．００１）
图６　基因Ａｔ１ｇ１４２６０的亚细胞定位．白线约代表１０μｍ
Ｆｉｇ．６　ｓｕｂｃｅｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｔ１ｇ１４２６０．Ｂａｒ＝１０μｍ
４　讨　论
众所周知，较高浓度的盐胁迫甚至会直接导
致植物的死亡．盐胁迫降低了植物的光合作用速
率、减少了能量的供给、抑制了植物的生长发育［９］，
可以说几乎所有与植物生长相关的所有过程都收
到了盐胁迫的影响［１０］．
本研究选取受盐胁迫显著诱导的Ｒｉｎｇ　ｆｉｎｇｅｒ基
因Ａｔ１ｇ１４２６０，研究其在受到盐胁迫时表达量的变
化．并进一步研究Ａｔ１ｇ１４２６０纯合突变体在不同浓
度的ＮａＣｌ胁迫下，种子萌发率、幼苗生长情况及侧
根生长情况的差异．并在植物细胞中定位该基因．
在组培实验中明显看出在正常 ＭＳ培养基下
的拟南芥野生型和突变体ａｔ１ｇ１４２６０的萌发率、生
长及根长情况基本一致．而在存在ＮａＣｌ胁迫时野
生型和突变体的萌发、生长及根长均受到抑制，但
是相比野生型，突变体受到抑制的效果更加明显，
表现为萌发率低于野生型；幼苗生长过程过更容
易出现枯萎、变黄的症状；根长明显短于野生型．
这些结果都说明了缺失了基因Ａｔ１ｇ１４２６０的突变
体对盐胁迫更加敏感，符合ＲＴ－ＰＣＲ结果的预期．
根长的实验则暗示了基因Ａｔ１ｇ１４２６０可能与拟南
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　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
芥侧根的生长有关．
近年来大量研究表明ＲＩＮＧ结构是一种广泛
存在于植物体内的保守结构域，其在植物的非生
物胁迫应答中发挥着重要作用．而含有ＲＩＮＧ结
构域的基因大多具有Ｅ３连接酶的活性，泛素Ｅ３
连接酶在蛋白的翻译后修饰中起着至关重要的作
用，在植物体内Ｅ３连接酶参与多种生物和非生物
胁迫应答［１１，１２］．本实验的研究对象含有一个
Ｃ４ＨＣ３的ＲＩＮＧ结构域，又涉及拟南芥盐胁迫应
答的过程，但实验未能完成体外泛素化实验，尚
无法证明其具有Ｅ３连接酶活性，故推测其可能通
过泛素化的途径来降解目标蛋白从而参与到盐胁
迫应答信号通路中．此推断需进一步实验证明．
参考文献：
［１］　Ｆｌｏｗｅｒｓ　Ｔ　Ｊ，Ｙｅｏ　Ａ　Ｒ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｒｅｓｉｓｔ－
ａｎｃｅ　ｉｎ　ｃｒｏｐ　ｐｌａｎｔｓ．［Ｊ］．Ａｕｓｔ　Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｇｙ．
１９９５，２２：８７１．
［２］　Ｌｉｕ　Ｊ，Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ａ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｅｎｓｏｒ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０：
１９４３．
［３］　Ｑｉｕ　Ｑ　Ｓ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｌｉｐｉｄ
ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｗｈｅａｔ
ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｂｏｔａｎｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ，１９９９，４１：２１．
［４］　刘春，李玉中，彭晚霞，等．拟南芥耐盐、耐旱和抗
寒的分子机理及其利用［Ｊ］．生物技术通报，２０１１：
１２：６．
［５］　Ｈｕａｎｇ　Ｊ，Ｓｕｎ　Ｓ　Ｊ，Ｘｕ　Ｄ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｏｌｅｒ－
ａｎｃｅ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｔｏ　ｃｏｌｄ，ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ
ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｅｎ－
ｃｏｄｅｓ　ｔｈｅ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＺＦＰ２４５［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ－
ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．
２００９，３８９（３）：５５６．
［６］　Ｃｈｅｎｇ　Ｍ　Ｃ，Ｈｓｉｅｈ　Ｅ　Ｊ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＲＧＬＧ２，
Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ　ａｓ　ａ　ＲＩＮＧ　Ｅ３Ｌｉｇａｓｅ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ
ＡｔＥＲＦ５３ ａｎｄ　Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ
Ｄｒｏｕｇｈｔ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｊａｎ－
ｕａｒｙ．２０１２，１５８：３６３．
［７］　Ｑｉｎ　Ｆ，Ｓａｋｕｍａ　Ｙ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＤＲＥＢ２Ａ－Ｉｎｔｅｒａｃ－
ｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｓ　ＲＩＮＧ　Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅｓ　ａｎｄ
Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　Ｒｅｇｕｌａｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｒｏｕｇｈｔ　Ｓｔｒｅｓｓ－Ｒｅｓｐｏｎ－
ｓｉｖｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００８，
２０：１６９３．
［８］　Ｂｕ　Ｑ　Ｙ，Ｌｉ　Ｈ　Ｍ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ
Ｅ３Ｌｉｇａｓｅ　ＲＨＡ２ａＩｓ　ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ
Ａｂｓｃｉｓｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｓｅｅｄ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄ　Ｅａｒｌｙ　Ｓｅｅｄｌｉｎｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ－
ｏｇｙ，２００９，１５０：４６３．
［９］　Ｍｕｎｎｓ　Ｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　ｓａｌｉｎｅ　ｓｏｉｌｓ：ｓｏｍｅ　ｄｏｇｍａｓ　ａｎｄ　ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，１９９３，１６：１５．
［１０］　Ｐａｒｉｄａ　Ａ　Ｋ，Ｄａｓ　Ａ　Ｂ．Ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓａｌｉｎｉｔｙ
ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓａｆｅ，
２００５，６０：３２４．
［１１］　Ｌｅｅ　Ｊ　Ｈ，Ｋｉｍ　Ｗ　Ｔ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｉｇ－
ｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌ，２０１１，３１：２０１．
［１２］　Ｄｒｅｈｅｒ　Ａ，Ｃａｌｉｓ　Ｊ．Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ，ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｂｏｔ，２００７，９９：７８７．
２５３１