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第 51卷 第 2期 2006年 1月 论 文
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基因转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接
体内快速双向传递
李 明 姜世玲 王幼群 刘国琴∗
(植物生理学与生物化学国家重点实验室, 中国农业大学生物学院, 北京 100094. * 联系人, E-mail: liu@cau.edu.cn)
摘要 RNA 干扰(RNAi)是引起生物体基因转录后沉默的新技术之一, 已成功用于基因功能研究. 利用
拟南芥动蛋白异型体KatB和KatC两个基因上共有的一段同源编码序列(168 bp)构建了能导致目标基因
KatB和 KatC双基因转录后沉默的 DEX (dexamethazone)诱导性 RNAi载体. RT-PCR和 Northern blot结
果显示, 转基因拟南芥纯合体植株(简称RNAi型植株)经DEX诱导后, KatB和KatC的mRNA逐渐减少,
表明这两个基因发生了转录后沉默作用. 用改进后的简易方法将 RNAi 型与野生型拟南芥植株进行高
效率嫁接, 对砧木和接穗中目标基因 mRNA变化进行了半定量 RT-PCR检测. 结果表明, 无论用 RNAi
型植株作为砧木或接穗, DEX诱导产生的基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中KatB和KatC
mRNA 的减少, 说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递; 与已报道的基因沉
默信号在烟草嫁接体内传递速度相比, 拟南芥基因沉默信号的传递更为迅速.
关键词 拟南芥 RNAi 嫁接 沉默信号传递
RNA 介导的基因沉默 (RNA-mediated gene si-
lencing)是一种由双链 RNA 信号引发同源 mRNA 降
解的基因转录后沉默现象[1~3], 普遍存在于真菌、动
物、植物中 [2~6]. 其基本原理是: 双链 RNA 被一种
RNase Ⅲ类似酶Dicer剪切为 21~25 nt的小分子干扰
RNA (small interfering RNA, siRNA)[7], 由 siRNA引
导一多亚基核酸内切酶(RISC)特异地剪切与该双链
RNA同源的 mRNA 序列[8]. RNA干扰(RNA interfer-
ence, RNAi)在植物中被称作基因转录后沉默 (post-
transcriptional gene silencing, PTGS)或共抑制 (co-
suppression)现象 , 这种基因沉默现象被认为是植物
自身调节基因表达的一种有效手段[9~11]. 通过转基因
向植物体内引入特异的 RNA 沉默信号, 破坏目标基
因的表达 , 目前已广泛用于基因功能研究和生长发
育机理分析 [12~14]. 利用高等模式植物嫁接深入研究
RNA 沉默信号的传递方向和速度, 对揭示转录后基
因沉默机理具有重要理论意义 , 同时又可为研究高
等植物的生长发育及其调控机理提供有广泛应用价
值的实验材料.
近年来的研究表明, 植物中的 RNA 沉默信号不
仅可以在细胞质和细胞核之间、通过细胞胞间连丝在
相邻细胞之间进行短距离传递[7,15,16], 而且可以通过
韧皮部进行长距离运输 [16~20]. 农杆菌注射和基因枪
转化研究结果都显示 , 植物沉默信号的传递具有系
统化的特点, 在一个叶片上产生的沉默信号可在 2~3
d内传递到相邻的叶片中[3,16,21]. Palauqui等人[19]用烟
草嫁接实验证明, 沉默信号只能单方向传递, 即从砧
木向接穗传递. 后来, 多数研究者又认为, 沉默信号
在烟草嫁接体内可以双向传递 , 但两个方向的传递
效率不同 , 从砧木向接穗方向传递的效率高于从接
穗向砧木的传递[16,22].
模式植物拟南芥因其遗传背景清楚, 生长周期
短, 转基因容易, 加之大量商品突变体的存在, 目前
已被广泛用作高等植物生长发育信号调控的研究材
料. 最近, Turnbull 等人[23]成功地实现了拟南芥的嫁
接 , 为快速分析植物地上部分和地下部分之间生长
发育信号的长距离传递特征提供了有益的参考方法.
但在实际操作中 , 由于适于嫁接期的拟南芥植株个
体很小, 使嫁接操作非常困难, 加之该方法需要使用
特殊的套管, 使得在一般实验室难以采纳应用. 本研
究以两个高同源性动蛋白(kinesin)异型体基因(KatB,
KatC)为目标, 通过构建 DEX诱导性表达载体和转基
因操作, 获得了能使这两个目标基因的 mRNA 都发
生降解的转基因拟南芥植株(本文称为 RNAi 植株);
以此植株为材料, 用改进的、简便易行的嫁接方法,
获得了 RNAi型植株与野生型植株的嫁接体, 并分析
了 RNA 干扰产生的沉默信号在植物体内的长距离传
递情况. 结果证明, 基因转录后沉默信号可以跨越嫁







