全 文 ：光照与温度对拟南芥 tak基因表达与
LHC磷酸化的影响 *
蒋佳宏 1) 王 东 1) 胡 源 1) 高 秀 1) 杜林方 1, 2)**
(1)四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064；
2)四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所，成都 610041)
摘要 TAK1和 TAK2是拟南芥核基因编码的蛋白激酶，TAK1可能参与植物状态转换中 LHCⅡ蛋白磷酸化的调控．根据
TAK1蛋白序列，合成了一段含 12个氨基酸残基的亲水短肽，与牛血清白蛋白(BSA)偶联并免疫家兔得到 TAK1抗体．经免
疫双扩散和蛋白质印迹检测，该多肽抗体效价和特异性较高．借助 TAK1抗体以及磷酸化抗体进行杂交试验，结合特异引物
进行半定量 PCR，研究了光照与温度对拟南芥 tak1和 tak2基因表达的影响．结果表明，光强与温度调节 LHCⅡ蛋白磷酸
化，也会在转录水平和蛋白质水平上影响 tak1和 tak2基因表达．LHCⅡ蛋白磷酸化对光响应趋势与 TAK1蛋白水平变化相
同．此外，低光照促进 tak2基因表达，tak2基因转录表达受温度的影响较小．tak1和 tak2基因表达调控方式不同，可能与
启动子响应元件的不同相关．
关键词 TAK1，TAK2，LHCⅡ磷酸化，合成多肽，基因表达，光照与温度影响
学科分类号 Q5 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00090
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistry and Biophysics
2009, 36(9): 1202~1207
www.pibb.ac.cn
研究报告Research Papers
* 国家自然科学基金资助项目( 30870181).
**通讯联系人.
Tel: 028-85415008, E-mail: dulinfang@scu.edu.cn
收稿日期：2009-02-18，接受日期：2009-05-22
植物的生长发育受外界环境的影响，特别是温
度和光照的影响．状态转换(state transitions)是植物
调节激发能在两个光系统之间分配的一种快速机
制，以响应短期光照条件的变化[1]．状态转换与主
要捕光天线色素蛋白复合体 LHCⅡ的磷酸化紧密
相关．TAK (thylakoid assioated kinase)是从拟南芥
类囊体膜上分离得到的激酶[2]，具有使 LHCⅡ磷酸
化的活性，反义 RNA技术得到 TAK1减少拟南芥
植株仅有少量的 LHCⅡ发生磷酸化 [3]，TAK家族
包含 TAK1、TAK2和 TAK3[3]．新近发现，拟南芥
类囊体膜结合激酶 STN7 也参与了 LHCⅡ磷酸化
与状态转换 [4]，但是 STN7 与 TAK 间的关系不清
楚，它们编码基因表达调控的机理未知．
环境温度是影响植物光合作用的另一个主要因
素．逆境温度对植物产生胁迫，低温及高温处理都
损害植物的光合机构[5, 6]，低温条件下次要天线蛋
白 CP29 发生磷酸化，可能是光系统对胁迫的响
应 [7]．我们的研究表明，温度对拟南芥类囊体膜
STN7蛋白稳态水平有影响[8]，但是迄今，温度和
光照对激酶 TAK1的影响尚缺乏研究．TAK1属于
酪氨酸激酶家族，分析显示可有跨膜结构存在 [2]，
我们选择一段亲水肽段为抗原表位，合成多肽后偶
联牛血清蛋白(BSA)免疫家兔得到 TAK1 多肽抗
体，研究光照与温度对拟南芥 TAK1蛋白含量的影
响，同时设计特异引物用以研究 tak1和 tak2基因
在转录水平上的变化，发现温度和光照对基因表达
有明显的影响．
1 材料与方法
1．1 TAK1多肽设计和抗体制备
激酶序列信息由 NCBI收录: TAK1(NP_192172),
