全 文 ：华北农学报·2016，31(4):19 -25
收稿日期:2016 － 03 － 20
基金项目:国家自然科学基金项目(31470289)
作者简介:刘晓东(1975 －)，男，新疆乌鲁木齐人，副教授，博士，主要从事植物抗逆分子生物学研究。
通讯作者:李 月(1984 －)，女，河南许昌人，讲师，博士，主要从事棉花分子生物学研究。
两种拟南芥 CBF2 基因突变体的鉴定与分析
刘晓东1，刘 超1，焦彬彬2，代培红1，苏秀娟1，李 月1
(1．新疆农业大学 农学院，新疆农业大学农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052;2．上海出入境检验检疫局，上海 200135)
摘要:低温是主要的逆境胁迫之一，限制了作物的地理分布和产量。筛选理想的抗冻靶基因用于分子育种对于
稳定农业生产具有重要意义。CBF调节子在植物抗冻反应中扮演主要的角色，CBF2 是 CBF调节子的组成成分之一，
在抗冻反应中扮演负调控的作用。采用 qＲT-PCＲ和常规农艺性状测定法对 2 种 CBF2 基因突变体 cbf2-1 和 cbf2-2 进
行了多项指标的鉴定，结果发现在这 2 种突变体中 CBF2 基因的表达存在不同程度的缺陷，cbf2-1 中 CBF2 基因受低
温诱导表达，但表达量与对照相比，明显下降;而 cbf2-2 中 CBF2 基因诱导表达的效应完全丧失。抗冻性检测结果显
示 CBF2 基因的表达量越低，其突变体植株的抗冻性越强，同时冷胁迫后冷响应的下游基因表达量也越高，更重要的
是，虽然这 2 种 CBF2 基因突变体抗冻性明显增强，但与野生型植株相比，其开花时间和单株种子产量并没有明显变
化。以上结果表明 CBF2 是一种可以利用基因组编辑技术进行作物抗冻育种的理想候选靶基因，可以利用最新的基
因组编辑技术进行作物抗冻育种研究。
关键词:拟南芥;CBF2;抗冻;负调控
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2016)04 － 0019 － 07
doi:10． 7668 /hbnxb． 2016． 04． 004
Analysis and Identification of Two CBF2 Gene Mutants in Arabidopsis
LIU Xiaodong1，LIU Chao1，JIAO Binbin2，DAI Peihong1，SU Xiujuan1，LI Yue1
(1． College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Biological Technology，
Urumqi 830052，China;2． Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China)
Abstract:Cold stress is one of the major abiotic stress，which limits the geographical distribution and yield of
crops． CBF regulon plays a major role in freezing tolerance． CBF2，one of the components of the CBF regulon，has a
negative role in freezing tolerance． In this study，two SALK mutants whose T-DNA insertion are both within the pro-
moter of CBF2 gene，cbf2-1 and cbf2-2 were identified by qＲT-PCＲ method． Ｒesults showed that the level of CBF2
gene expression in the two mutants reduced． CBF2 gene expression was induced by low temperature in cbf2-1 mut-
nat． However，the degree of induction was lower in cbf2-1compared with the control． The effect of induction by low
temperature was lost in cbf2-2． Analysis of freezing tolerance showed that the less degree of induction，the stronger