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接面在拟南芥嫁接体内进行长距离快速双向传递 ,
有效剪切野生型砧木或接穗中 KatB 和 KatC 的
mRNA.
1 材料与方法
(ⅰ ) 植物材料 . 拟南芥 (Arabidopsis thaliana,
Columbia ecotype, Col-0)种子先用 70%乙醇预消毒 1
min, 再用 1%次氯酸钠(有效氯含量)表面消毒 10 min.
无菌水冲洗后, 播种于 MS-琼脂固体培养基上(含 3%
蔗糖, 0.8% 琼脂, pH 5.7), 先在 4℃黑暗处春化 2~3 d,
然后在 22℃, 5000 lux光照强度及 12 h光照条件下培
养. DEX(15 µmol/L)诱导处理采取浸根和叶面喷施方
式. 处理后 24 h分别取根和叶, 液氮速冻后置−80℃
备用.
(ⅱ) RNAi载体构建及转基因拟南芥植株的筛选.
KatB 和 KatC 是拟南芥两个动蛋白(kinesin)异型体基
因, 它们编码的氨基酸同源性高达 74%. 通过 NCBI
网站经序列对比(blastn)发现, KatB基因上 5′端编码区
第一个外显子序列(168 bp)与 KatC 序列同源性达
85%(图 1(a)), 而与拟南芥的其他所有基因同源性都
低于 10%, 选用 KatB 基因这段 168 bp 外显子作为
RNAi 构建的目的序列 , 设计上游引物 P284L(5 ′-
GCCTCGAGATGGTTGGGGAAATGACG-3′, 引入
XhoⅠ切点)和下游引物 P284R(5′-GCTCTAGACC-
TGCAAAGATAACCCATTTG-3′, 引入 XbaⅠ切点),
以基因组 DNA为模板, 利用 PCR扩增了包含 168 bp
外显子序列及相邻的 116 bp 内含子序列在内的一段
DNA, 连入 pGEM-T easy 载体(Promeg 产品), 构成
pT-KatB284 质粒 . 利用上游引物 P168L(5 ′-GC-
ACTAGTATGGTTGGGAAATGACG-3′, 引入 SpeⅠ切
点)和下游引物 P168R (5′-GCTCTAGACCTTGTAATT-
GTACTTGCTCTTG-3′, 引入XbaⅠ切点), PCR扩增168
bp 外显子序列, 连入 pGEM-T easy 载体, 构建 pT-
KatB168质粒. 将用 SpeⅠ/XbaⅠ双酶切 pT-KatB168质
粒所得到的 168 bp片段, 连入预先经 SpeⅠ/XbaⅠ酶切
的 pT-KatB284质粒, 得到 pT-284-168质粒. 用 XhoⅠ/
SpeⅠ酶切 pT-284-168质粒后回收 452 bp的目的片段,

图 1 用于构建 RNAi的目标片段序列及双元载体 pTA-RNAi表达盒示意图
(a) 动蛋白 KatB一段外显子序列(168 bp)与其异型体 KatC序列同源性比较, 两者同源性高达 85%. 选用 KatB的这段外显子序列
及其 116 bp 内含子序列用作构建 RNAi 载体的目的片段, 以期使 KatB和 KatC双基因发生沉默. (b) 利用 DEX诱导性双元载体
pTA7002构建的 RNA干扰载体 pTA-RNAi示意图








