全 文 ：农业生物技术学报，2011年，第 19卷，第 1期，第 51~56页
Journal of Agricultural Biotechnology, 2011, Vol.19, No.1, 51~56
研究报告
A Letter
拟南芥 Alpha-dioxygenase 2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及
活性鉴定
魏少华 1 杨宇衡 1 安瑞 1 单丽伟 1 范三红 1, 2 *
1西北农林科技大学生命科学学院，杨凌 712100；2陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100
*通讯作者，sanhong.fan@gmail.com
摘 要 为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana) alpha-dioxygenase 2( AtDOX2)，将其对应基
因 AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体 pPIC9k中，获得重组表达载体 pPIC9k-AtDOX2，将线性化的重组载
体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株 GS115，经 G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化，获得
重组 AtDOX2的高效表达菌株 GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示，0.5%甲醇诱导 96 h重组
蛋白表达量最高，其表达量占胞外总蛋白的 15%。重组 AtDOX2的表观分子量约为 70 kD，经 Ni-NTA柱亲
和层析可获得纯度大于 80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)法测定
结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性，且其活性受 Ca2+和Mg2+激活，受 EDTA、咪唑和 Mn2+抑制；2,4-二
硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示，重组 AtDOX2具有双加氧酶活性，Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作
用。结果说明利用酵母表达系统获得了具有活性的重组 AtDOX2，AtDOX2同时具有过氧化物酶活性和双加
氧酶活性。
关键词 拟南芥，AtDOX2，毕赤酵母，过氧化物酶，α-双加氧酶
Expression, Purification and Activity Identification of Arabidopsis thaliana
Alpha-dioxygenase 2 (AtDOX2)in Pichia pastoris
Wei Shaohua1 Yang Yuheng1 An Rui1 Shan Liwei1 Fan Sanhong1, 2 *
1 College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China; 2 Key Laboratory of Agriculture Molecular
Biology of Shaanxi Province, Yangling 712100, China
* Corresponding author, sanhong.fan@gmail.com
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.01.007
Abstract In order to obtain active Arabidopsis thaliana alpha-dioxygenase 2 (AtDOX2), the encoding sequence
of AtDOX2 was cloned into pPIC9k to obtain pPIC9k-AtDOX2. The recombinant vector was linearized and elec-
trophorated into Pichia pastoris strain GS115. After G418 selection, PCR analysis and optimization of methanol
inducing time，the high level expression strain of GS115/pPIC9k-AtDOX2 was obtained. SDS-PAGE analysis re-
vealed that the expression level of recombinant protein reached to top at 96 h after inducing by 0.5% methanol and
the target protein accounted for 15% of the extracellular total protein. The 70 kD recombinant AtDOX2 was puri-
fied by the Ni-NTA chromatography column, and the purity of recombinant protein was more than 80%. The per-
oxidase activity of the purified protein was tested by the 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
(ABTS) assay, the result showed that the recombinant protein had peroxidase activity, and the peroxidase activity