freezing tolerance of plants and the higher the expression of downstream cold-responsive genes． More important thing
was that although freezing resistance of the two CBF2 gene mutants were improved，their flowering time and seed
yield per plant did not change significantly compared with the wild type plants． All the results indicate that CBF2
may be an ideal candidate target gene for crop breeding of freezing tolerance by genome editing technology．
Key words:Arabidopsis;CBF2;Freezing tolerance;Negative regulation
低温显著地限制了植物的地理分布和生长季
节，对作物的产量和品质产生不利影响。植物为了
生存，在长期进化过程中产生了一套复杂的基于低
温响应信号转导途径的调控机制，以增强自身的抗
冻性。转录因子在逆境信号传导中起重要作用。其
通过特定功能结构域结合下游抗逆基因的启动子，
诱导或抑制目的基因表达，使植物在生理生化方面
对逆境做出适应性调整，最终通过代谢调控，阻止细
20 华 北 农 学 报 31 卷
胞发生损伤，增强植物的抗逆性，包括抗冻性［1］。
DＲEB/CBF(Dehydration-responsive-element-binding
protein/C-repeat binding factors )蛋白，属于 APETALA2
(AP2)转录因子家族，可识别下游调控基因启动子
上的 CＲT /DＲE(C-repeat /dehydration-responsive ele-
ment)元件，进而调控靶基因的表达［2 － 3］。CBF通路
是拟南芥抗冻调控机制中了解最清楚的一个途
径［4 － 5］，在抗冻反应中扮演主要的角色，也称 CBF
调节子［3］。该调节子包括 3 个转录因子基因，分别
是 CBF1、CBF2 和 CBF3［6］，也分别称为 DＲEB1b、
DＲEB1c和 DＲEB1a［3］，这 3 个基因中任何一个过量
表达都能改变上百个低温响应基因的表达，提高植
物的抗冻性［7 － 9］。这 3 个基因在拟南芥基因组上以
串联的方式连接在一起，在低温处理几分钟后就能
被诱导表达［10 － 11］。然而他们自身的启动子上并不
包含低温诱导的 CＲT /DＲE 元件［12］。到目前为止，
CBF调节子提高抗冻性的分子机制并不完全清楚，
已研究发现涉及抗冻蛋白基因的表达［13 － 14］和一系
列低分子量冷冻保护剂的合成［15 － 17］。
拟南芥 CBF1、CBF2 和 CBF3 之间氨基酸序列
相似性高达 85%，而且这 3 个基因超表达后都能提
高拟南芥的抗冻性［16］，然而进一步研究发现，他们
的功能并不相同。首先 CBF1 和 CBF3 受低温诱导
表达的时间早于 CBF2，而且发现 CBF2 负调控
了 CBF1 和 CBF3 基因的表达［18］，但 CBF1 或
CBF3 并没有负调控其他 2 个 CBF 基因;其次
CBF1 和 CBF3 功能缺陷突变体的抗冻性明显减
弱，这与它们超表达后抗冻性增强的结果相呼
应［12］。然而 CBF2 功能缺陷突变体 cbf2 的抗冻
性却显著提高，并且发现可能是通过同时提高
CBF1 和 CBF3 基因的表达量增强了植物的抗冻
性［17］。与 CBF1 或 CBF3 组成型过量表达结果
不同的是，CBF1 或 CBF3 过量表达后，植株的抗
冻性 明 显 提 高 但 生 长 发 育 受 到 严 重 抑
制［16，19 － 20］，而 cbf2 突变体的抗冻性也显著提高，
但植株正常的生长发育并没有受到任何明显影
响［18］。上述研究结果揭示出 CBF2 在植物抗冻
反应中的负调控功能。本试验鉴定了 2 种 CBF2
功能不同缺陷程度的突变体，进一步研究 CBF2
与植物抗冻性之间的关系以及在作物抗冻育种
中的潜在价值。结果发现 CBF2 功能缺陷程度较
高的突变体，植株的抗冻性更强，而且生长发育
以及单株种子产量并没有受到明显影响。试验
结果表明，CBF2 可以作为作物抗冻育种的候选
