全 文 ：中国农学通报 2013,29(18):119-126
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：科技部国际科技合作项目“橡胶树易碎愈伤组织长期培养植株再生和超低温保存研究”(2008DFA32020)；农业部“948”项目“橡胶树易碎
胚性愈伤组织长期继代培养、过表达Lec1基因促进胚状体发生和植株再生”(2010-S7)；国家自然科学基金项目“橡胶树胚性细胞悬浮培养及其植株
再生的研究”(30760128)。
第一作者简介：毕政鸿，男，1986年生，硕士研究生，研究方向为橡胶遗传改良。通信地址：571737海南省儋州市宝岛新村中国热带农业科学院橡胶
研究所，E-mail：bizhenghong9999999@163.com。
通讯作者：李哲，男，1971年出生，副研究员，硕士生导师，博士，主要从事植物组织培养、转基因以及细胞和组织发育、生理研究研究。通信地址：
571737海南省儋州市宝岛新村中国热带农业科学院橡胶研究所，E-mail：lizhecn@yahoo.cn。
收稿日期：2012-11-6，修回日期：2013-01-21。
拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定
毕政鸿 1,2，李 哲 2
（1海南大学农学院，海南儋州 571737；
2中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学重点开放实验室，海南儋州 571737）
摘 要：为了研究AtWUS基因在橡胶树胚性易碎愈伤组织中的表达对体细胞胚发生的生物学作用，用构
建的根癌农杆菌EHA105（携带pCAMBIA2301-35S-AtWUS）对橡胶树胚性易碎愈伤组织进行转化。根
据已报道的AtWUS序列设计特异引物，进行RT-PCR和序列分析，同时用重叠延伸 PCR技术（gene
splicing by overlap extension PCR，简称）构建AtWUS-EGFP融合基因。结果表明：与GenBank上EGFP
基因和拟南芥AtWUS序列同源性为100%，分别构建了pCAMBIA2301-35S-AtWUS（含有GUS和NPTII
基因）和pER8-AtWUS-EGFP（含有HPTII基因）载体，采用电击转化法转进根癌农杆菌EHA105中。最
后，通过GUS检测法鉴定了pCAMBIA2301-35S-AtWUS已经整合到橡胶树中。本研究分别成功构建了
组成型植物表达载体pCAMBIA2301-35S-AtWUS和诱导型植物表达载体pER8-AtWUS-EGFP，为橡胶
树遗传转化的研究奠定了基础。
关键词：AtWUS基因；EGFP基因；融合基因；重叠延伸PCR；橡胶树
中图分类号：S59 文献标志码：A 论文编号：2012-3631
Cloning of Arabidopsis WUS Gene, Construction and Identification of Plant Expression Vectors
Bi Zhenghong1,2, Li Zhe2
(1College of Agronomy, Hainan University, Danzhou Hainan 571737;
2Rubber Research Institute, CATAS/Key Laboratory of Rubber Biology, Ministry of Agriculture, Danzhou Hainan 571737)
Abstract: In order to study the effect of expression of AtWUS in embryonic friable calli on embryogenesis,
calli were co-cultivated with the A. tumefaciens strain EHA105 harboring a binary vector
pCAMBIA2301-35S-AtWUS. According to the reported AtWUS gene sequence, a pair of special primers was
designed, being carried out RT- PCR and sequence analysis. At the same time, SOE PCR (gene splicing by
overlap extension PCR) was used to form fusion gene AtWUS-EGFP. The results suggested that two fragments
cloned had a homology of 100% with AtWUS and EGFP gene respectively logged on GenBank. The
pCAMBIA2301-35S-AtWUS with uidA and nptII genes and pER8-AtWUS-EGFP containing hptII gene were
constructed. At last, GUS detection indicated that pCAMBIA2301-35S-AtWUS had been inserted into genome
of rubber tree. In a word, successful construction of constitutive plant expression vector
pCAMBIA2301-35S-AtWUS and induced plant expression vector pER8-AtWUS-EGFP laid foundations for
Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of rubber tree.
