全 文 ：第3期
拟南芥光周期开花突变体的筛选和基因的鉴定
黄绿红,萧小鹃,秦玉芝,赵小英,李 妍,唐冬英,郭新红,刘选明*
(湖南大学 生命科学与技术研究院 生物能源与材料研究中心,中国湖南 长沙 410082)
摘 要:以双子叶模式植物拟南芥 (Arabidopsisthaliana)突变体 cry1cry2为实验材料,用含有激活标记质粒
pSKI015的农杆菌浸花进行转化,构建了拟南芥 T-DNA插入突变体库.通过筛选和观察分析,获得了一些开
花时间比cry1cry2明显延迟或明显提早的突变体.采用 IPCR(inversePCR)和 TAIL-PCR(thermalasymmetric
interlacedPCR)等方法,鉴定了这些突变体 T-DNA插入位点的基因组旁邻序列,并采用半定量 RT-PCR对插
入位点两侧基因的 mRNA水平进行了分析,初步鉴定了与开花相关的候选基因,为进一步研究其功能,深入
研究隐花素调节光周期开花的作用机制奠定了基础.
关键词:拟南芥;T-DNA;光周期;IPCR;TAIL-PCR
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2008)03-0247-06
ScreeningofanLibraryofArabidopsisPhotoperiodFlower
MutantsandCharacterizationofMutantGenes
HUANGLü-hong,XIAOXiao-juan,QINYu-zhi,ZHAOXiao-ying,LIYan,
TANGDong-ying,GUOXin-hong,LIUXuan-ming*
(InstituteofLifeScienceandTechnology,BioenergyandBiomaterialResearchCenter,HunanUniversity,Changsha410082,
Hunan,China)
Abstract:TheArabidopsismutantcry1cry2wasusedasexperimentalmaterialinthestudy.Alibraryof
Arabidopsismutantswasconstructedbyfloraldipmethod,Agrobacteriumtumefacienswithanactivation
taggingvectorpSKI015andherbicideBastaasaselectionmarkerwastransformedintothemutantcry1cry2.
Byscreeningandobservation,somemutantswithvisiblemorphologicalphenotypicvariationswereobtained.
IPCR(inversePCR)andTAIL-PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)wereusedtoidentifytheflanking
genomicsequencesofmutatedtargetgenes.Atthesametime,thesemi-quantitativeRT-PCRwasusedto
analyzeexpressionofthemutantgenesasthefirststeptowardsthefunctionofmutantgenes.Theresult
showedinthepaperlaidthefoundationforfurtherstudyofphotoperiodregulationbycyptochrome.
Keywords:Arabidopsis;T-DNA;photoperiod;IPCR;TAIL-PCR
(LifeScienceResearch,2008,12(3):247～252)
收稿日期:2008-01-02;修回日期:2008-04-02
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30770200;30600368);湖南省自然科学基金资助项目(05JJ30038)
作者简介:黄绿红(1984-),女,湖南新宁县人,湖南大学生物化学与分子生物学专业硕士研究生,E-mail:huanglvhongabc@yahoo.cn;
*通讯作者:刘选明(1963-),男,湖南新宁县人,湖南大学教授,博士生导师,主要从事植物生物化学及分子生物学方面的研究,E-mail:
sw_xml@hnu.cn.
调控开花时间是大多数植物由营养生长向
生殖生长转化的一个重要生长发育过程.近年来
生物学家利用模式植物拟南芥做了大量的遗传
研究,发现许多基因参与调控植物的开花时间,
并且确定至少存在 4条调控植物开花时间的信
号途径:即光周期途径、春化途径、自主途径和赤
第12卷 第3期 生命科学研究 Vol.12No.3
2008年9月 LifeScienceResearch Sep.2008
DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2008.03.006
生 命 科 学 研 究 2008年
图1激活标记载体pSKI015示意图
Fig.1DiagramofactivationtaggingvectorpSKI015
KpnⅠ
SacⅠ
EcoRⅠ
KpnⅠ
PstⅠ
HindⅢ
SacⅠ
KpnⅠ
NotⅠ
BssSⅠ
BamHⅠ
SacⅠ
NotⅠ
SpeⅠ
BssSⅠ
BssSⅠ
BssSⅠ
NotⅠ
KpnⅠ
12
1.
2.
8000
800
LB
BASTA pBstKS+
4×35Se
RB
pSK1015
(10138bp)
霉素途径[1,2].