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插入预先经 XhoⅠ/SpeⅠ酶切的诱导性植物表达载体
pTA7002 (Nam-Hai Chua实验室惠赠), 构建成用于拟
南芥转基因的 DEX 可诱导的双元表达载体
pTA-RNAi(图 1(b)), 并转入农杆菌 C58C1. 同时将原
始植物表达载体 pTA7002 也转入农杆菌 C58C1, 用
作对照. 所用分子生物学操作方法参照文献[24].
农杆菌介导的拟南芥转化采用花芽浸泡法 [25],
利用潮霉素(Hygromycin)进行转基因植株筛选. 对抗
性植株进行 DEX 诱导后, 应用半定量 RT-PCR 和
Northern blot方法检测抗性植株中KatB和KatC mRNA
的敲减(knock-down)效果, 以此鉴定转基因植株.
(ⅲ) RNAi 型拟南芥和野生型拟南芥嫁接. 参
照 Turnbull 等人[23]的嫁接方法, 但对嫁接套管进行
了重新选材和制作: 切取 20 µL移液器取液头尖端长
4~5 mm 的部分, 用刀片将小管从中间劈分, 再用细
棉线系紧、灭菌后, 用作嫁接套管. 经过处理的套管,
在嫁接体成活后, 可以很方便的去除.
选取在培养基上生长 10~12 d 的幼苗进行嫁接.
采用两种嫁接组合形式: (1) I/W型嫁接: 野生型拟南
芥作砧木, RNAi型转基因拟南芥作接穗; (2) W/I型
嫁接: RNAi 型拟南芥作砧木, 野生型拟南芥作接穗.
整个操作在无菌条件下进行, 具体嫁接方法如图 4(a)
所示 . 用锋利刀片将幼苗从子叶胚轴中部快速横向
切断, 先在砧木上套上套管, 之后将接穗迅速放入套
管中, 尽量使接穗和砧木的切面相吻合. 嫁接后的幼
苗在培养基上继续生长 2~3 周后可移入培养土中生
长或进行 DEX诱导.
(ⅳ) 嫁接愈合处的石蜡切片及染色. 取嫁接愈
合部位, 经 FAA(甲醛-醋酸-酒精溶液)固定、乙醇梯
度脱水、浸蜡、包埋后进行常规组织切片, 切片厚度
为 9 µm, 切片经脱蜡及番红、固绿双染色后, 用加拿
大树胶封片. 显微镜观察并照相.
(ⅴ) KatB和 KatC mRNA变化的半定量 RT-PCR
检测. 拟南芥叶片和根的总 RNA提取采用 Trizol试
剂(Invitrogen 产品), 具体步骤参照产品说明书进行.
提取的总 RNA用一定量的 DNase (RNase free)消化,
然后用基因特异引物以总 RNA为模板进行 PCR反应,
经电泳检测无任何扩增带, 说明 RNA 样品中基因组
DNA 已经去除干净. 样品经严格定量后, 取 2 µg 利
用 Promega ImProm-ⅡTM逆转录酶, 以 Oligo dT(16)
作为引物进行逆转录 , 操作方法参照说明书 . 参照
Schönknecht 等人[26]方法, 以拟南芥 actin 8 基因为
RT-PCR 反应内标, 内标引物为 ACTfew (5′-GGTGAT-
GGTGTGTCT-3′)和 ACTrev (5′-ACTGAGCACAATG-
TTAC-3′), 目的片段长度 430 bp; KatB基因的特异引物
为 PB1 (5′-GTTTGCAAGCTGCCATT-3′)和 PB2 (5′-
CTAACGGCCTGGCGTTAAC-3′), 目的片段长度 712
bp; KatC 基因的特异引物为 PC1 (5′-GAAAAGGCA-
CAAGCTGGTCTC-3′)和 PC2 (5′-GGTTTGATGTTAGT-
CTGCCTAC-3′), 目的片段长度704 bp. 半定量RT-PCR
反应程序: 94℃预变性 4 min; 94℃变性 40 s, 60℃复性
40 s, 72℃延伸 1 min, 28个循环; 72℃延伸 10 min. 本研
究中所有 RT-PCR结果均经过 3次自 RNA提取开始独
立的重复实验, 结果一致.
(ⅵ) KatB 和 KatC mRNA 变化的 Northern blot
检测. DEX诱导 RNAi型拟南芥幼苗(20 d龄)后, 分
12和 24 h分别取样. 总 RNA提取后, 按每个泳道上
样 20 µg 进行 1%甲醛变性凝胶电泳, 采用毛细管转
移法转移到带正电荷的尼龙膜上(Amersham 产品).
分别选用[α-32P]dCTP标记的 KatB和 KatC cDNA的
3′非翻译区序列(196 和 279 bp)用作探针. 探针标记
采用 Ready-to-go DNA Labelling Kit (Pharmacia), 具
体操作按照产品说明进行. 探针杂交方法按 Church
等人[27]方法进行.
2 结果
2.1 RNAi型植株中双链互补RNA的转录使内源KatB
和 KatC mRNA发生降解
本研究所用双元载体 pTA7002 是一诱导性植物
表达载体, 目的基因的转录受外源诱导剂 DEX 的调
控[28]. 利用花芽浸泡法转化拟南芥, 经抗性筛选和继
代培养共获得 30 个纯合体株系. 对 3 周龄的 RNAi
型纯合体植株进行DEX诱导后, 应用半定量 RT-PCR
和 Northern blot对 KatB和 KatC mRNA变化情况进
行了检测. RT-PCR的结果(图 2)显示, DEX诱导 24 h
后, RNAi型株系内 KatB和 KatC mRNA与对照植株
(只转空载体)相比都明显减少. Northern blot 分析也
有同样的结果(图 3): 与诱导前及野生型拟南芥相比
较, RNAi-17纯合体后代经DEX诱导 12 h后, 其KatB
和 KatC mRNA 都发生了降解; 诱导 24 h 后 mRNA
的减少已非常明显. 上述结果表明, 我们得到了能产
生 RNA干扰信号的转基因植株.