靶基因。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 植物材料 野生型拟南芥(Arabidopsis thali-
ana，Columbia ecotype)为新疆农业大学农业生物技
术重点实验室保存。CBF2(At4G25470)基因的 T-
DNA插入突变体 Salk_009689 和 Salk_073208 购自
拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Ｒesource
Center)。
1． 1． 2 生化试剂 Easy Pure Plant Genomic DNA
Kit、Easy Pure ＲNA Kit、TransScript First-Strand cD-
NA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCＲ
SuperMix、Easy Taq DNA Polymerase、dNTP、DNA 标
准分子量均购自北京全式金生物技术有限公司，其
他生化试剂均为国产分析纯。引物合成由上海杰李
生物技术有限公司完成。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 植物培养 将野生型 Col-0 和突变体拟南
芥种子用 6%次氯酸钠消毒 5 min后，用无菌水清洗
5 次，播种到 1 /2MS 培养基中，于 4 ℃黑暗处理 3 d，
然后转到 22 ℃，14 h 光照 /10 h 黑暗，光照强度
6 000 ～ 8 000 lx的环境中培养 7 d。将其移栽到蛭
石 ∶泥炭土 ∶珍珠岩 = 6 ∶ 3 ∶ 1 比例混合的培养土中
继续培养。
1． 2． 2 拟南芥 AtCBF2 突变纯合体的鉴定 将拟
南芥新鲜幼苗叶片置于液氮中研磨，按照 Easy Pure
Plant Genomic DNA Kit 操作步骤提取叶片基因组
DNA。根据 http:/ / signal． salk． edu /网站上查到 Salk_
009689和 Salk_073208 的 T-DNA 插入位点信息，设
计基因特异引物 LP 和 ＲP 与 T-DNA 的 LBal，引物
序列见表 1。以基因组 DNA 为模板，分别以
LP1 /ＲP1和 LBal /ＲP为组合引物进行 PCＲ 扩增，以
野生型 Col-0 和突变体拟南芥基因组 DNA 为模板，
采用 Easy Taq DNA 聚合酶扩增，扩增为 20 μL 体
系:ddH2O 14 μL、10 × Easy Taq Buffer 2 μL、
2． 5 mmol /L dNTP 2 μL、10 μmol /L 正反向引物各
0． 5 μL、模板 0． 5 μL、Easy Taq DNA 聚合酶
0． 5 μL。PCＲ 反应条件为:94 ℃ 预变性 3 min;
94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环后
72 ℃延伸 10 min，PCＲ 产物在 1%的琼脂糖凝胶电
泳上检测有无目的条带。
1． 2． 3 野生型拟南芥和 CBF2 突变纯合体低温胁
迫后基因转录水平分析 将在上述培养条件下生长
20 d的野生型 Col-0 和突变体拟南芥幼苗，进行冷
胁迫处理。处理方法为:拟南芥苗置于盛有水(4 ℃
4 期 刘晓东等:两种拟南芥 CBF2 基因突变体的鉴定与分析 21
低温预冷)的大烧杯中，放置于 4 ℃培养箱，持续光
照。于上述处理的 0，1，3，6，12，24 h 采集叶片样
品，迅速置于液氮冷冻，按照 Easy Pure ＲNA Kit 操
作步骤提取 ＲNA，按照 TransScript First-Strand cDNA
Synthesis SuperMix 进行 cDNA 合成。利用 http:/ /
www． idtdna． com /Scitools /Applications /Primerquest /
在线引物设计软件进行基因 qＲT-PCＲ 引物的设计，
以拟南芥 ACT2 为内参基因(表 1)。根据 TransStart
Top Green qPCＲ SuperMix 说明书操作，反应体系为
cDNA 1 μL、10 μmol /L 正反向引物各 0． 5 μL、Top
Green qPCＲ Mix 10 μL、Passive Ｒeference Dye
0． 4 μL，超纯水补至 20 μL。利用 ABI7500 实时定
量 PCＲ 仪进行 PCＲ 扩增，反应条件为 95 ℃ 30 s;
95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环;72 ℃