日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要
因素之一[3].光对开花时间的调节一般是通过下
列过程实现的:不同波长的光被其受体接收后,
由光信号传导分子将光信号传递到内源的控时
器——“生物钟(circadianclock)”.通过信号输出
途径,生物钟将检测的日照长度信号传输给主要
信号分子 CO(CONSTANS),植物将生物钟信号
和光信号整合起来最终形成对开花时间的控制,
是由CO基因的转录丰度和CO蛋白的稳定性所
共同决定[4].CO基因编码一种转录调控子,这种
转录调控子可以调节开花基因 FT(FLOWER
INGLOCUST)的表达,从而实现了日照长度对
开花时间的调控[2,5].光受体依据对不同光质的光
发生反应而被分为隐花色素(CRY1和CRY2)、
光敏素(PHY2A、B、C、D、E)和紫外光B类受体.
PHYA、PHYB、CRY1、CRY2等光受体位于光周期
途径的上游,直接感受光信号后诱导生物钟成分
及转录因子的表达而促进开花[6].研究表明cry1
突变体在各种光照条件下都比野生型更迟开花[7,8];
cry2突变体在长日照下延迟开花,对光周期敏感[9,10].
cry1cry2双突变体的表型更为明显.
激活标记法是近年发展起来的较为有效的
一种特定 DNA插入突变标签法,即通过插入基
因调控原件使特定内源基因发生过量表达而产
生显性的功能获得型突变,从而对该基因进行鉴
定和分析的方法.目前,该方法是利用农杆菌介
导,采用菌液浸花的方法转化拟南芥,简单且转
化率高,有利于大规模构建突变体库[11].
为了更深入地研究隐花素调控光周期开花
的作用机制,本文以拟南芥蓝光受体突变体
cry1cry2为实验材料,通过激活标记技术构建了
T-DNA插入突变体库,并从中筛选到感兴趣的与
开花时间相关的突变体.采用IPCR和TAIL-PCR
等方法得到了突变体 T-DNA插入的基因组旁邻
序列,然后对与开花相关的基因进行了鉴定.本
文的研究结果,为进一步鉴定和研究这些参与开
花的基因在隐花素介导的光周期开花信号传导
途径中的功能奠定了基础.
1材料与方法
1.1植物材料
选用拟南芥突变体 cry1cry2为实验材料.种子
由美国加州大学洛杉矶分校林辰涛实验室提供.
1.2菌株和质粒
农杆菌菌株为GV3101,含辅助质粒pMP90RK,
已转入激活标记载体pSKI015(图1).
1.3拟南芥激活标记突变体库的构建
将 cry1cry2的种子悬浮于水中,4℃处理
4d以使发芽整齐.将营养土装入黑色秧盘中,
播种密度为 100～120株/盘.当拟南芥的主枝开
始现蕾时,打顶,以促进侧枝生长.农杆菌转化
前 1d去掉已结实的种荚.培养室保持温度在
22～24℃,相对湿度为 80%,光源为荧光灯,光
照强度为85μmol/(s·m2),光照时间为16h/d.
农杆菌菌株为 GV3101(含质粒 pSKI015),
挑单菌落于YEB液体培养基中28℃下振荡培养
2d,加抗生素利福平 100mg/L,卡那霉素,庆
大霉素和氨苄青霉素均为 50mg/L.按 1∶200的
比例在新鲜的含抗生素的 YEB液体培养基中扩
大培养至指数生长中期(菌液 OD600≈1.2).2800
r/min离心 10min,弃上清.将沉淀重新悬浮于
渗透培养基,组成为含 5%蔗糖,0.06%MES和
0.02%SilwetL-77(表面活性剂)的1/2MS液体培
养基,pH5.7.将处于盛花期前的拟南芥植株的
花蕾完全浸入上述农杆菌菌液 5min.保鲜膜覆
盖避光24h,保持相对湿度大于95%,以利于农
杆菌侵染转化.7d后按上述方法重复转化 1次.
待种子成熟后收获干燥,每 50株 1池,每池的
植株分别混合采收.
1.4光周期开花突变体的筛选
突变体筛选的培养条件同上,但将播种密度改
为约5000株/盘.待苗出齐后,喷施除草剂Basta
(商品名为Finale,有效成份为5.78%glufosinate-
ammonium),筛选对除草剂有抗性的转化植株
(transformants).除草剂使用时按体积比 1∶1000
248
第3期
用水稀释,每 7d喷施 2次,连续 21d.在此基
础上,进一步筛选开花时间比母本cry1cry2明显
延迟或提早的突变体,并对其进行单株收种,以
进一步筛选纯合子和克隆相关基因.