of AtDOX2 could be activated by Ca2+ and Mg2+ and inhibited by EDTA, imidazole and Mn2+. The α-dioxygenase
activity was analyzed by 2,4-dinitrophenyl hydraz(2, 4-DNP) assay, the result showed that the recombinant protein
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.01.007
基金项目：本研究由国家自然科学基金(No.30300222)和西北农林科技大学青年科学基金(No.QN2009070)共同资助
接收日期：2010-02-04 接受日期：2010-07-08
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1952年，Stumpf等(1952)首次发现花生子叶匀
浆液可将棕榈酸转化为十五烷醛，同时伴随着 CO2
的产生，该氧化脱羧过程发生在脂肪酸的 α-碳原子
上，因而被称之为脂肪酸 α氧化途径，但参与该催化
过程的酶及其基因一直未被分离鉴定。Sanz 等
(1998)通过差异显示技术从烟草中分离到一种病原
诱导的过氧化物酶 (pathogen-induced oxygenase，
PIOX)基因，该基因编码产物与前列腺素代谢相关的
PGHS-1蛋白具有一定相似性。Hamberg等(1999)研
究发现，烟草和拟南芥中的 PIOX能催化脂肪酸 α-
碳双加氧形成 α-过氧羟基脂肪酸，α-过氧羟基脂肪
酸进一步转变为少一个碳原子的脂肪醛或 α-羟基
脂肪酸(图 1)。此后便将 PIOX定义为脂肪酸 α-双加
氧酶(α-dioxygenase，α-DOX)。
根据序列相似性，已发现的植物 α-DOX可分为
两个大的蛋白质家族 α-DOX1 和 α-DOX2。Ham-
berg等(2002)的研究显示，拟南芥 α-DOX1基因受细
菌侵染诱导，在超敏坏死斑周围高丰度表达。如果该
基因表达下调，超敏反应提前并扩大。水稻 α-DOX
基因表达受重金属诱导，且该诱导可能通过茉莉酸
信号途径实现 (Koeduka et al., 2005)。Tirajoh 等
(2005)研究了 α-DOX1基因在番茄根中的表达，发现
番茄 α-DOX1 基因受干旱和盐胁迫诱导。van der
Biezen等(1996)利用转座子标签分离到一个称之为
feebly基因，该基因突变导致番茄植株脆弱矮小叶色
发红、果实皱褶。番茄 FEEBLY属于 α-DOX2家族
成员，该家族成员的基因序列和表达模式与
α-DOX1家族成员显著不同。Bannenberg 等(2009)
研究结果显示,番茄和拟南芥的 α-DOX2基因表达不
受病原和非生物胁迫诱导，它们均可部分恢复番茄
feebly突变体的表型，从而证明植物 α-DOX2基因的
确参与了生长发育调节。此外，α-DOX2在机械损伤
叶片或离体叶片中表达量升高，可能参与了细胞的
凋亡控制过程。
虽然植物 α-DOX2的生物学功能已基本阐明，
但至今为止还未纯化到有生物活性的酶蛋白，而且
其催化特性和机制仍不完全清楚，其空间结构尚未
解析。本研究利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统表达
纯化获得重组的拟南芥 α-DOX2,并对其活性进行了
初步测定分析，为该酶的催化机制和生物学功能研
究提供了基础资料。
1 结果与分析
1.1 AtDOX2酵母表达载体的构建
PCR 扩增获得 1.9 kb 左右的 AtDOX2 基因编
码区，使用重叠延伸 PCR去除 1470 bp处的 EcoRⅠ
位点，并在目标基因上下游引入 EcoRⅠ和 NotⅠ切
点，在终止密码子前引入 6×His标签。修正后的目标
基因双酶切后与 pPIC9k载体连接，最后获得重组质
粒 pPIC9k-AtDOX2。图 2中第 1泳道为目的基因扩
增结果，出现 1.9 kb预期片段；第 2泳道为重组质粒
pPIC9k-AtDOX2 的 EcoRⅠ和 Not Ⅰ双酶切鉴定结
果，出现 1.9和 9.3 kb左右的预期片段，说明目的基
因 AtDOX2已整合入表达载体 pPIC9k。测序结果进
一步确证目标基因已整合入表达载体，且阅读框正
确。第 3泳道为 pPIC9k-AtDOX2载体经 BglⅡ酶切
线性化后，通过胶回收获得的包含目的基因的酶切
片段(约 8.8 kb)。
1.2 AtDOX2表达菌株的筛选
回收的线性化 pPIC9k-AtDOX2片段电转入毕赤
酵母宿主菌 GS115后，经 G418梯度筛选得到了 9
个高 G418抗性的菌株(4 mg/mL以上)，提取酵母基
因组 DNA进行 PCR鉴定，结果有 6个为阳性克隆。
鉴定的阳性克隆分别用 AtDOX2 特异引物、AOX1
通用引物进行 gPCR鉴定,结果分别扩增出了 1.9 kb
图1α-DOX与脂肪酸 α氧化
Figure1 α-DOX and α-oxidation of fatty acids
α-DOX
H3C
COOH
H3C
COOH
OOH
COOH
H3C
H3C
CHO
CO2
OHp
ero
xid
ase
spontaneous
had dioxygenase activity, and the α-dioxygenase activity of AtDOX2 could be activated by Ca2+ too. Results indi-
cate that the ecombinant AtDOX2 was expressed and purified by yeast system, and it acts as a dual functional en-
zyme of peroxidase and dioxygenase.