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图 2 RNAi型植株 DEX诱导后 KatB/KatC mRNA变化的
半定量 RT-PCR检测
经 DEX 诱导后, Line-17, line-83 两个 RNAi 型株系的 KatB 和 KatC
mRNA与对照植株相比明显减少. Line-17 和 line-83, RNAi型植株不
同株系的纯合体后代; 对照, 只转空载体 pTA7002所获得的纯合体后
代; +, DEX 诱导 24 h; −, 不用 DEX 诱导; Actin8, 拟南芥肌动蛋白
actin基因, 内标


图 3 RNAi型植株经 DEX诱导后 KatB/KatC mRNA变化
的 Northern blot检测
与诱导前及野生型拟南芥相比较, RNAi 型植株经 DEX 诱导 24 h 后,
KatB和 KatC mRNA都发生了非常明显的降解. Line-17, RNAi型株系
的纯合体后代; 对照, 只转空载体 pTA7002 所获得的纯合体后代; +,
DEX诱导 12 h; ++, DEX诱导 24 h; −, 不用 DEX诱导. 28 S和 18 S
rRNA 为样品用量参照

2.2 利用简易方法获得了模式植物拟南芥嫁接体植
株
为研究 RNA干扰信号在拟南芥植株体内的传递
情况, 将拟南芥野生型与 RNAi型植株分别互为接穗
和砧木, 在子叶胚轴处进行了的嫁接. 在按 Turnbull
等人[23]的方法嫁接时, 尝试用实验室常用的 20 µL移
液器取液头的尖端(4~5 mm)作为套管来固定接穗与
砧木交接处(图 4(a)), 并成功进行了嫁接. 在 130 株
嫁接试验中, 共获得成功嫁接体 41 株, 嫁接苗的成
活率高达 30%以上. 由于预先劈分的塑料套管在嫁
接植株成活后容易去除 , 因此不会影响嫁接体植株
的正常生长和发育(图 4(b)). 经对嫁接面的组织切片
观察发现, 虽然嫁接面附近的细胞生长不太规则, 但
已完全愈合接通(图 4(c)).
2.3 RNA干扰信号能在拟南芥嫁接体内双向快速传
递
对嫁接植株进行 DEX 诱导, 24 h 后对接穗和砧
木分别取样(均不包括嫁接点), 采用半定量 RT-PCR
的方法来检测KatB和KatC mRNA的变化情况. 如图
5显示, RNAi型植株(简称为 I)为接穗、野生型植株(简
称为W)作砧木的植株(I/W型), DEX诱导 24 h后, 不
仅接穗(叶片)中 KatB和 KatC的 mRNA快速减少, 而
且野生型砧木(根)中这两个基因的 mRNA 也迅速减
少; 用 RNAi 型植株为砧木、野生型植株作接穗(W/I
型)也得到类似结果. 上述结果表明, 在 RNAi型植株
的细胞内经诱导产生基因沉默信号后 , 该信号能在
砧木和接穗间进行长距离快速传递, 24 h即能检测到
被传递的信息; 并且传递的方向是双向的, 既可从砧
木到接穗, 也可从接穗到砧木.
3 讨论
本研究以模式植物拟南芥为材料 , 通过创建动
蛋白异型体KatB/KatC双基因沉默的RNAi型纯合体,
及对 RNAi 型/野生型嫁接体植株中目标基因 mRNA
的分析 , 证明经诱导产生的基因转录后沉默信号可
以通过嫁接面进行长距离快速双向传递 . 利用植物
嫁接技术对基因沉默信号系统化传递进行研究 , 目
前已在烟草 [16,21]和南瓜 [20]嫁接体中有较多的报道 ,
但至今未见有关基因沉默信号在拟南芥嫁接体内传
递的报道.
研究表明, RNA干扰并非细胞自发的行为[18]. 在
植物和线虫材料中 , 它可以在一定部位被诱导而后
传至远离位点, 因此推测有可移动的信号和相应的
调节途径存在 [18]. 植物中担当信号的分子是何种形
式的RNA目前尚未最终确定[3]. 近年来, 利用不同基
因型烟草相互嫁接研究 RNA 沉默信号传递的方向和
速度, 已有一些报道[16,21,29], 但有关传递的方向和速