Key words: AtWUS gene; EGFP gene; fusion gene; SOE PCR; Hevea brasiliensis
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0 引言
植物体细胞胚发生是一个极其复杂的过程。近年
来的研究表明，众多基因参与了植物体细胞胚发生的
调控，其中WUS基因是一个典型的干细胞决定基因，
1996年 Laux[1]等利用 EMS诱变技术鉴定了WUS，发
现其基因突变体影响着顶端分生组织和花分生组织的
发育，由此推断WUS在无限顶端分生组织和有限花分
生组织中起着关键性的作用，并维持着结构和功能的
统一。Mayer等 [2]研究发现WUS编码 291个氨基酸，
是同源异型结构域蛋白(homeodomain protein)中的一
个新亚型。在植物胚胎发育过程中，WUS基因在 16
细胞胚的中央 4个细胞中表达，鱼雷胚时期表达区域
下移到第 3层细胞，而在胚晚期以及胚后茎尖分生组
织中，WUS在第 3层细胞之下表达[2]。在顶端分生组
织中，干细胞组织中心表达的WUS决定其上的细胞成
为干细胞，而由干细胞所表达的CLV3蛋白通过细胞
间隙移动到干细胞组织中心的周边，通过WUS/CLV3
之间的反馈调节环来完成器官的启动和干细胞的维
持[3-4]。在花分生组织中，WUS和LFY分别各自与AG
结合，共同作用，从而激活AG的表达[5-6]。近年来研究
发现，WUS基因可以异位诱导干细胞的形成[4,7-8]，Zuo
等[7]利用T-DNA标签法筛选出pga6突变体，用含诱导
型启动子的植物表达载体转WUS基因于突变体中，其
根外植体从无诱导剂培养基上转移到含有诱导剂雌二
醇的培养基上后可以产生体细胞胚，说明WUS可以改
变细胞的命运，致使根尖组织向胚性愈伤组织转变。
Li等[9]运用含有35S-35S-WUS的植物表达载体转化烟
草使WUS基因增强表达，结果转基因烟草地上部分出
现大量异位增生的突起，突起部分的细胞与分生组织
细胞相似，部分突起能够发育为叶芽、花芽，表明WUS
超表达引起烟草细胞异常分裂并在已分化组织中重新
启动了器官形成。Arroyo-Herrera等[10]利用诱导型启
动子将WUS基因转入咖啡中诱导WUS基因的超表
达，结果体细胞胚的发生提高了4倍。
天然橡胶是国家重要战略资源，天然橡胶的主要
来源是橡胶树(Hevea brasiliensis)，橡胶树组织培养体
细胞胚发生和植株再生是橡胶树生物技术研究的重要
内容[11]。当前，从橡胶树组织培养体细胞胚发生高频
率地得到再生植株仍然存在着许多困难[11-12]。笔者从
拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆得到AtWUS基因，
构建了以NPTII为筛选标记基因的组成型植物表达载
体 pCAMBIA2301-35S-AtWUS；同时以增强型绿色荧
光蛋白基因EGFP为报告基因，利用SOE-PCR方法获
得AtWUS-EGFP融合基因，构建了诱导型植物表达载
体pER8-AtWUS-EGFP，将这2个植物表达载体转入根
癌 农 杆 菌 。 并 用 植 物 表 达 载 体
pCAMBIA2301-35S-AtWUS转化橡胶树易碎胚性愈
伤组织，经过GUS染色为蓝色，获得了转基因愈伤组
织。以期为深入研究AtWUS基因在橡胶树转基因易
碎胚性愈伤组织、体细胞胚和再生植株中的表达和功
能奠定基础，为利用基因工程技术促进橡胶树组织培
养植株再生提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
植物表达载体 pER8由美国Rockefeller大学蔡南
海教授惠赠，p35S-EGFP由中国热带农业科学院橡胶
研究所程汉老师提供（EGFP的 NCBI登录号：EU
056363.1，该载体中的EGFP为 720 bp），100 bp ladder
marker、1 kb ladder marker、15000 bp ladder marker、
TransStart Taq DNA Polymerase、pEASY-T1载体、大肠
杆菌 DH5α、TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis
SuoerMix、Trizol试剂均购自北京全式金生物技术有
限公司，胶回收试剂盒、质粒提取及纯化试剂盒购自美
国Omega公司，根癌农杆菌EHA105由本实验室保存，
T4 DNA 连接酶、限制性内切酶 HindIII、EcoRI、
BamHI、SacI、XhoI和 SpeI购自NEB公司。PCR引物
合成及基因测序均由深圳华大基因公司完成。
1.2 方法
1.2.1 AtWUS基因cDNA的克隆与鉴定
（1）拟南芥总RNA的提取。拟南芥RNA提取所