Keywords Arabidopsis thaliana, AtDOX2, Pichia pastoris, Peroxidase, α-dioxygenase
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图 2 AtDOX2 PCR扩增、pPIC9k-AtDOX2 酶切鉴定和线性化
M: 2-log DNA ladder; 1: AtDOX2 目的片段; 2: pPIC9k-At-OX2
双酶切片段; 3: pPIC9k-AtDOX2线性化
Figure 2 PCR Amplification of AtDOX2, and restriction enzyme
digestion analysis and linearization of pPIC9k-AtDOX2
M: 2-log DNA ladder; 1: Amplification of AtDOX2 by PCR;
2: Enzyme digestion of pPIC9k-AtDOX2; 3: Linearization of
pPIC9k-AtDOX2
10.0
M 1 2 3
4.0
3.0
kb
M CK 1 2 3 4 5kD
175
80
58
46
70
和 2.4 kb左右的条带，用通用引物扩增转化了空载
体 pPIC9k 的 GS115，扩增出 0.5 kb 左右的条带(图
3),这与预期结果相符,说明 AtDOX2基因已经成功整
合入毕赤酵母染色体中。
1.3 AtDOX2的诱导表达
挑取鉴定后的 GS115阳性转化子，以终浓度为
0.5%的甲醇诱导表达, 分别于诱导后 24、48、72、96
和 120 h收集上清，TCA浓缩后进行 SDS-PAGE分
析，结果显示在 70 kD处有目的条带出现，与理论值
一致，说明 AtDOX2在毕赤酵母 GS115中已表达。
从 24 h开始就有目的蛋白的表达, 随时间延长表达
量逐渐增加,培养 96 h时表达量最大，随后表达量逐
渐减少(图 4)。经 Quantity One分析表明，AtDOX2表
达量占胞外总蛋白的 15%。
1.4 AtDOX2的分离纯化
将重组 AtDOX2 高效表达菌株甲醇诱导，96 h
后收集培养液上清，硫酸铵分级沉淀、复溶、透析后
使用 Ni-NTA柱进行亲和纯化，纯化获得的蛋白产
物通过 SDS-PAGE进行鉴定，结果如图 5所示。纯化
后样品蛋白条带较单一，Quantity One 软件分析表
明，重组蛋白的纯度大于 80%。
1.5 AtDOX2的过氧化物酶活性分析
以不加酶的反应体系作为阴性对照(NC，nega-
tive control)，以加酶的反应体系作为阳性对照(C,
control)，其它几个反应体系中除加入重组 AtDOX2
外，还加入 1 mmol/L不同离子或有机物。与阴性对
照相比，加入酶的反应液迅速变成绿色，表明重组
AtDOX2具有过氧化物酶活性。其过氧化物酶活性
受 EDTA、咪唑和 Mn2+抑制，受 Mg2+和 Ca2+激活，
其中加入 Ca2+后 AtDOX2的过氧化物酶活力提高了
图 4不同时间点 AtDOX2表达水平的 SDS-PAGE分析
M:预染蛋白 marker; CK: GS115/pPIC9k表达上清; 1~5: 不同
时间点 (24、48、72、96和 120 h) GS115/ pPIC9k-AtDOX2的表
达上清
Figure 4 SDS-PAGE analysis of the expression level of AtDOX2
at different time points
M: Prestained protein marker; CK: Supernatant of GS115/
pPIC9k; 1 ~ 5: Supernatants of GS115/ pPIC9k-AtDOX2 in 24,
48, 72, 96 and 120 h, respectively
图 5重组 AtDOX2的 SDS-PAGE分析
M:预染蛋白 marker; 1:胞外总蛋白; 2:纯化的 AtDOX2
Figure 5 SDS-PAGE analysis of recombinant AtDOX2
M: Prestained protein marker; 1: The whole extracellular protein;
2: Purified AtDOX2
图 3 GS115/pPIC9k-AtDOX2转化子的 gPCR鉴定
M: 2-log DNA ladder; 1~3: GS115 转化子的特异引物扩增产
物; 4~6: GS115转化子的 AOX1引物扩增产物; 7~9: pPIC9k
转入 GS115转化子的 AOX1引物扩增产物
Figure 3 gPCR analysis of GS115/pPIC9k-AtDOX2 transformants
M: 2-log DNA ladder; 1~3: gDNA PCR fragment with specific
