全 文 ：地刷子石松提取物对免疫抑制小鼠血清中 NO含量及 NOS活性的影响*
*
王 娇，张涵淇，崔圆圆，胡 鑫，王德彬＊＊
(中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074)
摘要:目的 研究地刷子石松乙酸乙酯提取物对免疫抑制小鼠血清中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶
(NOS)活性的影响。方法 以环磷酰胺腹腔注射小鼠建立免疫抑制模型，以香菇菌多糖为阳性组，以 50、100、
200mg /kg的石松乙酸乙酯提取物为实验组，1 次 /d，连续给药 10d，末次给药 2h 后检测血清中 NO 含量及
TNOS活性。结果 地刷子石松乙酸乙酯提取物能显著降低小鼠血清中 TNOS活性及 NO含量。结论 地刷子石
松乙酸乙酯提取物可能通过抑制小鼠 TNOS活力来抑制 NO的细胞毒作用，从而增强小鼠的免疫功能。
关键词:地刷子石松;免疫抑制小鼠;一氧化氮;一氧化氮合酶
中图分类号:Ｒ967 文献标识码:A 文章编号:2095-4646(2015)06-0463-03
DOI:10． 16751 / j． cnki． 2095-4646． 2015． 06． 0463
Effects of the Extract from Lycopodium Japonicum on Serum NO Content and NOS Activity in Immunosuppressed Mice
WANG Jiao，ZHANG Han-qi，WANG De-bin，et al
(College of Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan Hubei 430074，China)
ABSTＲACT:Objective To explore the effect of the extract from Lycopodium japonicum on serum content
of nitric oxide (NO)and the activity of total nitric oxide synthase (NOS)in immunosuppressed mice． Meth-
ods The immunosuppressed model was built by intraperitoneal injection with cyclophosphamide． With lentinan
as a positive control，the ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum was administrated daily for 10 days
by gavage at the doses of 50，100 and 200mg /kg，respectively． 2 hours later after the last administration，the ser-
um was collected and the NO content and NOS activity were determined． Ｒesults The serum content of NO and
the activity of NOS in immunosuppressive mice of test groups were significantly reduced as compared to control
group． Conclusion The ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum can enhance the immunity of mice by
inhibiting the activity of NOS and the content of NO．
KEY WOＲDS:Lycopodium japonicum;Immunosuppressed mice;Nitric oxide;Nitric oxide synthase
地刷子石松为含地刷子碱、石松碱及多种三
萜类化合物的石松科石松属植物［1］，其主要用于
风湿关节痛、舒筋活络，此外，它对肺热咳嗽、肌肉