用的器具和药品均为RNase-Free，处理方法按照文献
[13]进行。RNA提取按照Trizol法步骤进行。
（2）AtWUS基因引物设计与合成。依据NCBI上
登录号为(NM_127349.3)的AtWUS基因，设计了一对
扩增AtWUS基因全长(879 bp)的特异引物，上游引物
为 P1：CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGCA,下
游 引 物 为 P2：GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACG
TAGCTCAAGAGAAG，其中上游引物 5端加入
BamHI酶切位点（横线标示）和 2个保护碱基，下游引
物 5端加入 SacI酶切位点（横线标示）和 2个保护碱
基。
（3）AtWUS基因 cDNA的扩增。以拟南芥 RNA
为模板，利用北京全式金生物技术有限公司RT-PCR
试剂盒，一步法合成AtWUS基因的 cDNA序列。PCR
条件为：第一条 cDNA链的合成，在20 µL体系中分别
加入 total RNA 6 µL、Anchored Oligo(Dt)18 (0.5 µg/µL)
1 µL、2 × TS Reaction Mix 10 µL、TransScriptTM RT
Enzyme Mix 1 µL、Rnase-free Water 2 µL。42℃孵育
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毕政鸿等：拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定
30 min，85℃加热 5 min失活 TransScriptTM RT；WUS
cDNA的PCR扩增，在TransStart Taq DNA Polymerase
的催化下，反应为 94℃预变性 10 min；94℃变性 30 s；
53℃退火 30 min；72℃延伸 1 min；72℃延伸 5 min。反
应得到的 cDNA克隆片段，用1.0%的琼脂糖做电泳分
析。
（4）AtWUS基因 cDNA的克隆与测序。将PCR产
物回收纯化，与pEASY-T1载体以体积4:1的比例混合
连接到 pEASY-T1载体上，转化大肠杆菌 DH5α，在
75 mg/L卡那霉素和 75 mg/L羧苄青霉素的条件下培
养 12 h，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌液
PCR检测，将阳性菌落送往深圳华大基因公司测序。
1.2.2 组成型植物表达载体的构建
（1） 中 间 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA
2301-35S-GUS-NOS的构建。用HindIII和EcoRI分别
双酶切PBI121和 pCAMBIA2301植物表达载体，分别
电泳，回收纯化 PBI121载体酶切下的 35S-GUS-NOS
片段和 pCAMBIA2301载体（35S启动子 835 bp，GUS
基因 1812 bp，NOS终止子 287 bp）。在 10 µL体系中
加入3 µL pCAMBIA2301载体、6 µL 35S-GUS-NOS片
段和 1 µL T4DNA连接酶，16℃反应 30 min，以获得中
间植物表达载体 pCAMBIA2301-35S-GUS-NOS。然
后 42℃热激水浴 90 s转化大肠杆菌，37℃ 160 r/min培
养 1 h，然后涂布于含 75 mg/L卡那霉素的LB固体培
养基上。次日，随机挑取数个单菌落，分别接种于
20 mL LB液体培养基中，分别提取质粒酶切检测。
（2）组 成 型 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA
2301-35S-AtWUS的构建。用BamHI和ScaI分别双酶
切 pCAMBIA2301-35S-GUS-NOS植物表达载体和测
序正确的 pEASY-T1-AtWUS载体，分别电泳后回收
pCAMBIA2301-35S-NOS片段和WUS基因片段，同
1.2.2节（1）一样将二者连接、转化大肠杆菌并进行
PCR检测。
1.2.3 融合基因的构建
（1）融合基因引物设计与合成。根据重叠延伸
PCR方法的要求重新设计 2个引物对 [14]，引物对 1为
P3 和 P4，用于扩增 AtWUS 基因，上游引物 P3：
5-CCGCTCGAGCGGATGGAGCCGCCA-3，其 5端引
入XhoI酶切位点（单横线标示）和3个保护碱基；下游
引 物 P4：5-CGCCCTTGCTCACCATGTTCAGACG
TAG-3，其中下有波浪线的序列与AtWUS基因3端终
止密码子紧接的序列反向互补，并去除AtWUS基因的
终止密码子TAG；下有双横线的序列与EGFP基因 5
