全 文 ：0 引言
拟南芥根系对各种环境因子的响应可以用蛋白质
组学的方法进行研究[1]。但拟南芥微少脆弱的根系和
较低的蛋白质含量难以满足大规模高通量的蛋白质组
学研究要求，这使得以获取根系为目的的拟南芥常规
栽培方法成为重大技术障碍[2]。现有的基质培养和琼
脂固体培养法虽然可以获得完整无污染的叶片，但这
两种方法都不能达到以获取根系为目的的实验需求。
基金项目：国家自然科学基金资助项目“离子通道孔口对K/Na选择透性的结构基础”(30370125)；“核桃青皮杀螨活性成分及作用机理研究”
(30872029)；北京市自然科学基金重点项目“有机观光果园间作对有害生物及生态环境影响的研究”(6071001)，“北京市都市农业学科群项目”
(XK100190553)。
第一作者简介：胡昊，男，1983年出生，北京市人，硕士，研究方向：植物蛋白质组学。通信地址：102206北京市昌平区北京农学院植物科学技术系，
E-mail：genemax689@gmail.com。
通讯作者：王有年，男，1951年出生，北京市人，教授，研究方向：果树生理生态研究。Tel：010-80799006，E-mail：wynbua@126.com。
收稿日期：2009-03-20，修回日期：2009-04-20。
一种适用于拟南芥根系蛋白质组学研究的
无菌水培方法
胡 昊 1，邬瑞杰 1，花宝光 2,3，王有年 1,4
（1北京农学院植物科学技术系，北京 102206；2北京农学院生物技术系，北京 102206；
3北京农学院蛋白质组学平台，北京 102206；4北京市农业应用新技术重点实验室，北京 102206）
摘 要：应用蛋白质组学的方法研究拟南芥根系响应环境因子做出的蛋白质差异表达时，需要提取根系
的全部信息。过去拟南芥的培养方法不能满足蛋白质组学研究对根系样本在质和量两个方面的严格需
求，个别能够解决这个问题的方案又因为价格昂贵难以推广。通过在前人研究的基础上开发了一种简
单高效的拟南芥无菌水培系统。随机抽取这个系统培养的拟南芥根系分别进行双向电泳实验，通过蛋
白质点匹配，等点聚焦和SDS-PAGE方向坐标偏差分析，以及相对含量变异系数分析，证明这个水培系
统可以满足蛋白质组学对实验材料苛刻的要求。
关键词：拟南芥；无菌水培；根系；蛋白质组学
中图分类号：S188 文献标识码：A
A Hydroponic Culture Method of Arabidopsis thaliana under Sterile
Conditions for Root Proteomic Research
Hu Hao1, Wu Ruijie1, Hua Baoguang2,3, Wang Younian1,4
(1Department of Plant Science, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;
2Department of Biotechnology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;
3Proteomic Research Platform of Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;
4New Technology Key Laboratory of Agricultural Application in Beijing, Beijing 102206)
Abstract: When apply proteomics approaches to investigate Arabidopsis roots responses to environment
factors, gaining all information form roots are always required. Due to major technical obstacle, previous culture
methods were hard to meet the strict standards of proteomics analysis. Based on past methods, an easy,
low-cost and contamination-free hydroponic cultivation system for Arabidopsis is introduced. Random
seedlings in this system were selected to perform two-dimensional electrophoresis. The results of spots
detecting, position deviation in the isoelectric focusing and SDS-PAGE, and average coefficient of variability of
spot volume were proved this system is excellent for Arabidopsis proteomics analysis.