TAK2(NP_171661)．首先进行疏水性与跨膜区预
测，以此为基础构建 TAK 保守活性区域三维结
构，因为在 PDB中序列相似度超过 30%的酪氨酸
序列很多，因此选用准确度最高的同源建模．抗原
决定簇分析采用哈佛大学 Antigenic Peptides 程
序，结合酶活中心位置判断，通过分析比较，最
终选取了亲水性和抗原性较好的一段膜外区域为
抗原表位，设计了含 12 个氨基酸残基的多肽：
蒋佳宏等：光照与温度对拟南芥 tak基因表达与 LHC磷酸化的影响2009; 36 (9)
RRKTNVNESEDE．委托北京赛百盛公司合成并纯
化，HPLC检测其纯度为 96%．结合四川大学生命
科学学院制备 D1等蛋白多肽抗体的经验[8～10]，将
多肽与载体蛋白 BSA连接，以 BSA多肽抗原偶联
物乳化福氏佐剂多点皮下注射免疫家兔．经免疫双
扩散法测定效价达标，心脏取血，经过灭活等后续
步骤得到抗血清，-20℃分装保存．
1．2 材料培养和叶片处理
野生型拟南芥 Arabidopsis thaliana (ecotype
Columbia)温室条件培养(22℃，10 h/14 h，昼 /夜，
光照强度为 100 μmol·m-2·s-1)．将拟南芥整株暗置
过夜，选取发育较好的成熟叶片，漂浮于 MY液
体培养基表面，分别在低温(6℃，LT)、生长温度
(22℃，GT)和高温(35℃，HT)下白色光源光照处理
2 h，处理时光照强度分别为弱光(20 μmol·m-2·s-1，
LL)、 中 光 (100 μmol·m -2·s -1， ML) 和 强 光
(500 μmol·m-2·s-1，HL)．
1．3 拟南芥类囊体膜提取及叶绿素含量测定
参照Wei等[11]的方法从处理后的叶片中提取类
囊体膜，操作过程低温避光，类囊体膜液氮速冻再
储存于-80℃冰箱，叶绿素 a和 b含量用 Porra等[12]
方法测定．
1．4 RNA提取与 RT-PCR
处理过的叶片在液氮中快速研磨为粉末状，采
用 TIANGEN 的试剂盒提取 RNA，以 DEPC 水溶
解后冻存于-80℃．RT-PCR 使用两步法，所得
cDNA分装冷藏，设计的 tak1引物为 FP 5′ ATGG-
CGGATTCTCACTCA 3′， RP 5′ TTGTTGCTTC-
GTCGGTAA 3′，得到 155 bp 扩增片段．设计的
tak2 引物为 FP 5′ ACGACGCTGCTTTCCTTA 3′，
RP 5′ GCACTCGCTGTTCCTCTAC 3′得到 340 bp
扩增片段，内参 actin 引物参考文献 [13]， FP
5′ TGCGACAATGGAACTGGAATG 3′，RP 5′ GG-
ATAGCATGTGGAAGTGCATACC 3′得到 499 bp
扩增片段．PCR结束之后，浓度 1.3%琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR产物状况．
1．5 Urea-SDS-PAGE与Western blot
Urea-SDS-PAGE参照 Du等[14]的方法进行，使
用 13.75%分离胶(6 mol/L尿素)和 5%浓缩胶，每泳
道上样类囊体膜蛋白样品均含 5 μg叶绿素．类囊
体膜蛋白组分经变性缓冲液充分处理后经
SDS-PAGE (尿素胶)分离，考马斯亮蓝 R-250染色
或电转至 PVDF 膜进行 Western blot 免疫检测反
应．LHCⅡ磷酸化检测用磷酸化苏氨酸抗体(购于
Zymed 公司 )，使用制备的 TAK1 多肽抗体检测
TAK1 蛋白表达水平．Western blot 采用 Millipore
公司发光系统 (ECL Western Blotting Detection
System)，在 BioRad Chemi Doc XRS凝胶成像系统
检测．杂交与半定量结果使用 BioRad公司图像分
析软件(Quantity One 1-D Analysis Software)进行[11].