端起始密码子紧接的序列反向互补。扩增EGFP基因
的引物对为 P5和 P6，用于扩增EGFP基因，上游引物
P5：5-TGAGCTACGTCTGAACATGGTGAGCAAGG
GCG-3，其中下有波浪线的序列与AtWUS基因3端终
止密码子紧接的相应序列相同（去除AtWUS基因终止
密码子TAG），下有双横线的序列与EGFP基因5端起
始密码子紧接的相应序列相同。下游引物 P6：
5-GGACTAGTCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
CG-3，与EGFP基因的开放阅读框终止密码子紧接的
序列反向互补，并在5末端添加SpeI酶切位点（单横线
标示）和2个保护碱基。
下游引物P4下有双横线的序列与上游引物P5下
有双横线的序列反向互补，下游引物P4下有波浪线的
序列与上游引物P5下有波浪线的相应序列反向互补。
（2）融合基因的获取、TA克隆与测序。A：以
pEASY-T1-AtWUS 为 模 板 ，P3、P4 为 引 物 ，用
TransStart TaqDNA Polymerase进行特异 PCR扩增出
AtWUS基因；B：以pCAMBIA2301-35S-EGFP为模板，
P5、P6为引物进行特异 PCR扩增出EGFP基因；C：以
步骤A和B扩增所得的DNA片段为模板，用引物 P3
和 P6进行重叠聚合酶链式反应。A/B步骤扩增体系
皆为50 µL，其中上下游引物各为1 µL，dNTP 4 µL，模
板 DNA 1 µL，TransStart TaqDNA Polymerase 1 µL，
10×buffer 5 µL，补加 ddH2O至 50 µL。A、B反应条件
皆为 94℃预变性 10 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃
1 min，共 35个循环，72℃再延伸 10 min。步骤C反应
分两步进行，第一步，在50 µL体系中加步骤A、B扩增
片 段 各 1 µL，dNTp 4 µL，TransStart TaqDNA
Polymerase 1 µL，10×buffer 5 µL，加水至 50 µL，反应
条件为 94℃预变性 10 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃
1 min，共5个循环，72℃再延伸10 min；第二步：在第一
步 50 µL反应体系中补加 P3、P6引物各 1 µL，反应循
环为30个即可。PCR扩增产物用1%TBE电泳缓冲液
进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段，并与
pEASY-T1载体以体积 4:1的比例混合，16℃水浴
30 min连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，
37℃ 160 r/min培养1 h，然后涂布于含75 mg/L卡那霉
素的LB固体培养基上。次日，随机挑取多个单菌落，
分别接种于10 µL ddH2O中，混匀，吸取1 µL进行菌液
PCR，将阳性菌液送往深圳华大基因公司测序。
1.2.4 诱导型植物表达载体 pER8-AtWUS-EGFP的构
建 用XhoI和SpeI双酶切植物表达载体 pER8和测序
正确的重组 pEASY-T1-AtWUS-EGFP载体分别电泳，
回收纯化融合基因AtWUS-EGFP片段和pER8载体片
段，同 1.2.2节（1）一样连接、转化大肠杆菌和 PCR检
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测。
1.2.5 植物表达载体转化根癌农杆菌 用枪头各吸取
1 µL pCAMBIA2301-35S-AtWUS 和 pER8-AtWUS-
EGFP质粒分别与 25 µL EHA105感受态细胞混合，转
化条件：电容 330 μF，低电阻快速充电模式，电压
330 V，电阻 2000 Ω。电激后立即各加入 970 μL SOC
培养基，28℃ 150 r/min培养5 h后，分别涂布在含有卡
那霉素、利福平、链霉素的YEB固体培养基上，及含有
壮观霉素、利福平、链霉素的YEB固体培养基上，于
28℃培养48 h，其中壮观霉素、卡那霉素、利福平、链霉
素的浓度分别为 75、75、50、50 mg/L，之后分别挑取单
菌落进行PCR检测。
1.2.6 根癌农杆菌介导的 pCAMBIA2301-35S-AtWUS
植物表达载体对橡胶树愈伤组织的转化 以根癌农杆
菌EHA105介导pCAMBIA2301-35S-AtWUS植物表达
载体对橡胶树品种‘热研 88-13’易碎胚性愈伤组织进
行了遗传转化研究，方法参见文献[15]进行。
2 结果与分析
2.1 拟南芥RNA检测和RT-PCR产物的克隆、测序及