1.5采用 IPCR扩增 T-DNA插入的基因组旁邻
序列
IPCR是1988年由Triglia[12]最早提出的一种
基于PCR的改进的染色体步行方法.实验中,我
们先用小量法提取筛选出的 T-DNA插入突变体
的总DNA,然后用限制内切酶对总 DNA进行过
夜酶切,酶切片段进行自连接.然后根据质粒的
T-DNA区设计一对反向引物进行 PCR扩增,克
隆到外源基因的旁邻序列.反向引物为 Ba-S5′-
GGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGA-3′;LB-A5′-
GATTTCCCGGACATGAAGCCATTTAC-3′.IPCR的
扩增条件为:94℃5min;(94℃30s;56℃30
s;72℃1.5min)34个循环;72℃5min.PCR的
反应体系为20μL.
1.6 采用 TAIL-PCR扩增 T-DNA插入的基因
组旁邻序列
TAIL-PCR是一种比较成熟的扩增T-DNA插
入旁邻序列的技术[13].本实验利用该技术来扩增
突变体载体左臂的基因组 DNA旁邻序列.根据
pSKI015载体的序列,TAIL-PCR反应的 3个特
异性引物为LS15′-GACAACATGTCGAGGCTCAG
CAGGA-3′;LS25′-TGGACGTGAATGTAGACAC
GTCGA-3′;LS35′-GCTTTCGCCTATAAATACGA
CGG-3′,其中 LS3离 T-DNA的左臂最近,这 3
个特异性引物的 Tm值较高,均在 60℃左右.6
个简并引物为 AD15′-NTCGASTWTSGWGTT-3′;
AD25′-NGTCGASWGANAWGAA-3′;AD35′-
WGTGNAGWANCANAGA-3′;AD45′-AG-WGNA
GWANCAWAGG-3′;AD55′-TGWGNAGSANCA
AGA-3′;AD65′-STTGNTASTNCTNTGC-3′,这6
个简并引物的 Tm值较低,均为 45℃左右.
TAIL-PCR的扩增条件为,第一轮 PCR:4℃2
min;93℃1min;95℃1min;(94℃30s;62
℃1min;72℃2.5min)5个循环;94℃30s;
25℃3min;升温 0.2℃/s,升至 72℃(约需 4
min);72℃2.5min;(94℃10s;68℃1min;
72℃2.5min;94℃10s;68℃ 1min;72℃
2.5min;94℃10s;44℃1min;72℃2.5min)
15个循环;72℃5min.第二轮PCR以第一轮的
产物稀释 50倍后取1μL为模板,扩增条件为 4
℃2min;(94℃10s;64℃1min;72℃2.5
min;94℃10s;64℃1min;72℃2.5min;94
℃10s;44℃1min;72℃2.5min)12个循环;
72℃5min.第三轮PCR以第二轮的产物稀释50
倍后取1μL为模板,扩增条件为4℃2min;(94
℃15s;44℃1min;72℃2.5min)20个循环;
72℃5min.3轮PCR的反应体系均为20μL.
1.7 RNA的提取以及半定量RT-PCR
总 RNA用安比奥生物技术有限公司生产的
试剂盒提取.根据试剂盒的操作步骤进行操作.
然后在 RNasefree离心管中加入约 2μg的总
RNA和0.5μgOlig(dT),体系为15μL,4℃短暂
离心,70℃水浴5min后,立即冰浴冷却.短暂离
心后,依次加入 10×Bufer2.5μL,10mmol/L
dNTPs1.25μL,RNaseA抑制剂 25IU,M-MLV
逆转录酶200IU,加RNasefreeWater至 25μL,
42℃反应60min后,70℃水浴1min使酶失活,
得到cDNA第一链后用于PCR扩增.
PCR引物由上海生工生物工程技术有限公
司合成.PCR扩增体系为 20μL,其中 10×PCR
bufer2μL,2mmol/LdNTP2μL,2.5μmol/L
引物各 2.4μL,25mmol/LMgCl21.6μL,1IU/
μLTaq酶(MBI)1μL,cDNA1μL.PCR产物在
1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳.试验至少重复 3
次,用持家基因Actin2(ACT2)作为分子内标.