30 s。数据采用 2 － ΔΔCT法分析。以看家基因 ACT2
为内参进行校正比较，检测 CBF2 基因在低温处理
0，4 h 2 个时间点的表达水平，同时检测下游基因在
0 ，1，3，6，12，24 h 6 个时间节点的表达水平。
1． 2． 4 拟南芥植株冷冻胁迫后苗期表型分析 将
在上述培养条件生长 20 d的野生型 Col-0 和突变体
拟南芥幼苗，置于可控低温培养箱中，参照文献
［18］方法进行低温胁迫处理，然后植株转移到上述
正常的生长条件，恢复生长 7 d，统计成活率。
1． 2． 5 拟南芥开花时间和单株种子量测定 将同
批种植的野生型和 cbf2 突变体植株移栽至土壤中
继续生长，生长条件为 22 ℃，14 h 光照 /10 h 黑暗，
记录各单株第 1 朵花开放的时间。另外种子开始成
熟后 1 个月，以 3 株苗为 1 个样本，收集所有种子，
然后在干燥箱中室温干燥 7 d 后，采用称重法测定
单株种子量，设置 3 个重复，分析突变体种子量是否
与野生型种子量存在差异。
1． 2． 6 数据统计 所有试验结果均为 3 次重复的
平均值 ±标准误差。采用 Microsoft Excel 2007 软件
对数据进行整理和方差分析;采用 SPSS v19． 0 软件
进行差异显著性检验。
表 1 引物序列
Tab． 1 Primer sequences used in this study
引物名称
Primer
序列(5 － 3)
Sequence(5 － 3)
LP ACATGCAAAATGTCTTTTCGC
ＲP GGAAACCGGAGACTCGTAATC
LBa1 TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
CBF2F TCAATTTCGCTGACTCGGCT
CBF2Ｒ AAGACCATGAGCATCCGTCG
AtACT2F GCACCCTGTTCTTCTTACCG
AtACT2Ｒ AACCCTCGTAGATTGGCACA
COＲ15AF AGCTGAGAAAGCTGCGGCGT
COＲ15AＲ TGGCATCCTTAGCCTCTCCTGCT
KIN1F GCCTTCCAAGCCGGTCAGAC
KIN1Ｒ TCCCGCCTGTTGTGCTCCAG
DＲEB2AF GACCGGTACCCGGGGAACAGT
DＲEB2AＲ TCCCTCGAGCTGAAACGGAGGTA
LTI78F GACGACAAAGGAAGTGGAGAAG
LTI78Ｒ ACCACCGAACCATCCTTTAATC
2 结果与分析
2． 1 T-DNA插入纯合突变体的鉴定
根据 TAIＲ(http:/ /www． arabidopsis． org /)提供
的信息，SALK_009689 和 SALK_073208 突变体 T-
DNA的插入位点分别为 CBF2 基因转录起始位点上
游 180，30 bp的启动子区内(图 1)。
图 1 拟南芥 CBF2 基因结构及其突变体示意图
Fig． 1 CBF2 gene structure and mutants sketch map of Arabidopsis thaliana
使用 http:/ / signal． salk． edu / tdnaprimers． 2． html
提供的 SALK_009689 和 SALK_073208 T-DNA 插入
位点两侧的正向引物 SALK_009689-LP 和 SALK_
073208-LP及反向引物 SALK_009689-ＲP 和 SALK_
073208-ＲP，以候选植株的基因组 DNA为模板，进行
PCＲ鉴定。若植株无 T-DNA插入即野生型，突变体
LP /ＲP引物可扩增出约 1 000 bp 的特异条带，若植
株为插入纯合体，由于插入较大片段的 T-DNA，超
出了 PCＲ 的扩增能力，则无扩增条带，若植株为杂
合体，LP /ＲP引物可以扩增出 1 000 bp 的 DNA 片
段，同时用 T-DNA 边界引物 LBa1 和 ＲP 引物组合，
会扩增出 535 ～ 835 bp大小的 DNA片段。
图 2 SALK_073208 和 SALK_009689
纯合突变体 PCＲ鉴定
Fig． 2 Electrophoresis results of SALK_073208 and
SALK_009689 mutants via PCＲ detection
22 华 北 农 学 报 31 卷
如图 2 所示为 SALK_073208 突变体的 PCＲ 鉴
定结果是 1 号植株和野生型(WT)植株结果一致，
即用 LP /ＲP引物有扩增条带，而 T-DNA 边界引物
