全 文 ：华北农学报·2014，29(6) :214 -219
收稿日期:2014 － 10 － 18
基金项目:国家自然科学基金项目(31060163) ;国家青年基金项目(31201066)
作者简介:张彦桃(1975 －) ，女，内蒙古呼和浩特人，助理研究员，在读博士，主要从事植物生化与分子生物学研究。
通讯作者:亢 燕(1982 －) ，女，内蒙古呼和浩特人，讲师，博士，主要从事植物生化与分子生物学研究。
doi:10． 7668 /hbnxb． 2014． 06． 036
拟南芥高亲和性钾转运体 AtHAK5 参与
植物根对盐胁迫及 ABA的反应
张彦桃，王 欣，祁 智，亢 燕
(内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)
摘要:为研究在不同逆境，如低钾、低钙、NaCl及 ABA胁迫下，对拟南芥高亲和性钾转运体基因 AtHAK5 表达的影
响，在对含有 promoter AtHAK5::GUS融合基因的拟南芥转基因植株进行组织化学染色基础上进行 Ｒeal time ＲT-PCＲ
检测。结果表明，这些逆境条件可以引起拟南芥 AtHAK5 基因表达量的上调。同时在对拟南芥 Col-0 和 AtHAK5 缺失
突变体 athak5 表型对比分析，发现 AtHAK5 参与植物根对盐胁迫及 ABA的反应。
关键词:AtHAK5;拟南芥;非生物胁迫
中图分类号:S143． 3 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2014)06 － 0214 － 06
Arabidopsis thaliana High-affinity Potassium Transporter AtHAK5
Participated in the Ｒesponse to Salt Stress and ABA in the Plant Ｒoot
ZHANG Yan-tao，WANG Xin，QI Zhi，KANG Yan
(College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China)
Abstract:In present study，the expression of AtHAK5 gene were found to be induced by some abiotic stress，
such as low potassium，low calcium，NaCl and ABA by GUS activity based histochemical staining of the Arabidopsis
thaliana transgenic plants containing a promoter AtHAK5::GUS fusion gene． These stress could up-regulate the ex-
pression of AtHAK5 gene of Arabidopsis thaliana confirmed by Ｒeal time ＲT-PCＲ． The differences of growth pheno-
type between wild-type Arabidopsis thaliana(Col-0)and the mutant(athak5)in the various abiotic stress treatments
proved that AtHAK5 participated in the response to salt and ABA in the plant root．
Key words:AtHAK5;Arabidopsis thaliana;Abiotic stress
钾是植物中大量存在的阳离子，在植物的代谢、
生长及胁迫适应方面发挥重要作用。植物能够有效
地感应 K +并且适应不同浓度的钾环境，是由于植
物的根系统存在不同的钾吸收机制。在大麦(Hor-
deum vulgare L．)中存在两相的根吸收系统，即高亲
和性钾吸收系统和低高亲和性钾吸收系统［1］，同样
的模式在其他植物中也存在［2］。由于在根土界面
钾离子的浓度经常在微摩尔级别，所以对农业生产
具有重要意义的高亲和性钾吸收系统成为研究的热
点。在一些植物中，KUP /HAK /KT家族是主要的高
亲和性钾吸收系统，T-DNA 插入突变体研究证实
AtHAK5 是这一家族中主要的钾离子转运体之一，
定位于细胞质膜［3］。研究发现，AtHAK5 功能缺失
突变体 athak5 的高亲和性钾离子吸收能力降低，在
低钾培养基上根长变短［3］。
钙是植物生长所需的大量元素之一，同时钙离
子也是维持植物多种代谢活动正常运行的物质保
障，是植物细胞内多种信号转导途径中重要的第二
信使。钙离子不仅维持着细胞膜内外两侧的电位平