2 结果
2.1拟南芥光周期开花反应突变体的筛选
将构建好的以cry1cry2为母本的激活标签突
变体库种子播种于培养土中,培养在长日照(16
h光/8h暗)条件下,通过筛选和观察,在T1代
植株中,发现一些开花时间比母本cry1cry2延迟
或提早的突变体.我们将部分开花时间明显延迟
(图2C、D和图3)或明显提早(图2E、F和图3)的
突变体进行单株收种.
2.2晚开花突变体T-DNA插入位点的鉴定
我们采用 IPCR的方法,克隆了 T-DNA插入
位点的旁邻序列(见图4A、B).将 PCR产物克隆
到 pGEM@-T载体中,用通用引物 T7测序.测序
结果和同源性比较显示,scc106-D突变体的 T-
DNA插入位点左边界的DNA序列与3号染色体
的部分序列相匹配,其插入位点在 1336核苷酸
处(见图5A).scc60-D突变体的T-DNA插入位点
右边界的DNA序列与4号染色体的部分序列相匹
黄绿红等:拟南芥光周期开花突变体的筛选和基因的鉴定 249
生 命 科 学 研 究 2008年
图5T-DNA在突变体中的插入位点
Fig.5TheT-DNAinsertionlocationinthemutant
图4T-DNA插入突变体旁邻基因组序列的获得
Fig.4Acquisitionofflankinggenomicsequenceofthe
T-DNAinsertmutants
图3光周期开花突变体植株的开花时间
Fig.3Floweringtimeofthephotoperiodflowermutant
A:col-4;B:cry1cry2;C:scc106-D;D:scc60-D;E:
scc105-4-D;F:scc147-3-D.
图2生长50d的光周期开花突变体植株
Fig.250-day-oldplantsofthephotoperiodflowermutant
(A)col-4;(B)cry1cry2;(C)scc106-D(suppressorofcry1cry2)——dwarf,smalroseteleaves,nodominantrachis,later
flower,sterility;(D)scc60-D——curledleaf,laterflower,sterility;(E)scc105-4-D——smalleaf,earlyflower;(F)
scc147-3-D—— smalleaf,earlyflower.
(A) (D)(C)(B) (E) (F)
scc106-D M
bp
1600
1000
bp
700
500
200
M scc60-D
(A) (B)
scc147-3-D
AD5
scc105-4-D
AD5
MⅡ Ⅲ Ⅱ Ⅲ MⅡ Ⅲ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅲ
(C) (D)
bp
700
500
200
bp
700
500
200
T-DNA
LB RB
1336
At3g57760At3g57765At3g57780At3g57790At4g05060At5g17300
(A)
T-DNA
LB RB
157483
At4g27230At4g27240At4g27250At4g27260At4g27270At4g27280
(B)
T-DNA
LB
1134
At5g19910At5g19920At5g19930At5g19940At5g19950At5g19960
(C)
T-DNA
LB RB
1181
At4g18197At4g18205At4g18210At4g18220At4g18230At4g18240
(D)
T-DNA
LB RB
869
At2g34130At2g34150At2g34160At2g34170At2g34180At2g34190
(E)
250
第3期
图6T-DNA插入位点两侧候选基因mRNA的RT-PCR分析
Fig.6TheRT-PCRanalysisofmRNAexpressionoftheT-DNAinsertionflankinggene
co
l-4
cy
1c
y2
sc
c6
0-
D
At4g27280
At4g27270
At4g27260
At4g27250
At4g27240
At4g27230
ACT2
(A)
co
l-4
cy
1c
y2
sc
c1
06
-D
At3g57760
ACT2
(B)
At3g57765
At3g57780
At3g57790
co
l-4
cy
1c
y2
sc
c1
05
-4
-D
At5g19950
At5g19940
At5g19930
At5g19920
At5g19910
At5g19960
ACT2
(C)
co
l-4
cy
1c
y2
sc
c1
47
-3
-D
At4g18240
ACT2
At4g18220
At4g18210
At4g18205
At4g18197
At2g34190
At2g34180
At2g34170
At2g34160
At2g34150
At2g34130
At4g18230
(D)
黄绿红等:拟南芥光周期开花突变体的筛选和基因的鉴定
配,其插入位点在157483核苷酸处(见图5B).