LBa1 /ＲP未扩增出条带，表明没有 T-DNA插入。2，
3，4，5，6 号植株用 LP /ＲP 引物未扩增出目的条带，
同时用 T-DNA 边界引物 LBa1 /ＲP 扩增出目的片
段，表明这 5 个植株为 T-DNA 插入纯合突变体。
SALK_009689突变体 PCＲ 鉴定结果为 5 株苗均为
T-DNA插入纯合突变体。SALK_009689 和 SALK_
073208 的纯合突变体分别命名为 cbf2-1 和 cbf2-2。
2． 2 纯合突变体中 CBF2 基因的表达
在基因启动子区域中插入一段 T-DNA 会影响
基因表达水平下调或者不表达。为了检测 CBF2 基
因在野生型拟南芥和纯合突变体中的表达情况，对
这些植株进行了 4 ℃低温胁迫处理，分别于 0，4 h
2 个时间点检测基因的表达。如图 3 所示，在正常
生长条件下，CBF2 基因在 2 种突变体与野生型拟
南芥植株中均有低水平表达。在低温处理 4 h 时，
野生型植株 CBF2 基因大量诱导表达，但在 cbf2-1
和 cbf2-2 突变体中 CBF2 基因的诱导表达水平显著
降低，且在 cbf2-2 突变体中表达量下降最显著，与
0 h基本一致。以上结果表明，启动子区 T-DNA 的
插入抑制了 CBF2 基因的诱导表达，而 cbf2-2 突变
体中 CBF2 基因的低温诱导表达效应基本丧失。
2． 3 拟南芥植株冷冻胁迫后苗期表型分析
Novillo等［18］发现 CBF2 基因突变后，植株的抗
冻性显著增强。试验鉴定了 2 种 CBF2 基因 T-DNA
插入突变体，结果表明，这 2 种突变体导致 CBF2 基
因的表达存在不同程度的缺陷。因此，与野生型一
起，将 CBF2 基因 3 种不同表达量的遗传材料进行
了进一步的抗冻表型分析。结果发现植株的抗冻性
与 CBF2 基因的表达量呈现明显的负相关。随着基
因表达量的逐渐减弱，抗冻性也显著增强(图 4)。
成活率的统计也进一步验证了表型的观察结果，野
生型 Col-0 的成活率为 50%，cbf2-1 突变体成活率为
70%，cbf2-2 突变体成活率为 91%，2 种突变体的成
活率均显著性高于野生型，而 cbf2-2 突变体的抗冻
性显著高于 cbf2-1(图 4)。以上结果进一步证明了
CBF2 基因是一个抗冻负调控基因。
柱状图上的不同字母表示差异达到显著水平(P ＜ 0． 05)。图 4 同。
Different letters on each column are significantly
different (P ＜ 0． 05). The same as Fig． 4．
图 3 CBF2 基因表达的 qＲT-PCＲ分析
Fig． 3 CBF2 gene expression by qＲT-PCＲ
2． 4 下游耐逆基因的表达分析
Novillo等［18］的研究结果还发现，CBF2 基因突
变后提高了下游一系列耐逆相关基因的表达。因
此，cbf2-2 突变体中这些耐逆基因的表达是否也显
著高于 cbf2-1。为此本试验挑选了 4 个耐逆基因
COＲ15A、KIN1、DＲEB2A、LTI78 进行了表达验证分
析。将野生型和 2 种突变体材料于 4 ℃处理，分别
于 0，1，3，6，12，24 h 6 个时间节点采集叶片，提取
ＲNA，进行 qＲT-PCＲ 分析。结果如图 5 所示，这 4
个基因的表达趋势基本一致，即在 0 ，1 ，3 h的表达
量很低，在 6 h后基因的表达量开始明显增加。2 种
突变体中上述 4 个耐逆基因的表达量都显著高于野
生型，同时 cbf2-2 突变体中这些耐逆基因的表达高
于 cbf2-1。以上结果呈现出植株抗冻性与 CBF2 基
因的表达量存在明显的负相关性。
图 4 cbf2 突变体植株抗冻性和成活率分析
Fig． 4 Freezing tolerance of cbf2 mutant plants and analysis of survival rate
4 期 刘晓东等:两种拟南芥 CBF2 基因突变体的鉴定与分析 23
* ．差异显著(P ＜ 0． 05);＊＊ ．差异极显著(P ＜ 0． 01)。
Significant difference is based on Students t-test(* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01)．
图 5 野生型拟南芥和 cbf2 突变体中冷诱导基因的转录水平分析
Fig． 5 Transcript levels of cold-induced genes in the wild-type Arabidopsis thaliana and in the cbf2 mutant