primer of GS115/ pPIC9k-AtDOX2 transformants; 4~6: gDNA
PCR fragment with AOX1 primer of GS115/ pPIC9k-AtDOX2
transformants; 7~9: gDNA PCR fragment with AOX1 primer of
GS115/pPIC9k transformants
kb
3.0
2.0
0.5
0.1
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M 1 2kD
175
80
58
46
30
25
70
拟南芥 Alpha-Dioxygenase 2在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定
Expression, Purification and Activity Identification of Arabidopsis thaliana Alpha-dioxygenase 2 in Pichia pastoris
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5倍以上(图 6)。
1.6 AtDOX2 的双加氧酶活性分析
AtDOX2与脂肪酸一起孵育,反应生成少一个碳
原子的醛(Stumpf et al., 1956),生成的醛与 2，4-DNP
醇酸溶液反应，在碱性条件下生成红色离子醌类物
质(Natsuko et al., 1993)，该产物在 425 nm具有特征
光吸收。图 7为以油酸为底物测定 AtDOX2双加氧
酶活力的结果，图中每条曲线为不同反应体系产物
在 360~750 nm范围内的光吸收值。阴性对照中未加
入 AtDOX2，阳性对照中预先加入乙醛。结果显示加
入 AtDOX2后，与阳性对照一致，反应液在 425 nm
处出现特征吸收峰, 而且该吸收比阳性对照更加显
著。因而 AtDOX2具有将油酸转化为少一个碳原子
的醛的脂肪酸双加氧酶活性。反应体系中加入 Ca2+,
可略微提高 AtDOX2的双加氧酶活性。
2 讨论
植物 α-DOX包含类血红素过氧化物酶结构域
(Liu et al., 2004)，使用原核表达系统获得具有活力的
酶蛋白具有一定难度，通常在培养基中加入血红素
或血红素前体 DELTA-氨基乙酰丙酸，共表达分子
伴侣等途径获得有活力的酶蛋白。使用上述方案已
成功表达烟草、水稻和拟南芥的 α-DOX1。但使用原
核系统表达 α-DOX2尚未见成功报道，本研究组之
前曾使用原核系统融合表达了拟南芥 α-DOX2，虽
然目的蛋白部分可溶，但未检测到过氧化物酶活性
(张美祥等，2007)。本研究采用毕赤酵母表达系统，
在分泌表达的酵母上清中即可检测到过氧化物酶活
性和双加氧酶活性，说明巴斯德毕赤酵母作为外源
蛋白表达系统，具有操作简便、成本低廉、表达量高、
产物便于分离纯化等优点，能有效克服大肠杆菌系
统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
已有的研究结果显示，原核表达的植物 α-DOX
有些可检测到微弱的过氧化物酶活性 (如拟南芥
α-DOX1)，有些则检测不到过氧化物酶活性(如水稻
α-DOX)(Saffert et al., 2000)，而本研究使用酵母表达
系统获得的重组 AtDOX2既具有过氧化物酶活性，
也具强的双加氧酶活性。研究结果显示 AtDOX2的
过氧化物酶活性受 Ca2+强烈激活，而其双加氧酶活
性在加入 Ca2+后也有上升，但不显著，因而拟南芥
AtDOX2 空间结构中可能包含 Ca2+结合位点。At-
DOX2同时具有过氧化物酶活性和双加氧酶活性，
那么这两种活性是由两个独立的结构域催化还是同
一个结构域完成？两种活性如何协调？如图 1所示，
双加氧酶催化脂肪酸双加氧首先产生 α-过氧羟基
脂肪酸，α-过氧羟基脂肪酸在过氧化物酶的催化下
形成 α-羟基脂肪酸，或自发形成少一个碳原子的脂
肪醛。到底是形成 α-羟基脂肪酸还是少一个碳原子
的脂肪醛取决于这两个方向的反应速度。我们推测
AtDOX2 的过氧化物酶活性可驱动反应向生成 α-
羟基脂肪酸的方向进行，而这种能力受 Ca2+的调节,
该假定需要进一步实验验证。
拟南芥 α-DOX1 表达主要受病原和逆境诱导 ,
在超敏坏死斑周围高丰度表达。拟南芥 α-DOX2则
在幼苗、种子、果荚及衰老组织中表达，可能参与植
株的正常生长发育调控。但拟南芥 α-DOX2实现其
生物学功能的具体生化机制目前仍不完全清楚，本
研究则是向这一目标迈出的重要一步。
3 材料与方法
3.1材料
3.1.1菌株和载体
0.5
1.5
1.0
0.0
400 450 500 550 600 650 700 750
Oleic,negtive control
Oleic acid, AtDOX2
Oleic acid, AtDOX2, Ca2+