Key words: Arabidopsis thaliana, hydroponic culture under sterile conditions, roots, proteomic
中国农学通报 2009,25(11):25-29
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
12cm
4cm
图1 不锈钢筛网的制作
12 cm
4 cm
土培基质和琼脂基质的植物样品不能得到完整的根
系，损失在基质的部分恰恰是蛋白质合成最活跃的幼
嫩根尖和根毛，或由于根系被琼脂附着造成污染。而水
培法可以获得完整根系，先前的报道指出以尼龙网[3]、岩
棉块[4-6]、浮板[7]或琼脂块[8]作生长支持基质，以及由土
培基质向水培移栽[9]的水培方法，可以克服上述不足，
但这些水培法都是在不无菌的开放条件下进行的，因
此无法避免藻类和真菌的影响，且发芽不整齐，重复性
低。而且以岩棉块和琼脂块为生长支持基质的水培方
法更难以分离到完整根系，给实验结果带来负面影
响。所以采用无菌水培方法得到完整健康根系非常重
要。虽然已有的关于无菌水培的相关报道在很大程度
上可以解决上述困难，但其所用的容器制作相对比较
复杂，成本也较高 [10-11]，特别是忽略了水培的缺氧问
题。基于以上考虑，笔者建立了一种改进的高通量、重
复性好、成本低的拟南芥无菌水培方法，可以在短期内
获得大量完整健康的拟南芥植株，应用于根系蛋白质
组学研究。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)采用Columbia生态型
Col-0。水培营养液为 1/4 Hoagland营养液，配方为
1.25 mmol/L KNO3，0.5 mmol/L Ca(NO3)2，0.5 mmol/L
MgSO4，0.625 mmol/L KH2PO4，2 mmol/L NaCl，
42.5 μmol/L Fe-EDTA，17.5 μmol/L H3BO3，3.5 μmol/L
MnCl2，0.25 μmol/L ZnSO4，0.125 μmol/L CuSO4，0.05 μ
mol/L Na2MoO4，0.0025 μmol/L CoCl2，用葡甲胺(Fluka)
调节 pH 5.8，配成不同浓度的蔗糖溶液。培养容器采
用北京振泰园艺公司的280 ml锥形塑料组织培养瓶，
口径80 mm，高70 mm，据通气孔，耐高温可重复使用。
以 80目(180 μm)不锈钢筛网为栽培支持物，裁剪
成 12 cm×4 cm的长方形，折叠为 4 cm×4 cm的U型
(如图 1)。插入培养瓶中，注入 1/4 Hoagland营养液约
120 ml，筛网底部与营养液面保持 5 mm间隙，以防止
后期叶片被营养液浸没。盖好通气盖后湿热高压灭
菌。
1.2 方法
播种操作全部在无菌工作台上完成。将种子置于
灭过菌的离心管中，用70%乙醇浸泡灭菌30 s，吸出乙
醇，立即用10% NaClO浸泡灭菌5 min，最后用无菌水
清洗 5次，每次 30 s。将灭过菌的种子悬浮于 1 ml的
含1%琼脂糖和20%蔗糖的溶液中，置于加热器上保持
50℃。用1 000 μl移液枪，吸取少量种子，均匀的点到
培养瓶的筛网上。每瓶约 5~6粒种子，间隔 1 cm左
右。盖好瓶盖后，用酒精棉擦拭瓶盖，在瓶盖边缘处插
入已灭菌的连有 0.2 μm过滤器的 5号注射针头至瓶
底，并用 Parafilm膜封紧针头与瓶盖间的缝隙。使用
锡纸将筛网平面以下的瓶体包裹好，以尽量减小光照
对根系生长的影响。
将所有接种的培养瓶置于4℃冰箱中低温避光处
理48 h后移出。将培养瓶转移到人工气候箱中，在过
滤器另一端连接软管至通气泵。光周期为16 h光照，
8 h黑暗，光强 2000 lx，光照下温度为 22℃，黑暗下温
度为 18℃，相对湿度 70%。每日间隔 7 h通气 1 h，水
培营养液每周更换1次。
水培2周后，取出根系置于吸水纸上吸干水分，经
液氮研磨后称取 0.1 g样品，参考Tal等采用酚法[12]进
行全蛋白提取，所得蛋白溶于裂解缓冲液中(7 mol/L
尿素 (GE Healthcare)，2 mol/L硫脲 (GE Healthcare)，