2． 5 cbf2 突变体开花时间和单株种子量测定
抗逆性的增加往往会抑制植株的各种生产性
状［16 － 17］，进而阻碍抗逆育种的推广应用。开花时间
和单株种子产量是评价植株生产性状的 2 个重要指
标，因此对这 2 个指标进行测定。结果显示，无论是
开花时间还是单株种子量，cbf2 突变体植株与野生
型之间并没有明显差异。表明拟南芥 cbf2 基因突
变后，开花时间和种子产量这 2 个重要性状都没有
受到明显影响(图 6)。
图 6 cbf2 突变体开花时间(A)和单株种子量(B)分析
Fig． 6 Analysis of days to first open flower(A)and seeds of per plant(B)in the cbf2 mutant
3 讨论
DＲEB1 /CBF 转录因子广泛存在于各种植物
中，除了拟南芥外，还包括具有冷适应能力的植物，
如油菜和大麦;不具有冷适应能力的植物，如番茄和
水稻，以及大豆、葡萄等［21］。在拟南芥基因组中有 6
个 DＲEB1 /CBF 基因，分别命名为 DＲEB1A /CBF3、
DＲEB1B /CBF1、DＲEB1C /CBF2、DＲEB1D /CBF4、
DDF1 /DＲEB1F 和 DDF2 /DＲEB1E。其 中 只 有
CBF1、CBF2 和 CBF3 这 3 个基因受低温胁迫高水
平诱导表达［3，10］，它们组成一个 CBF 调节子，开启
了一系列与低温适应有关基因的表达，这些基因的
启动子包含有 CＲT /DＲE元件。其中 CBF1 和 CBF3
基因的过量表达都能增强植物的抗冻性，同时其对
应的功能缺陷突变体都表现出抗冻性减弱。不仅如
此组成型表达 CBF1 或 CBF3 的转基因植株还表现
出对干旱和高盐胁迫的耐受性［22］。由于 CBF1 和
CBF3 对 多 种 逆 境 抗 性 的 功 能 表 现，因 此
DＲEB1 /CBF基因在各种植物中被广泛克隆，同时也
被广泛地用于各种作物抗逆性的遗传改良［21］。然
而组成型表达 CBF1 和 CBF3 基因，却常常导致植
株发育迟缓，生长不正常，并严重地影响了
DＲEB1 /CBF基因在育种中的应用。随后的研究发
现使用诱导型启动子，可以有效减弱组成型表达所
带来的负面效应［22］。但是由于转基因所产生的生
物安全性问题引起社会极大的争议，严重地阻碍了
转基因作物，尤其是转基因粮食作物的市场推广。
在植物体内有许多调控抗逆性的基因，除目前
普遍使用的正调控基因外，还存在一些负调控基因，
这些基因突变，功能丧失后，植物的抗逆性也明显增
24 华 北 农 学 报 31 卷
强，如 EＲA1［23］、ASG2［24］、SAD1［25］、GGB［26］ 和
DST［27］等，而且一些突变体的生长发育与野生型相
比并没有明显改变，其中 CBF2 就属于这类基因。
研究发现 CBF2 基因的突变，显著提高了 CBF1 和
CBF3 基因的表达，并且被定时定量地控制，且没有
一直持续地高水平表达，这样低温来袭时，既提高了
抗冻相关基因的表达，又有效地避免了由此带来的
副作用，植物的生长发育没有受到明显抑制［18］。本
研究鉴定了 2 种在 CBF2 基因启动子区存在T-DNA
插入的纯合突变体。T-DNA 在启动子区的插入显
著抑制了 CBF2 基因的诱导表达，其中在 cbf2-2 突
变体中，CBF2 基因的诱导表达效应几乎完全丧失。
通过对这 2 种 CBF2 功能不同缺陷程度的突变体研
究发现，植株的抗冻性与 CBF2 基因表达量呈明显
的负相关，CBF2 基因表达量越弱，其植株的抗冻性
越强，而且下游相关抗冻功能基因的表达也越高。
更重要的是，这 2 种突变体抗冻性增强但植株开花
时间和单株种子产量并没有受到明显改变，即使是
cbf2-2 突变体也是如此。开花时间和单株种子产量
是农作物的 2 个重要农艺性状，因此以上结果暗示
着 CBF2 可以作为作物抗冻育种的候选理想靶
基因。
在大多数作物中都存在 CBF 的同源基因［21］，
其中是否也拥有 CBF调控子结构，是否也存在这种
抗冻负调控基因。因此，有必要进一步开展相关的
研究工作，克隆作物中可能存在 CBF2 类的抗冻负
调控基因，然后通过基因功能互补分析，验证筛选出
对应的抗冻负调控基因，最后采用基因组编辑技
术［28］敲除该基因并验证其抗逆功能，创制出具有更
高抗冻能力且其他农艺性状正常的植株，为作物抗
冻育种提供优良的亲本材料。同时可以有效避免转
基因育种面临的生物安全性评价和生产监管问
题［29］。
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