2.3早开花突变体T-DNA插入位点的鉴定
利用 TAIL-PCR的方法,发现有两个简并引
物AD4和 AD5可扩增出差异明显的条带(见图
4C、D),并且 AD4与 AD5的第三轮 PCR和第二
轮 PCR的条带相比片段略短,证明为特异性扩
增.将 AD4和 AD5所筛选到的两个早开花突变
体 scc105-4-D和 scc147-3-D所得到的第三轮
PCR产物纯化.将纯化后的 PCR产物克隆到
pGEM@-T载体中,用通用引物 T7测序.部分测
序和同源性比较显示,scc105-4-D突变体的 T-
DNA插入位点左边界的DNA序列与5号染色体
的部分序列相匹配,其插入位点在 1134核苷酸
处(见图 5C).scc147-3-D突变体的 T-DNA插入
位点左边界的 DNA序列与 4号染色体的部分序
列和2号染色体的部分序列相匹配,证明有两个
插入位点,其插入位点分别在 1181核苷酸和
869核苷酸处(见图5D、E).
2.4与开花相关的基因的鉴定
由于CaMV35S强启动子两侧 50kb内的基
因都有可能受到调节,为了确定引起 T-DNA插
入突变体开花延迟或提早的基因,本实验中对突
变体 T-DNA插入位点两侧 4~6个基因的表达进
行了分析(图6),结果发现在scc60-D突变体中,
T-DNA右边界的 At4g27240和At4g27260两个基
因的转录量比野生型和 cry1cry2突变体中均高
(图 6A),由此可推测 scc60-D突变体的迟开花
表型可能与这两个基因表达增强有关.在scc106-
D突变体中,T-DNA左边界附近的 At3g57760基
因的转录量比野生型和 cry1cry2突变体中均高
(图 6B),由此可推测 scc106-D突变体的迟开花
表型可能与此基因表达增强有关.
在 scc105-4-D突变体中,T-DNA右边界的
At5g19950基因的转录量比野生型和 cry1cry2突
变体中均高(图6C),由此可推测scc105-4-D突
变体的早开花表型可能与该基因表达增强有关.
在 scc147-3-D突变体中,T-DNA两个插入位点
的左边界 At2g34160,At4g18197,At4g18205和
At4g18210基因的转录量比野生型和 cry1cry2突
变体中均高(图6D),由此可推测scc147-3-D突
变体的早开花表型可能与这些基因表达增强有
关.为了证实上述推测,我们正在构建这些基因
的过量表达载体,准备进行表型恢复实验.
3讨论
激活标记技术是构建功能获得突变体库的有效
方法,并具有独特的优势[14,15].本实验室以拟南芥
蓝光受体突变体cry1cry2为材料,用该技术构建
了拟南芥的功能获得突变体库.拟南芥 cry1cry2
突变体为晚开花突变体,在T1代转化植株中,表
型明显与 cry1cry2不同的主要是开花时间、株
高、叶形和育性等.本实验中主要根据开花时间
划分 sccD系列突变体,我们将开花时间比
cry1cry2提前的突变体,称为早开花突变体;开
花时间比cry1cry2推迟的突变体,为晚开花突变
体.通过筛选和观察,我们从突变体库中筛选获
得了一些有价值的光周期开花突变体.
利用 IPCR和 TAIL-PCR等方法,我们鉴定
了这些突变体的 T-DNA插入位点,随后采用
251
生 命 科 学 研 究 2008年
RT-PCR对突变体T-DNA插入位点两侧的候选基
因的 mRNA水平进行了初步分析,获得了一些
与开花相关的候选基因,为进一步研究这些基因
的功能奠定了基础.
光周期对植物开花时间的控制是一个非常
复杂的过程,这一过程涉及到植物感知不同的光
照进而区分日照长短、植物体内的生物钟反应以
及光信号与生物钟信号的整合等[10].近年来,分
子遗传学的发展,尤其是对模式植物拟南芥开花
光周期反应的研究,使得人们对控制这一复杂生
物过程的分子机制有了较为清晰的认识.目前,
已经在分子水平上建立了受内部信号和外界环
境共同调控的拟南芥开花时间模型.虽然最近的
发现使人们对开花时间调控机制的认识上升到
一个新的层次,但是还不能完全解释这种复杂的
调控机制,仍然需要从分子水平上进一步了解这
些开花基因的功能[5].本研究通过筛选光周期开
花突变体和相关基因的鉴定,有助于深入研究隐
花素调节光周期开花的作用机制.
致谢:感谢美国加州大学洛杉矶分校林辰涛教授
的指导!
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更 正 启 事
本刊2008年第2期编委名单中的卢光□应为卢光 ,特此更正,并向卢光 教授
和广大读者致歉!
《生命科学研究》编辑部
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