2 结 果
2．1 TAK1多肽抗体制备与鉴定
TAK1含 492个氨基酸残基，而 TAK2有 472
个氨基酸残基，两者相似度达到 90%，而 TAK3
在 C端比 TAK1少 42个氨基酸残基[3]，生物信息
学分析显示，TAKs属于酪氨酸激酶家族，具有相
似的保守活性区，可以在 PDB找到不少相似度高
的酪氨酸激酶家族成员序列，以便对 TAK1进行同
源建模(结果未显示)．通过对多肽的亲水性和抗原
性、位置和特异性与合成要求等综合考虑，最终选
择了 TAK1位于 C端膜外的一段亲水肽段为抗原
表位，合成此十二肽并与载体蛋白 BSA偶联，免
疫新西兰家兔，经多次注射强化免疫后，免疫双扩
散检测发现，TAK抗血清效价超过了 1∶128，能
够进行后续实验．
为了检测 TAK1多肽抗体的特异性，将拟南芥
类囊体膜处理后进行 SDS-PAGE(尿素)，电转移至
PVDF膜，用制备的 TAK1抗血清进行Western blot
(图 1)，约 56 ku及 55 ku位置有 2条蛋白质杂交条
带出现，与理论上 TAK1激酶分子质量相同．
1203· ·
生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2009; 36 (9)
2.2 不同温度和光照处理引起类囊体膜 LHCⅡ蛋
白磷酸化的影响
为了考察光照强度变化时，LHCⅡ蛋白磷酸化
的稳态变化，将成熟的拟南芥叶片暗置过夜后，移
至不同温度(6℃、22℃和 35℃)条件下分别进行 3
种强度(20、100 和 500 μmol·m-2·s-1)的光照处理
2 h．变性尿素胶电泳分离类囊体膜蛋白组分后，
进行考马斯亮蓝染色，同时用磷酸化苏氨酸抗体进
行蛋白质杂交分析．
磷酸化苏氨酸抗体进行蛋白质杂交分析显示，
未光照处理时，拟南芥类囊体膜可以检测到较少的
LHCⅡ磷酸化，生长温度条件下光照使 LHCⅡ磷
酸化程度增加，并与光照强度相关，生长光强时最
大，而高光强时次之(图 2)．
2.3 不同温度和光照处理对类囊体膜 TAK1蛋白
含量的影响
由于 TAK1 激酶参与了 LHCⅡ蛋白的磷酸
化[2, 3]，借助制备的多肽抗体，我们考察了温度变
化和光照对 TAK1激酶表达的影响．图 3显示，与
未光照处理相比，拟南芥类囊体膜 TAK1蛋白含量
与温度和光照强度相关；生长温度条件下，弱光照
处理叶片类囊体膜 TAK1激酶含量仅有部分减少，
而强光照处理时叶片类囊体膜 TAK1激酶含量明显
降低；在相同弱光条件下，低温或高温处理，均引
起叶片类囊体膜 TAK1激酶含量增加，但是在强光
处理时，TAK1蛋白含量几乎不受温度的影响．
TAK1激酶显示 56 ku及 55 ku 2 条蛋白质杂
交条带，前文证实 TAK1蛋白可以磷酸化[2]，由于
不同温度和光照条件下，这 2条蛋白质杂交条带的
相对含量也在变化，至于蛋白质磷酸化对 TAK1激
酶活性是否有影响，有待于进一步研究．
2.4 生长温度光照对拟南芥 tak1和 tak2基因转录
水平的影响
室温放置于暗处未光照处理的叶片中，tak1和
tak2都有相当的转录量(图 4)．光照处理叶片 tak1
基因转录水平明显降低，低光强和高光强下 tak1
1204· ·
蒋佳宏等：光照与温度对拟南芥 tak基因表达与 LHC磷酸化的影响2009; 36 (9)
的转录水平较低，约为未光照处理时的一半．生长
光强下 tak1的转录水平最低，约为未光照处理时
的 1/4．值得注意的是，放置暗处未光照处理的叶
片中 tak2的转录水平最低，生长光强下 tak2基因
转录水平略有增加，而低光强和高光强下 tak2转
录水平较高，约为未光照处理时的 2倍．
2.5 低温条件下光照对拟南芥 tak1和 tak2基因转
录的影响
低温 (6℃ )暗处未光照处理叶片中， tak1 和
tak2都有较高的转录量(图 5)．光照处理叶片 tak1
基因转录水平明显降低．生长光强下 tak1的转录
水平高于低光强处理，约为未光照处理时的一半．