Acetaldehyde, positive control
A 3
60
~7
50
nm
波长 /nm
wavelength
图 7 AtDOX2双加氧酶活性分析
Figure 7 Analysis of α-dioxygenase activity of the AtDOX2
图 6 AtDOX2的过氧化物酶活性分析
NC:未加 AtDOX2的阴性对照; C:加入 AtDOX2的阳性对照
Figure 6 Peroxidase activity analysis of the AtDOX2
NC: Negative control without AtDOX2; C: Positive control with
AtDOX2; I：Imedazole
150
100
0
50
Re
ac
tio
n
ra
te
(1
00
×A
40
5/m
in
)
NC I Mg2+ Ca2+Mn2+C EDTA
54
Arabidopsis thaliana alpha-dioxygenase 2 (At－
DOX2) 基因从 ABRC (Arabidopsis Biological Re-
search Center) 获得 (编号 U16142)。大肠杆菌(Es－
cherichia coli) Turbo菌株、毕赤酵母(Pichia pastoris)
菌株 GS115(his4-)、酵母表达载体 pPIC9k均由本实
验室保存。
3.1.2主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、2-log DNA
Marker、Prestained Protein Marker 均为美国 NEB 公
司产品；Ni-NTA Agrose 亲和层析材料为德国 Qia-
gen 公司产品；毕赤酵母培养所需试剂购自美国
DIFCO公司；ABTS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazo-
line-6-sulfonic acid)) 购自美国 Sigma公司，油酸和
2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)购自上海生物工程有限公
司，其余试剂均为国产分析纯。
3.1.3主要引物
以拟南芥 AtDOX2基因 cDNA序列为依据设计
引物(GenBank Accession: AY128743)，具体序列为:
F1: CCTCGGTACAACGAATTTAGAAAGAATCT
GTTGATG (框选部分为 1470 bp处 EcoRⅠ位点突
变后的序列);
R1: CATCAACAGATTCTTTCTAAATTCGTTGTA
CCGAGG(该序列与 F1反向互补，框选部分为 EcoR
Ⅰ位点突变后的序列);
F2: GTAGAATTC A T G GGTTTCTCTCCATCCTC
(框选部分为 EcoRⅠ位点,灰色背景部分为起始密
码子);
R2: ATTCGCGGCCGC CTAATGATGATGATGAT-
GATGTGGAGCGGATCGG (框选部分为 Not Ⅰ位
点，下划线部分为 6×His编码区，灰色背景部分为终
止密码子)。其中，F1和 R1用于去除 AtDOX2编码区
1470 bp 处的 EcoR Ⅰ位点，F2 和 R2 用于扩增 At－
DOX2的完整编码区序列，F2上包含 EcoRⅠ位点，
R2上包含 Not Ⅰ位点，且 R2在终止密码子之前引
入了 6个组氨酸密码子。用于阳性转化子筛选的通
用引物序列参考 Invitrogen公司的毕赤酵母表达手
册。上述引物皆由上海生物工程有限公司合成。
3.2 方法
3.2.1 AtDOX2基因扩增及重组表达载体构建
以含有拟南芥 AtDOX2 基因全序列的质粒
pET32a-AtDOX2为模板，使用 F2和 R1扩增出 1488
bp的片段，使用 F1和 R2扩增出 437 bp的片段，将
回收到的两个片段混合作为模板，使用引物 F2和
R2进行扩增，获得去除了 1 470 bp处 EcoRⅠ位点
的 AtDOX2完整的编码区序列。PCR扩增体系：10×
PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 5 μL，10 μmol/L
上下游引物各 1 μL，质粒模板 1 μL，2.5 U/μL Taq
DNA聚合酶 1 μL，加 ddH2O至 50 μL。PCR扩增程
序为：94℃预变性 5 min，94℃变性 45 s，60℃退火
45 s，72℃延伸 2 min，30个循环,72℃延伸 5 min。用
限制性内切酶 EcoRⅠ和 Not Ⅰ双酶切目的片段和
表达载体 pPIC9k，回收后连接、转化、筛选获得阳性
重组子，送北京华大基因公司测序确证。
3.2.2重组表达载体电转化及毕赤酵母阳性重组子的
筛选
用 Bio-Rad GenePluser电穿孔仪将 BglⅡ线性化
的重组表达载体 pPIC9k-AtDOX2 转入毕赤酵母