衡，而且对植物细胞应对各种胁迫反应有重要作用。
在农业生产中，一个影响钾吸收的重要因素就是盐
胁迫。ABA(Abscisic acid，脱落酸)除了在种子发育
6 期 张彦桃等:拟南芥高亲和性钾转运体 AtHAK5 参与植物根对盐胁迫及 ABA的反应 215
方面发挥一定作用，在植物非生物胁迫中也起着重
要作用，也可以作为一种内源的信号物质来调节离
子进入木质部微管组织［4 － 5］及调节气孔的开
度［6 － 7］。Ｒoberts 等［5］首次证实植物根中的 K +通道
可以被 ABA所调节。
之前大量研究证实，拟南芥高亲和性钾转运体
基因 AtHAK5 在低钾的环境条件下表达量成倍上
升［8］。而盐胁迫、低钙及 ABA等这些影响植物生长
发育的非生物胁迫因素对植物高亲和性钾转运体基
因 AtHAK5 的表达有何影响，AtHAK5 是否参与了植
物对以上非生物逆境胁迫的响应，目前尚无报道。
因此，本研究对这些问题进行了探讨。
1 材料和方法
1． 1 材料
拟南芥哥伦比亚野生型种子 Col-0 由内蒙古大
学生命科学学院植物逆境信号转导实验室保存，拟
南芥突变体 athak5 Salk_101014 种子购自拟南芥资
源 中 心 (Arabidopsis biological resource center，
ABＲC);稳定表达 promoter AtHAK5::GUS 融合基因
的拟南芥转基因植物 1172 promoter::GUS T3 种子
由本实验室建立和保存。
1． 2 主要酶及试剂
TransZol UP购自北京全式金生物技术有限公
司;ExTaq 聚合酶、DNaseⅠ、感受态细胞提取试剂
盒、限制性内切酶及反转录试剂盒购自大连宝生物
工程有限公司;T4 DNA 连接酶为 Promega 公司产
品;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化有
限公司;其余试剂均为国产分析纯试剂。
1． 3 对照(CK)培养基
大量 元 素:0. 5 mmol /L H3PO4，2 mmol /L
Ca(NO3)2，1 mmol /L KCl，0． 75 mmol /L MgSO4;微
量元素:5 μmol /L H3BO3，1 μmol /L MnCl2，2 μmol /L
ZnSO4，0． 1 μmol /L CuSO4，0． 5 μmol /L Na2MoO4;铁盐:
74 μmol /L FeSO4·7H2O，74 μmol /L Na2·EDTA·2H2O，
5 mmol /L MES(MES hydrate) ，1% 蔗糖，BTP(BIS-
TＲIS propane)调 pH值至 5． 8，1． 0% 琼脂糖。低钾
培养基含有 50 μmol /L KCl(LKC:Low K CK)。
1． 4 方法
1． 4． 1 拟南芥组织化学染色检测 将稳定表达
promoter AtHAK5::GUS融合基因的拟南芥转基因植
株 1172 promoter::GUS 的 T3 种子播种于 CK 培养
基上，4 ℃春化 3 d，22 ℃光照(16 h光照 /8 h黑暗)
竖直培养 8 d(根长 2 ～ 3 cm) ，挑选长势较好的植株
给予不同胁迫处理，48 h 后进行组织化学法染色，
在显微镜下观察根的染色情况。
1． 4． 2 Ｒeal time ＲT-PCＲ 经过不同胁迫处理的拟
南芥植株，TransZol UP 提取其总 ＲNA，Prime Script
Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis kit 反转录为 cDNA，以
Actin2-LF(5-GCCAATCCGGTGCTGGTAACA-3)和
Actin2-ＲF (5-CATACCAGATCCAGTTCCTCCTCCC-
3)作为内参基因引物，AtHAK5-LF(5-GAAAGGGA
TGGTTTATCTAATG-3)和 AtHAK5-ＲF(5-ATCGCA
AGTGCTTTGTCTCC-3)为目的基因引物进行 Ｒeal
time ＲT-PCＲ。
1． 4． 3 athak5 T-DNA插入突变体的鉴定 提取生
长于 1 /2 MS培养基上 13 d的拟南芥突变体 athak5
(Salk_101014)总 DNA，以引物 SALK_101014-L(5-
CAAGTGTTACAATTGCACATGC-3)，SALK_101014-
Ｒ(5-CTCGTACTTAGCCGAGGTGTG-3)和 LBb1． 3
(5-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3)分别进行 PCＲ
检测。
1． 4． 4 拟南芥野生型 Col-0 与 athak5 表型分析逆
境胁迫浓度 Ca2 +浓度梯度:0，100，500，1 000 μmol /L。