序列分析
以拟南芥叶片为材料，用Trizol法提取总RNA，如
图1所示，条带整齐清晰，完整性好，亮暗分明，几乎不
存在降解，28S的宽度和亮度几乎是 18S的 2倍，浓度
很高，OD260/OD280值在 1.8~2.0之间，说明：用Trizol法
提取的拟南芥RNA效果好，经过一步法RT-PCR扩增，
电泳，得到约900 bp的片段，如图2所示。通过深圳华
大基因公司测序结果表明，目的片段长达 879 bp，与
GenBank上 AtWUS核苷酸序列相比，同源性 100%
（NCBI登录号：NM_127349.3）。说明RT-PCR已经成
功克隆得到AtWUS基因。
2.2 融合基因的检测与序列分析
将重叠延伸 PCR技术获得的 PCR产物连接在
pEASY-T1载体上，利用XhoI和SpeI双酶切检测如图
3所示，片段大小在 1500~2000 bp之间，非常接近
1500 bp，与预期十分吻合。经华大基因测序结果表明
目的片段长 1600 bp，与GenBank上的AtWUS（NCBI
登录号：NM_127349.3）和 EGFP（NCBI 登录号：
EU056363.1）基因序列相比，同源性 100%。说明该融
合基因已经成功获得。
2.3 中间植物表达载体 pCAMBIA2301-35S-GUS的酶
切检测
提取植物中间表达载体 pCAMBIA2301-35S-
GUS，分别用 EcoRI、HindIII和 BamHI和 SacI进行双
酶切，双酶切后与标准分子量DNA在 1%琼脂糖凝胶
电泳。结果显示，分别为 3000 bp和 1800 bp的单一特
异条带，与预期的35S-GUS和GUS基因片段大小相符
（图4）。
2.4 组成型植物表达载体pCAMBIA2301-35S-AtWUS
和诱导型植物表达载体 pER8-AtWUS-EGFP的 PCR
检测
分 别 以 质 粒 pCAMBIA2301-35S-AtWUS 和
pER8-AtWUS-EGFP电击转化后的大肠杆菌菌液为模
板，用P1、P2对前者模板进行PCR，P3与P4、P5与P6、
28S18S
1 2 3 4 5
图1 Trizol法提取的拟南芥RNA
M：DNA marker DL100 bp；1：空白对照；2、3、4：WUS基因RT-PCR产物
图2 AtWUS基因的RT-PCR产物
M：DNA marker DL 10000 bp；1：pEASY-T1-AtWUS-EGFP载体；2：空白
对照；3、4、5：pEASY-T1-AtWUS-EGFP采用XhoI和SpeI双酶切。
图3 pEASY-T1-AtWUS-EGFP双酶切鉴定
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毕政鸿等：拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定
P3与P6分别组合对后者模板PCR鉴定，产物进行1%
琼脂糖凝胶电泳，产物大小如图5、图6所示，分别为约
900、900、700、1600 bp的特异片段，与预期AtWUS基
因、EGFP基因和AtWUS-EGFP融合基因大小吻合，说
明 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA2301-35S-AtWUS 和
pER8-AtWUS-EGFP已经构建成功，构建过程如图7和
图 8。同样，用相同的方式对转化的根癌农杆菌进行
菌液PCR检测亦得到相同的结果，表明两载体均成功
转入根癌农杆菌。
2.5 农杆菌介导的pCAMBIA2301-35S-AtWUS转化橡
胶树愈伤组织的GUS染色鉴定
以根癌农杆菌介导 pCAMBIA2301-35S-AtWUS
植物表达载体对橡胶树品种‘热研 88-13’易碎胚性愈
伤组织进行了遗传转化研究。农杆菌侵染后，经过4~
6个月的筛选，得到了5个具有卡那霉素抗性的橡胶树
易碎胚性愈伤组织系，并且通过GUS组织化学检测。
如图 9所示，其中一个系经GUS染色鉴定为阳性，初
步表明AtWUS基因转化橡胶树易碎胚性愈伤组织获
得了成功。
3 结论与讨论
近年来，随着AtWUS基因的研究不断深入，人们
认识到它与其他基因相互协调，反馈调控影响着植物
体胚发生、顶端分生组织、花分生组织和花序分生组织
的形成和发育[16]。Zuo等[7]、Li等[9]根据AtWUS基因编
码的转录因子能使周围细胞具有干细胞特征这一特
性，使拟南芥AtWUS基因在转基因植物中过表达引起
了体细胞胚发生和器官发生的形成。这种AtWUS基
因异位表达促进体细胞胚发生的生理功能，使得在其
他转基因植物中过表达AtWUS基因提高体细胞胚胎
发生率也成为可能 [10]。笔者成功克隆了拟南芥
AtWUS基因并构建了其植物组成型表达载体和
AtWUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体，并将