GS115感受态细胞(1.5 kV，25 UF，186Ω，电击时间
为 5~6 ms)，在 MD 平板上初步筛选 3 d，再在含
G418的MD平板上筛选 2 d，MDG培养平板 (所含
G418的浓度分别为 0.5、1、2、3和 4 mg/mL) 梯度筛
选获得的高拷贝转化子，用“煮冻煮”(剧 海等，
2003)的方法提取酵母基因组 DNA，分别用 AtDOX2
特异引物和 AOX1通用引物进行基因组 DNA PCR
(gPCR)，对阳性重组子进行鉴定。
3.2.3重组 AtDOX2表达条件的优化
挑取鉴定后的 GS115 阳性转化子接种于 25
mL BMGY液体培养基中, 于 28℃ 220 r/min摇床上
振荡培养至 OD600为 4.5, 3000 r/min离心 5 min，回收
后的菌体重悬于 BMMY液体培养基，使 OD600至 1.0
左右，然后于 28℃ 220 r/min摇床上连续振荡培养 5
d，每天加入终浓度为 0.5%甲醇诱导表达，并定时取
1 mL的菌液。将不同时间段收集到的菌液 12 000
r/min离心 5 min，收集上清并用三氯乙酸(TCA)沉淀
浓缩，然后用 10% SDS-PAGE分析检测不同表达时
间 AtDOX2的分泌表达量。
3.2.4重组 AtDOX2的纯化
取筛选出的高表达转化子，在优化条件下进行
诱导表达，收集到 300 mL的培养液上清，使用 35%
~75%(NH4)2SO4分级沉淀,裂解缓冲 (Lysis buffer，50
mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH 8.0)透析后
使用 Ni-NTA柱纯化，操作步骤参考 QIAGEN蛋白
纯化手册。使用 10% SDS-PAGE分析获得的纯化产
物，凝胶中目的蛋白的相对定量使用 Quantity One
软件完成。制备的酶置于 10 mmol/L pH 7.8 的
拟南芥 Alpha-Dioxygenase 2在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定
Expression, Purification and Activity Identification of Arabidopsis thaliana Alpha-dioxygenase 2 in Pichia pastoris 55
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Tris-HCl缓冲液中 4℃保存，用于后续酶活测定。
3.2.5重组 AtDOX2过氧化物酶活性的测定
采用 ABTS法测定过氧化物酶活性，以 ABTS
为显色剂，对过氧化物酶进行快速检测。反应体系为
100 μL， 其 中 包 含 10 μL 500 mmol/L pH 5.0
NaAc-HAc；5 μL 50 mmol/L ABTS；10 μL 20 mmol/L
H2O2；2 μL 50 mmol/L EDTA、咪唑、MnCl2、MgCl2或
CaCl2；2.5 μL AtDOX2(0.5 mg/mL)。使用 Spectrum-
max M2多功能读板机于室温下测定催化反应过程
中反应液对 405 nm波长的光吸收，计算出 AtDOX2
在不同条件下的催化活力。
3.2.6 重组 AtDOX2双加氧酶活性的测定
AtDOX2 的 α- 双加氧酶活性通过测定其与脂
肪酸孵育得到的醛完成 (Yukawa et al., 1993; Saffert
et al., 2000)。本实验以油酸为底物，反应体系加入 1
mmol/L 油酸 20 μL，1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)缓冲
溶液 20 μL；20μL蛋白纯化产物(0.5 mg/mL)，补水
至总体积 200 μL。30℃孵育 30 min，加入 200 μL
2,4-DNP醇酸溶液，50℃反应 30 min，冰浴，加 1 mL
0.1 mol/L NaOH-80%乙醇溶液，20℃ 1300 g离心 20
min，使用 Spectrummax M2在 360~750 nm波长范围
内进行吸光度扫描(Stumpf et al., 1956)。
参考文献
Bannenberg G., Martinez M., Rodriguez M.J., Lopez M.A.,
Ponce de Leon I., Hamberg M., and Castresana, C., 2009,
Functional analysis of alpha-DOX2, an active
alpha-dioxygenase critical for normal development in
tomato plants, Plant Physiology, 151: 1421~1432
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