高光强下 tak1的转录水平最低，约为未光照处理
时的 1/4．值得注意的是，低光强处理叶片中 tak2
的转录水平明显高于未光照处理叶片，生长光强下
tak2转录水平最低，仅为峰值的 1/7，而高光强下
tak2转录水平，约为峰值的 1/3．
2.6 高温条件下光照对拟南芥 tak1和 tak2基因转
录的影响
高温(35℃)处理时，暗处未光照处理的叶片
tak1 基因具有较高的转录量(图 6)，强光照叶片
tak1 也有较高的表达，而弱光和生长光强下 tak1
基因表达明显减少．而 tak2受光照影响而表达增
强，在弱光照时表达有明显增加．
3 讨 论
TAK家族可能包含 TAK1、TAK2和 TAK3[3]，
人们对它们的研究较少，迄今，仅有一个实验室的
2篇论文报道 TAK1功能研究结果[2, 3]．新近发现，
拟南芥类囊体膜结合激酶 STN7 参与了 LHCⅡ磷
酸化与状态转换[4]，但是 TAK与 STN7间的关系不
清楚，编码基因表达调控的机理未知．
酶活性的调节包括酶量的调节与现有酶的活性
大小的调节．基因表达主要影响酶蛋白相对含量．
真核基因的表达主要是转录、翻译等水平上调控
的．我们的研究表明，tak1的基因表达不需要光，
但温度和光均影响 tak1的基因表达，在不同温度
条件下， tak1 的基因表达对光响应的趋势不同
(图 3～6)．生长温度 22℃时，随光照强度的增大，
tak1 基因表达的转录本 mRNA 水平相对降低
(图 4)，表明光照抑制了 tak1基因的转录．此外，
类囊体膜结合的 TAK1 激酶蛋白含量也相应减少
(图 3)．在低温 6℃或高温 35℃时，光照也影响
tak1基因的表达，转录产物明显减少(图 5，6)，而
弱光对类囊体膜结合的 TAK1激酶蛋白含量几乎无
影响，生长光强和强光下 TAK1激酶蛋白含量也明
显较少．上述结果表明，tak1基因表达主要是转录
水平调控的，光照抑制了 tak1基因的转录．
1205· ·
生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2009; 36 (9)
tak2的基因表达也受温度和光照的影响，在不
同温度条件下对光响应的趋势不同(图 3～6)．生长
温度 22℃时，避光叶片仅有少量的 tak2 mRNA存
在，光照诱导 tak2基因转录本 mRNA水平相对增
加(图 4)，表明光照促进了 tak2基因的转录．低温
6℃显著诱导 tak2基因的转录，弱光照促进 tak1基
因的表达，转录产物明显较多，而生长光强和强光
照射却抑制 tak2 基因表达 (图 5)．高温 35℃时，
tak2 基因表达也明显增加，光照会进一步促进转
录，但随光强变化的差异不显著．对 tak1 和 tak2
基因启动子初步分析显示，它们具有不同的响应元
件(结果未显示)，因此，受温度和光照影响 tak1和
tak2基因表达具有明显差异，极可能与它们启动子
响应元件的不同密切相关．
自发现 LHCⅡ蛋白磷酸化现象以来[15]，状态转
移与天线蛋白 LHCⅡ磷酸化关系的研究一直是热
点．体外实验表明，LHCⅡ蛋白的可逆磷酸化还受
到多种因素的影响，如质体醌还原水平调控 [16, 17]、
叶绿体中硫醇氧化还原状态的作用[18]等．lhc基因
表达受光的调控，温度也影响 LHCⅡ蛋白的磷酸
化[4]，我们的研究表明，温度和光均影响 LHCⅡ蛋
白的磷酸化(图 2)，在不同温度条件下 LHCⅡ磷酸
化对光响应趋势不同．生长温度 22℃时，LHCⅡ
的磷酸化程度随光照强度的增大而增加，而在低温
6℃或高温 35℃时，弱光处理 LHCⅡ的磷酸化程度
就达到最大程度．研究发现，TAK1激酶蛋白含量
也受温度与光的影响．由于 TAK1参与 LHCⅡ磷
酸化[2, 3]，而新近发现的 STN7 也参与了 LHCⅡ的
磷酸化与状态转换[4]，但其不受质体醌还原水平调
控、以及叶绿体中硫醇氧化还原状态的影响 [4, 13]，
与 LHCⅡ磷酸化的多种影响因素不吻合，此外，