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图 4 嫁接方案(a)和嫁接后植株长势(b)及嫁接面显微观察(c)
(a) 拟南芥嫁接方案示意图. 选取在培养基上生长 10~12 d 的幼苗, 从子叶胚轴中部快速横向切断, 将制备好的套管套在砧木上,
之后将接穗迅速放入套管中, 尽量使接穗和砧木的切面相吻合. (b) 嫁接体植株(5 周龄, 左)与同龄野生植株(右)长势无明显区别;
(c) 嫁接成活植株嫁接处局部近照(左)及嫁接面的纵向切片显微照片图(右), 显示嫁接部位发育良好


图 5 DEX诱导后嫁接体中 KatB和 KatC mRNA半定量
RT-PCR检测
无论用 RNAi型植株作为砧木还是接穗, DEX诱导产生的基因沉默信
号均能导致相应野生型接穗或砧木中 KatB 和 KatC mRNA 的减少.
W/W, 野生型与野生型拟南芥的嫁接体, 用作对照; I/W, RNAi 型(接
穗)/野生型(砧木); W/I, 野生型(接穗)/RNAi 型(砧木). 用来嫁接的
RNAi型植株均为 Line-17 纯合体后代; DEX诱导时间: 24 h. 实验设 3
次重复, 结果相同

率, 尚存在争议.
本研究 RT-PCR 结果表明, DEX 诱导产生的基
因沉默信号不仅使RNAi型拟南芥自身体内的目标基
因转录产物发生降解 , 并且能通过嫁接面在砧木和
接穗间进行传递 , 使野生型拟南芥根或叶片中的目
标 mRNA 也发生降解. 这一结果与用烟草嫁接实验
的结果相类似[16,21,29]. 应用农杆菌注射法和基因枪法
研究表明 , 沉默信号从一个叶片传递到邻近的叶片
需 2~3 d[16,21]; Mallory等人[30]的烟草嫁接实验结果表
明 , 来自砧木的由于转正义基因而产生的沉默信号
需要 4 d 的时间才能传递到接穗中. 相比之下, 由于
转反义基因而产生的沉默信号从砧木传递到接穗则
需要 7 d的时间[29]. 本研究实验结果证明, DEX仅诱
导 24 h后, 由双链互补 RNA转录产生的基因沉默信
号就已在砧木和接穗之间进行了长距离运输(图 5),
这一传递效率远远快于沉默信号在烟草嫁接体内的
传递 . 这表明不同种类植物间基因沉默信号系统化
传递的速率可能有很大的差异. 另外, 我们推测, 产
生基因沉默信号的不同诱因(转正义基因、转反义基
因或转双链互补 RNA)可能也是造成基因沉默信号传
递速率不同的原因之一.
我们的结果还表明, 引发 RNA 干扰的信号物质
在嫁接体内的传递是双向的. 无论砧木是 RNAi型的
或接穗是 RNAi型的嫁接体植株, DEX诱导后, 相应
来源于野生拟南芥的接穗或砧木中的 KatB/KatC
mRNA 都发生了特异降解. 这与前人报道的结果有
所不同. Palauqui等人[19]认为沉默信号只能从砧木向
接穗单向传递; 而 Voinnet 等人[16]和 Sonoda 等人[22]
认为, 信号物质在不同方向上的传递速率不同, 向上
传递(从砧木向接穗方向)速度远大于向下传递(从接
穗向砧木方向)的速度. 根据实验的结果(图 5), 我们







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认为沉默信号在拟南芥嫁接体内向上传递和向下传
递的效率无明显差别. 该现象是由于植物种类不同
造成的 , 还是因为不同目标基因引发的干扰信号区
别造成的? 沉默信号分子组成是什么? 沉默信号系
统化传递如何调控? 这些问题有待进一步研究.
研究植物体内长距离信号传递的最理想方法之
一为嫁接, 因为利用突变体、转基因植株及野生型植
株互为接穗和砧木进行嫁接 , 可以有目的的分析某
个特定信号的双向长距离传递和作用规律 . 本研究
利用改进的方法嫁接模式植物拟南芥 , 以实验室常
用的 20 µL 移液器取液头的尖端作为套管来固定接穗
与砧木交接处, 试材廉价, 方法简便, 且嫁接成功率
较高 , 为研究高等植物生长发育调控规律提供了更
有效的研究手段.
致谢 感谢 Nam-Hai Chua 博士(Rockefeller University)惠
赠诱导性植物表达载体 pTA7002. 本工作为国家自然科学
基金(批准号: 30170457, 30421002, 30370708)资助项目.
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(2005-09-14收稿, 2005-11-24接受)