痉挛、跌打损伤、疮痈肿毒等也有一定的治疗作
用［2］。关于石松属植物的免疫调节功能少见文献
报道。大量实验表明，环磷酰胺可通过抑制小鼠
的细胞和体液免疫应答来抑制小鼠的免疫功
能［3］。故本实验以环磷酰胺诱导小鼠建立免疫抑
制模型，探讨地刷子石松乙酸乙酯提取物对免疫
抑制小鼠的免疫调节机制，从而为该类植物的应
用和开发提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验动物 昆明种雌、雄小鼠各 30 只，体
质量 18 ～ 22g，购于武汉生物制品研究所，动物许
可证号:SCXK(鄂)2012-0003。
1． 1． 2 药品及仪器 环磷酰胺(阿拉丁试剂有限
公司)，香菇菌多糖片(湖北广仁药业有限公司，生
产批号:131003)，NO 试剂盒(碧云天试剂有限公
司)，NOS 试剂盒(南京建成生物工程研究所)，
M200 型酶标仪(瑞士 TECAN 公司)，UV-1800PC
紫外可见分光光度计(上海美谱仪器有限公司，生
产批号:20141230)。
1． 2 方法
1． 2． 1 实验动物处理 将 60 只小鼠随机分成 6
组，每组 10 只，分别为正常组、模型组、阳性给药
组和药物低、中、高浓度实验组［4］。除正常组外，
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* 基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目(CZY15019);中南民族大学十二五“民族药学”国家级实验教学示范中心项目
＊＊通讯作者，E-mail:biner70@ sina． com
其余各组均在实验的第 1、2、3d 腹腔注射环磷酰
胺溶液(80mg /kg)［5］，正常组在实验第 1、2、3d 腹
腔注射相同体积的生理盐水。从实验第 1d 起各
实验组灌胃不同浓度(50、100 和 200mg /kg)的地
刷子石松乙酸乙酯提取物，阳性药组灌胃
100mg /kg香菇菌多糖溶液［6］，正常组和模型组灌
胃相同体积的生理盐水。
1． 2． 2 实验动物取血 连续灌胃 10d，末次给药
2h后所有小鼠眼眶摘眼球血于无抗凝剂的 EP 管
中，所有血样于 4℃倾斜静止放置 1 ～ 2h至血液自
然凝固，收集上层分离出的澄清透明的黄色血
清［7］。
1． 2． 3 小鼠脾脏指数的测定 采取脱臼法处死
小鼠，解剖后称量脾脏重量。计算脏器指数:脾脏
指数(mg /g)=脾脏重量 /实验动物体重量。
1． 2． 4 血清中 NO 含量测定 制作 NO 标准曲
线［8］，以 NaNO2 为标准品，将 NaNO2 标准品稀释
成 0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol /L 梯度
浓度的标准溶液，取 96 孔板，吸取标准溶液 50μl，
先后加入 Griess试剂一、试剂二各 50μl，每个浓度
的标准溶液设置两个复孔，用酶标仪测定在
550nm波长处的吸光度，并读取 OD 值，做回归曲
线，计算回归方程。再另取一 96 孔板，孔中加入
50μl待测血清，每个血清样品设两个复孔，用与前
述相同的方法测定 OD 值。利用回归方程，计算
NaNO2 的浓度，换算成血清中 NO含量。
1． 2． 5 血清中总 NOS 活力的测定 根据总 NOS
试剂盒说明书操作，完成总 NOS 活力的测定，记
录 OD值，计算总 NOS活力。
总NOS活力(U/ml)=总NOS测定OD值－空白OD值
显色物质摩尔消光系数
×反应液总体积
取样量
× 1
比色光径 ×反应时间
÷ 1000
1． 3 统计学处理 使用 GraphPad Prism 5 软件分
析实验数据，并对数据进行 ANOVA 统计学分析，
数据按(珋x ± s)的方式表示，以 P ＜ 0． 05 为差异有
统计学意义。
2 结 果
不同浓度地刷子石松乙酸乙酯提取物对小鼠
脾脏指数及血清中 NO含量、总 NOS活力的影响。
如表 1 所示，地刷子石松乙酸乙酯提取物高浓度
组脾脏指数接近于正常组和阳性给药组，且高、
中、低浓度组均与模型组差异显著，呈剂量依赖关
系;地刷子石松乙酸乙酯提取物对小鼠血清中 NO
含量、NOS活力的影响也与浓度呈正相关，中、高
浓度组与正常组相差不大，高剂量组更接近于正
常组。
表 1 地刷子石松乙酸乙酯提取物对免疫抑制