TAK1激酶可以磷酸化[2]，这对其激酶活性是否有
影响也未知．因此，TAK1与 STN7在 LHCⅡ磷酸
化中怎样发挥作用有待于进一步研究．
参 考 文 献
1 Allen J F. Protein phosphorylation in regulation of photosynthesis.
Biochim Biophys Acta, 1992, 1098(3): 275～335
2 Snyders S, Kohorn B D. TAKs, thylakoid membrane protein kinase
associated with energy transduction. J Biol Chem, 1999, 274 (14):
9137～9140
3 Snyders S, Kohorn B D. Disruption of thylakoid-associated kinase 1
leads to alteration of light harvesting in Arabidopsis. J Biol Chem,
2001, 276(34): 32169～32176
4 Bellafiore S, Barneche F, Peltier G, et al. State transitions and light
adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7.
Nature, 2005, 433(7028): 892～895
5 Allen D J, Ort D R. Impacts of chilling tempertures on photosynthesis
in warm-climate plants. Trends Plant Science, 2001, 6(1): 36～42
6 Camejo D, Rodríguez P, Morales M A, et al. High temperature
effects on photosynthetic activity of two tomato cultivars with
different heat susceptibility. J Plant Physiol, 2005, 162(3): 281～289
7 Bergantino E, Dainese P, Cerovic Z, et al. A post-translational
modification of the photosystemⅡ subunit CP29 protects maize
from cold stress. J Biol Chem, 1995, 270(15): 8474～8481
8 Hu Y, Gao X, Jiang J H, et al. Effects of temperature on the
expression of STN7 and phosphorylation of LHCⅡ proteins in
Arabidopsis thaliana. Chin Sci Bull, 2008, 53(17): 2646～2651
9 李晓鹏,杜林方,梁厚果,等. PSⅡ反应中心 D1蛋白的小肽抗体
的制备和鉴定.生物化学与生物物理进展, 1997, 24(3): 283～285
Li X P, Du L F, Liang H G, et al. Prog Biochem Biophys , 1997,
24(3): 283～285
10 Li C J, Liang H G, Du L F, et al. Studies on the relationship between
cyanide-resistant respiration and expression of alternative oxidase in
mung bean using antibodies prepared by synthetic polypeptide.