AtWUS基因转入橡胶易碎胚性愈伤组织中，一共获得
5个转化愈伤组织系，但目前未能观测到愈伤组织的
任何变化，推测目的基因在35S启动下可能表达量低，
未能引起体细胞胚的发生。本研究还将进一步将
AtWUS-EGFP融合基因通过根癌农杆菌侵染法转化
橡胶树易碎愈伤组织，通过诱导剂雌二醇不同剂量诱
导目的基因表达，寻找诱导橡胶树易碎愈伤组织体细
胞胚发生的目的基因最佳表达水平，从而深入研究超
表达AtWUS基因对其体细胞胚发生的影响。
本研究构建的2个植物表达载体分别携带uidA和
EGFP基因作为植物报告基因，其中绿色荧光蛋白基
因作为活体报告基因具有很多优点，其表达与种属无
关，不论所处的细胞的种类和位置如何，都能够在细胞
内自主表达；GFP荧光稳定，在荧光显微镜强光照射
下，其抗光漂白 (Photobleaching)能力比荧光素
(fluorescein)强[17]；GFP发射绿色荧光仅需分子氧的存
在，而无需其他外源的辅因子，荧光机制优良；对细胞、
组织无毒害，不会扰乱细胞的正常生长和功能；检测方
法简便，可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分
光光度计进行活体检测，等等[18]。因此，笔者将EGFP
与WUS基因连接形成融合基因，共用一个诱导型启动
M：DNA marker DL10000 bp；1：pCAMBIA2301-35S-GUS采用 EcoRI和
HindIII双酶切；2：pCAMBIA2301-35S-GUS采用BamHI和SacI双酶切
图4 pCAMBIA2301-35S-GUS双酶切鉴定
M：DNA marker DL 100 bp；1、2：AtWUS基因PCR产物
图5 pCAMBIA2301-35S-AtWUS PCR鉴定
M：DNA marker DL100 bp；1：WUS基因PCR产物；
2：EGFP基因PCR产物；3：WUS-EGFP融合基因PCR产物
图6 pER8-AtWUS-EGFP PCR鉴定
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子，下一步将用诱导剂雌二醇不同剂量诱导转
AtWUS-EGFP融合基因的活体细胞，通过观察荧光的
亮度就可以推测AtWUS基因表达量的高低，这样既能
保持目的基因的固有特性，不影响目的基因的稳定表
达，也能保持EGFP基因的正常活性。与此同时，本研
究中用GUS检测法能鉴定出转化的橡胶树易碎愈伤

HindIII和EcoRI分别双酶切pBI121和pCAMBIA2301，将pBI121上切下的35S-GUS和pCAMBIA2301经过T4 DNA ligase连接，
形成pCAMBIA2301-35S-GUS；再用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-35S-GUS和pEASY-T1-AtWUS，
回收pCAMBIA2301-35S和AtWUS并用T4 DNA ligase连接形成植物表达载体pCAMBIA2301-35S-AtWUS
图7 pCAMBIA 2301-35S-AtWUS植物表达载体构建流程
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毕政鸿等：拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定
组织说明GUS检测也是遗传转化中比较可靠的方法。
最后，笔者还应用了SOE-PCR方法，其目的是将2
个基因线性连接在一起。由于目的基因本身所含有的
限制性酶切位点与载体本身的相冲突，故找不到合适
的酶切位点进行常规的酶切和连接，而SOE-PCR方法
可以克服这个缺点，它主要是分别在 2对基因两侧设
用SOE PCR方法获得5‘端含有XhoI酶切位点，3’端含有SpeI酶切位点的AtWUS-EGFP融合基因，XhoI和SpeI分别双酶切AtWUS-EGFP融合基因
和pER8载体，回收并用T4 DNA ligase将二者连接构成植物表达载体per8-AtWUS-EGFP
图8 pER8-AtWUS-EGFP植物表达载体构建流程图
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计特异引物，同时衔接处的引物互补，第1个基因上游
引物和第2个基因下游引物分别加上与载体相同的酶
切位点。该方法方便、快捷、成功率高，可大大缩短实
验时间，是融合基因构建的首选之策。
参考文献
[1] Laux T, Mayer K F, Berger J, et al. The WUSCHEL gene is
required for shoot and floral meristerim integrity in Arabidopsis[J].