4% CHAPS(Bio-rad)，20 mmol/L DTT(GE Healthcare)，
2% Bio-Lyte(Bio-rad))。等电聚焦使用24 cm，pH 4~7，
ReadyStrip IPG 固相胶条(Bio-rad)，上样量为 500 μg，
在PROTEAN IEF Cell(Bio-rad)上进行，累计聚焦时间
98 000 Vh，之后转移到 Ettan DALT six(GE Healthcare)
上进行 SDS-PAGE，采用 12.5%的 SDS-PAGE凝胶，电
泳条件为每张胶 2 W，30 min；之后转换为每张胶
17 W，直至溴酚蓝前沿跑出凝胶前沿。用考马斯亮蓝
G-250 染色 (Amresco) [13]。数据分析采用 PDQuest
Advanced 8.0.1软件(Bio-Rad)进行。
2 结果与分析
2.1无菌水培条件分析
不同生态型的拟南芥种子大小为 400~600 μm左
右[14]，选择生长支持基质应保证：(1)筛网孔径应小于种
子孔径，避免种子落入培养液中；(2)筛网孔径不会限
制根系生长进入营养液中。笔者在实验中选择了3种
型号的筛网进行测试，50目(355 μm)可以造成少量种
子会落入培养液，而80目(180 μm)和120目(125 μm)筛
网可以很好的支持种子，并使根系充分延伸。相对于
120目筛网来说，80目筛网则更廉价易得，此外不锈钢
筛网坚固稳定，不易变形，可重复使用[10]，因此选用了
·· 26
80目筛不锈钢网。
播种时将灭菌后的种子悬浮于含 1%琼脂糖和
20%蔗糖的高密度溶液中，这样可使用移液枪吸取单
粒种子进行播种。琼脂糖凝固后，种子牢固的固定在
筛网上，不会因搬运培养瓶造成种子移位或落入营养
液中。
一般情况下只有在琼脂固体培养基中才添加额外
的碳源蔗糖，以促进拟南芥幼苗快速生长[15]。为了进
一步提高拟南芥根系的生物量，在 1/4 Hoagland培养
液中添加不同浓度的蔗糖进行测试。添加2.5%(质量/
体积)的蔗糖比添 1%-2%(质量/体积)的蔗糖能更促进
根系生长，提高根系生物量，培养2周后拟南芥莲座叶
直径可达 1.5~2 cm，单株叶片鲜重达 0.06 g；主根上生
成大量侧根，侧根长度 3~5 cm，单株根系鲜重 0.04 g
(如图 2)。蔗糖浓度超过 3%后，植株莲座叶基部开始
呈紫色，叶片也逐渐转为暗绿色或紫色。

图2 无菌水培2周的拟南芥。
(A)生长于80目(180μm)不锈钢筛网上的叶片
部分；(B)水培根系部分。

图2 无菌水培2周的拟南芥。
(A)生长于80目(180μm)不锈钢筛网上的叶片
部分；(B)水培根系部分。 已有的报道都强调水培需要使用气泵通气为根系
供氧[4-5]，也有报道[8,16]认为在小型容器中水培无需通气
供氧。最近Karen等[6]对这两种不同的意见进行定量
检查的结果表明，在开放条件下水培拟南芥，不做通气
处理，3天后营养液含氧量从 (7.9±1.2)mg/L下降到
(1.0±0.3)mg/L，降幅达到88%，与之相伴随的是大量厌
氧诱导的基因产物堆积。可以想象，封闭条件下供氧
条件可能更加恶化。反之，通气的营养液中氧含量始
终保持在 8.0 mg/L左右，厌氧诱导的基因产物小到可
以忽略不计。这个结果证明，无菌水培系统通气供氧
是一个必须考虑的因素。为此笔者在无菌水培装置上
附加一个小型通气系统，让空气通过细菌过滤器进入
无菌培养液，并通过培养瓶瓶盖自带的通气孔排出，间
歇通气，这样就解决了无菌水培与根系通气间的矛
盾。
2.2 无菌水培拟南芥一致性和可重复性的双向电泳分
析
为了验证在这种标准化无菌水培条件下样本内拟
南芥根系蛋白质表达在个体间的一致性和可重复性，
笔者从人工气候箱中随机选择 3个培养瓶中的植株，
每瓶有5棵2周苗龄的拟南芥，以每个培养瓶中所有植
株的根系为独立实验组，采用PDQuest软件进行双向
电泳图谱分析(图3)，检测蛋白质点的大小、强弱，检测
和统计蛋白质点数目，建立平均定量凝胶测验并分析
图谱间蛋白点的差异和量的变化。软件分析显示，在
3个独立实验胶中分别检测到符合高斯模型的蛋白质
点997，1016，1016个，综合3张胶的匹配点和差异点由
软件自动生成参照(Master)胶，3个独立实验胶与参照