小鼠脾脏指数、血清中 NO、NOS的影响(n = 10)
组别 脾脏指数(mg/g) NO含量(μmol /L) NOS活力(U/mL)
正常组 3． 50 ± 0． 48 1． 62 ± 1． 49 34． 47 ± 4． 05
模型组 9． 21 ± 1． 18### 13． 57 ± 4． 88### 49． 98 ± 2． 15###
阳性给药组 4． 77 ± 1． 28＊＊＊ 6． 46 ± 4． 24* 34． 73 ± 0． 99＊＊＊
低剂量组 6． 76 ± 0． 62###＊＊ 9． 11 ± 3． 54# 36． 17 ± 1． 23＊＊＊
中剂量组 5． 72 ± 0． 85#＊＊＊ 3． 00 ± 0． 52＊＊ 34． 69 ± 2． 86＊＊＊
高剂量组 4． 09 ± 1． 14＊＊＊ 1． 34 ± 2． 67＊＊＊ 29． 31 ± 0． 65＊＊＊
与正常组相比，#P ＜ 0． 05、##P ＜ 0． 01、###P ＜ 0． 001;与模型组相比，* P ＜ 0． 05、＊＊P ＜ 0． 01、
＊＊＊P ＜ 0． 001
3 讨 论
脂溶性小分子 NO 是机体重要的化合物，能
激活靶细胞中的鸟苷酸环化酶，发挥生物学作用。
有文献表明，NO 是一种自由基，在动物体内不仅
可以发挥抗感染和免疫防疫的生理学作用，还可
损伤正常组织或细胞，产生细胞毒性，发挥病理学
作用［7］。NO 由 NOS 催化 L-精氨酸合成，NOS 包
括内皮型(eNOS)、神经型(nNOS)、诱生型(iNOS)
三种同功酶，降低 NOS 活力可以抑制 NO 过量产
生［9］。研究表明 NO能在免疫系统细胞之间起着
信号传递的作用［10］。已有实验［11］表明，在炎症或
免疫抑制的动物模型中，NO 浓度显著高于正常
组，产生大量诱导性 NO 的细胞毒性，在细胞炎症
的病理反应过程中起着主要作用，特征性炎症症
状的缓解与 NO含量的降低密切相关。
本研究结果表明，模型组血清 NO 含量及
NOS活力与正常组相比，均存在显著性差异，说明
造模成功;阳性给药组血清 NO 含量及 NOS 活力
接近正常组，说明阳性药香菇菌多糖对环磷酰胺
诱导的免疫抑制小鼠表现出明显的恢复作用［12］;
地刷子石松乙酸乙酯提取物低、中、高浓度组 NOS
活力均接近正常组，中、高浓度组 NO 含量及 NOS
活力与正常组相比无显著性差异，且低、中、高浓
度组脾脏指数与模型组相比均存在显著性差异，
且高浓度组明显接近于正常组，说明地刷子石松
乙酸乙酯提取物可明显提高免疫抑制小鼠的免疫
功能。另有研究发现，环磷酰胺可使小鼠脾脏萎
缩［13］，但本研究结果中环磷酰胺组的脾脏指数明
显高于正常组，这可能与环磷酰胺浓度较高，小鼠
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脾脏发生代偿性增生有关［3］。
综上所述，地刷子石松乙酸乙酯提取物可能
通过抑制血清总 NOS活力并最终抑制 NO过量产
生，降低其对正常组织细胞的细胞毒作用而发挥
保护作用，从而提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提
示地刷子石松乙酸乙酯提取物具有免疫增强作
用，且在一定浓度范围内，其免疫增强作用与浓度
呈正相关。
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(收稿日期:2015-07-10)
· ·
(上接第 462 页)可能已经受到抑制，造模成功;
DEM高剂量组的 NO含量、NOS 活力虽有升高，但
小于 DEM中剂量组，说明 100 mg /kg的 DEM不是
建模的最佳给药量;DEM低剂量组、CY低、中剂量
组的 NO 含量及 NOS 活力均低于正常组，说明造
模不成功。
当免疫细胞受到抗原刺激后，它们在脾脏进
行增殖分化，而胸腺则是 T细胞成熟的重要场所，
因此脾脏和胸腺的相对重量和免疫功能有关［9］。
本实验结果表明，DEM 中剂量组和 CY 高剂量组
的脾脏指数显著高于正常组;DEM 中剂量组和
CY高剂量组的胸腺指数显著低于正常组，说明小
鼠的免疫功能受到明显抑制。故 50mg /kg的 DEM
和 100mg /kg的 CY为诱导小鼠建立免疫抑制模型
的最佳浓度。
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