Development, 1996,122(1):87-96.
[2] Mayer K, Schoof H, Haecker A, et al. Role of WUSCHEL in
regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem[J]. Cell,
1998,95(6):805-815.
[3] Brand U, Fletcher J, Hobe M, et al. Dependence of stem cell fate in
Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity[J].
Science, 2000,289(5479):617-619.
[4] Schoof H, Lenhard M, Haecker A, et al. The stem cell population of
Arabidopsis shoot meristems is maintained by a regulatory loop
between the CLAVATA and WUSCHEL genes[J]. Cell, 2000,100(6):
635-644.
[5] Lenhard M, Bohnert A, Jürgens G, et al. Termination of stem cell
maintenance in Arabidopsis floral meristems by interactions
between WUSCHEL and AGAMOUS[J]. Cell, 2001,105(6):
805-814.
[6] Lohmann J, Hong R, Hobe M, et al. A molecular link between stem
cell regulation and floral patterning in Arabidopsis[J]. Cell, 2001,
105(6):793-803.
[7] Zuo J R, Niu Q W, Frugis G, et al. The WUSCHEL gene promotes
vegetative-to-embryonic ransition in Arabidopsis[J]. The Plant
Journal, 2002,30(3):349-359.
[8] Gallois J L, Nora F R, Mizukami Y, et al. WUSCHEL induces shoot
stem cell activity and developmental plasticity in the root meristem
[J]. Genes Dev, 2004,18(4):375-380.
[9] Li J H, Xu Y Y, Chong K, et al. Analysis of transgenic tobacco with
overexpression of Arabidopsis WUSCHEL gene[J]. Acta Botanica
Sinica, 2004,46(2):224-229.
[10] Arroyo-Herrera A, Gonzalez A K, Moo R C, et al. Expression of
WUSCHEL in Coffea canephora causes ectopic morphogenesis and
increases somatic embryogenesis[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult,
2008,94(2):171-180.
[11] 李哲,孙爱花,黄天带,等.橡胶树品种热研 88-13易碎胚性愈伤组
织的诱导及其植株再生[J].热带作物学报,2010,31(12):2166-2173.
[12] 王泽云,吴胡蝶,陈雄庭.橡胶花药体细胞植株的优良性状[J].热带
作物学报,1989,10(2):17-23.
[13] J萨姆布鲁克, E F弗里奇, T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南(第2
版)[M].北京:科学出版社,1996:330-332.
[14] 魏薇,李凡,陈海如.利用重叠延伸PCR技术扩增长片段DNA[J].云
南大学学报:自然科学版,2008,30(S1):86-88.
[15] 姜泽海.根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化及植株
再生研究[D].儋州:海南大学,2011.
[16] 徐云远,种康.植物干细胞决定基因WUS的研究进展[J].植物生理
与分子生物学学报,2005,31(5):461-468.
[17] 薛启汉.绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的
应用[J].江苏农业学报,1999,15(1):52-58.
[18] 杨秀芹,刘娣,祖延涛.绿色荧光蛋白(GFP)在分子遗传学上的研究
进展[J].黑龙江畜牧兽医,2001(7):36-38.
A为筛选的愈伤组织，B为阴性对照
图9 橡胶树愈伤组织转AtWUS基因GUS染色鉴定
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