胶进行比较的结果表明，匹配率分别为 94%，96%和
96%，其中 3个独立实验胶中都完全匹配的蛋白质点
共计 994个。从 3个独立实验胶的 994个完全匹配的
蛋白质点中随机选取坐标位置相同的 25%(250个)的
蛋白质点，输出它们的 X、Y轴坐标，采用Microsoft
Excel 2007分析它们在第一向等电聚焦、第二向
SDS-PAGE中的位置偏差和相对含量的变异程度，验
证3个独立实验胶的重复性[17-18]。其中位置偏差在 IEF
方向为(0.526±0.303)mm，在SDS-PAGE方向为(0.754±
0.239)mm。蛋白质点的相对含量即构成该点的所有
像 素 强 度 值 的 总 和 ，采 用 PDQuest 的 归 一 化
(Normalization)功能抵消因样品或实验操作引起的误
差，用变异系数CV (coefficient of variability)表示变异
程度，3个独立实验胶的平均CV为(15.9±6.15)%。结
果显示3个独立实验胶在图1中标出的区域中蛋白质
点基本一致，重复性良好。
图2 无菌水培2周的拟南芥。
(A)生长于80目(180μm)不锈钢筛网上的叶片部分；(B)水培根系部分。
胡昊等：一种适用于拟南芥根系蛋白质组学研究的无菌水培方法 ·· 27
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3 讨论与结论
拟南芥是植物科学研究领域重要的模式植物，但
由于拟南芥自身生物量微小，且蛋白质含量较低，不能
满足当前以根系为研究目的的大规模高通量蛋白质组
学和代谢组学研究实验需要，虽然先前已有很多关于
拟南芥水培方案的报道，但都存在一定局限性,如从基
质和轻质中获取根系会造成根系机械损伤，或由于根
系被琼脂附着造成污染；开放式水培体系无法避免藻
类和真菌的污染，常规的无菌水培体系又无法解决根
系通气问题。为此，笔者开发了一种简单高效、具有良
好一致性和重复性的拟南芥无菌水培系统，以求建立
标准化水培模式，满足根系蛋白质组学研究对植物根
系材料的严格要求，并推动植物根系蛋白质组学的进
一步发展。
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B1 B2 B3
C1 C2 C3
B
A
C1 C2 C3
图3 无菌水培拟南芥根系的双向电泳图谱
注：根系参考Tal等方法[12]进行全蛋白提取，所得蛋白使用使用24 cm，pH 4~7，ReadyStrip IPG 固相胶条，上样量为500
g，等
电聚焦在PROTEAN IEF Cel上进行，之后转移到Etan DALT six
上进行 SDS-PAGE，使用考马斯亮蓝 G-250染色[13]。(B)3个独
立实验胶中图A的B区域的可重复性。(C)3个独立实验胶中图B
的C区域的可重复性。
1 1 1
2 2 2
3
3 3

B1 B2 B3
C1 C2 C3
B
A
C1 C2 C3
图3 无菌水培拟南芥根系的双向电泳图谱
注：根系参考Tal等方法[12]进行全蛋白提取，所得蛋白使用使用24 cm，pH 4~7，ReadyStrip IPG 固相胶条，上样量为500
g，等
电聚焦在PROTEAN IEF Cel上进行，之后转移到Etan DALT six
上进行SDS-PAGE，使用考马斯亮蓝 G-250染色[13]。(B)3个独
立实验胶中图A的B区域的可重复性。(C)3个独立实验胶中图B
的C区域的可重复性。
1 1 1
2 2 2
3
3 3
1 3
C C2 C3
图3 无菌水培拟南芥根系的双向电泳图谱
注：根系参考 Tal等方法 [12]进行全蛋白提取，所得蛋白使用使用 24 cm，pH 4~7，ReadyStrip IPG 固相胶条，上样量为 500 μg，等电聚焦在
PROTEAN IEF Cell上进行，之后转移到Ettan DALT six上进行SDS-PAGE，使用考马斯亮蓝 G-250染色[13]。(B)3个独立实验胶中图A的B区域的可
重复性。(C)3个独立实验胶中图B的C区域的可重复性。
·· 28
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