Science in China (C), 2001, 44(1): 66～72
11 Wei H M, Guo J W, Zhang S, et al. The presence of phosphorylation
form of D1 protein in its cross-linked aggregates in high light treated
spinach leaves in vivo. Chin Sci Bull, 2006, 51(1): 69～74
12 Porra R J, Thompson W A, Kriedemann P E. Determination of
accurate extinction coefficients and simultaneous equations for
assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents:
Verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic
absorption spectroscopy. Biochim Biophys Acta, 1989, 975: 384～
394
13 Bonardi V, Pesaresi P, Becker T, et al. Photosystem Ⅱ core
phosphorylation and photosynthetic acclimation require two
different protein kinases. Nature, 2005, 437(7062): 1179～1182
14 Du L F, Sun X, Pan Y H, et al. Influence of calcium ion on
photosystem Ⅱ oxygen evolution. Science in China (B), 1995,
38(12): 1439～1447
15 Bennett J. Protein phosphorylation in green plant chloroplasts. Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 281～311
16 Verner A V, van Kan P J M, Rich P R, et al. Plastoquinol at the
quinol oxidation site of reduced cytochrome b/f mediates signal
transduction between light and protein phosphorylation: thylakoid
protein kinase deactivation by a single-turnover flash. Proc Natl
Acad Sci USA, 1997, 94(4): 1585～1590
17 Finazzi G, Zito F, Barbagallo R P, et al. Contrasted effects of
inhibitors of cytochrome b6f complex on state transitions in
Chlamydomonas reinhardtii: the role of Qo site occupancy in LHCⅡ
kinase activation. J Biol Chem, 2001, 276(13): 9770～9774
18 Hazra A, DasGupta M. Phosphorylation-dephosphorylation of
light-harvesting complexⅡ as a response to variation in irradiance is
thiol sensitive and thylakoid sufficient: Modulation of the sensitivity
of the phenomenon by a peripheral component. J Biol Chem, 2003,
42(50): 14868～14876
1206· ·
蒋佳宏等：光照与温度对拟南芥 tak基因表达与 LHC磷酸化的影响2009; 36 (9)
Effects of Light and Temperature on The Expression of tak Gene and
Phosphorylation of LHC in Arabidopsis thaliana*
JIANG Jia-Hong1), WANG Dong1), HU Yuan1), GAO Xiu1), DU Lin-Fang1,2)**
(1) Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment(Ministry of Education), College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China;
2) Institute for Nanobiomedical Technology and Membrane Biology, Sichuan University, Chengdu 610061, China)
Abstract TAK1 and TAK2 are both nuclear-encoded kinases. TAK1 may be involved in the phosphorylation of
LHCⅡ in state transitions. After the analysis of conservative activity regions on TAK1 and TAK2 sequences, a
segment of hydrophilic polypeptide consisting of 12 amino acid residues was devised and linked to bovine serum
albumin (BSA) before injection to the rabbit. The polyclonal antibody against TAK1 raised was examined by agar
gel immunodiffusion (AGID) test and Western blot analysis. then it was used to study the expression of tak1 and
tak2 influenced by the change of light and temperature in RT-PCR with specific primers and the possible
regulation relationship between TAK1 and LHCⅡ phosphorylation especially by using TAK1 serum and P-Thr
antibody. The result indicated that light and temperature regulated the phosphorylation of LHCⅡ and took
effect on the transcription and translation level of tak1 and tak2, but the response of LHCⅡ phosphorylation to
light did not coincided with the quantity of TAK1 protein. Furthermore, low light density could enhance the
expression of tak2, but temperature impacted tak2 little. The different regulation pattern of tak1 and tak2 may
derive from the different elements of promoter.
Key words TAK1, TAK2, LHCⅡ phosphorylation, synthetic peptides, gene expression, influence of light and
temperature
DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00090
*This work was supported by a grant from The National Natural Science Foundation of China (30870181).
**Corresponding author.
Tel: 86-28-85415008, E-mail: dulinfang@yahoo.com
Received: February 18, 2009 Accepted: May 22, 2009
1207· ·