K +浓度梯度:0，1，10，50，1 000 mmol /L。Na +浓度
梯度:0，10，20，50，100 mmol /L。ABA 浓度梯度:0，
0． 1，0． 3，0． 6，1． 0 μmol /L。
2 结果与分析
2． 1 不同矿质离子、ABA 和盐胁迫条件对
AtHAK5 基因表达的影响
为了验证除低钾环境条件外，是否有其他因素
可以调控 AtHAK5 基因的表达，本试验分别选取了
钾、钙、镁、氮、磷等植物生长所需的矿质离子、植物
激素 ABA和 NaCl胁迫等作为逆境诱导条件，对可
以稳定表达全长 AtHAK5 启动子和 GUS 基因的 T3
转基因植株(1172 promoter::GUS)进行诱导。在
合适的诱导条件下，AtHAK5 启动子可以启动下游
GUS基因的表达，在底物存在的情况下，经酶催化
后肉眼可见拟南芥根部变蓝。显微镜下观察结果
见图 1。
在没有任何处理的条件下，转基因植株(1172
promoter::GUS)的根部没有观察到蓝色(图 1-A) ，
说明 AtHAK5 基因的表达需要一定的诱导条件;在
缺失钾的培养基上，1172 promoter::GUS 的根部观
察到明显的蓝色(图 1-B)，说明 K +缺乏的条件可诱
导拟南芥根中 AtHAK5 基因大量表达，这与已报道
的研究结果一致［8］;另外本研究发现，经过低钙(图
1-C)、NaCl(图 1-G)和 ABA(图 1-H)胁迫处理后，转
基因植株(1172 promoter::GUS)的根部可以观察到
216 华 北 农 学 报 29 卷
蓝色，说明低钾、低钙、NaCl 和 ABA 胁迫处理均可 诱导 AtHAK5 基因的表达。
A． 1172 promoter::GUS生长在 CK培养基;B、C、D、E、F． 1172 promoter::GUS生长于缺 K、缺 Ca、缺 Mg、缺 N、缺 P的培养基;G、H． 1172
promoter::GUS生长于添加 100 mmol /L NaCl、10 μmol /L ABA的培养基(A、B、G Bar = 25 μm) ;(C、D、E、H Bar = 18 μm) ;(F Bar = 10 μm)。
A． 1172 promoter::GUS were grown on CK culture medium;B，C，D，E，F． 1172 promoter::GUS were grown on low potassium，low calcium，
low magnesium，low nitrogen or low phosphorus culture medium;G，H． 1172 promoter::GUS were grown on culture medium
containing 100 mmol /L NaCl and 10 μmol /L ABA(A，B，G Bar = 25 μm) ;(C，D，E，H Bar = 18 μm) ;(F Bar = 10 μm)．
图 1 不同胁迫条件下拟南芥 1172 promoter::GUS转基因植株根部 GUS组织化学染色
Fig． 1 Ｒesults of GUS staining in roots of 1172 promoter::GUS under the condition of different stresses
为了进一步验证上述试验结果，本试验又以野
生型拟南芥(Col-0)作为试验材料，在按照可使
1172 promoter::GUS 根变蓝的低钾(－ K +)、低钙
(－ Ca2 +)、添加植物激素 ABA(+ ABA)及 NaCl(+
NaCl)为诱导条件的基础上，进一步采用 Ｒeal time
ＲT-PCＲ法，在转录水平上对 AtHAK5 基因的表达量
进行检测，结果见图 2。
图 2 不同矿质离子、ABA和盐胁迫条件下 AtHAK5
基因 Ｒeal time ＲT-PCＲ检测结果
Fig． 2 Ｒesults of ＲT-PCＲ in different mineral
ions，ABA and salt stress conditions
Ｒeal time ＲT-PCＲ 试验结果显示:低钙、低钾、
添加 10 μmol /L ABA及添加 100 mmol /L NaCl处理
Col-0 后，AtHAK5 基因表达量均有不同程度的升高。
试验结果在转录水平上证实了除低钾诱导 AtHAK5
基因表达外，低钙、植物激素 ABA和 NaCl胁迫处理
同样可以诱导 AtHAK5 基因表达。
2． 2 矿质离子、ABA、盐胁迫等条件下拟南芥野生
型与突变体表型分析
为了进一步研究 AtHAK5 是否参与了植物对矿
质离子缺乏、ABA、盐胁迫等逆境条件的响应，本试
验选取了野生型 Col-0 和插入型功能缺失突变体
athak5 这 2 种植物，分别进行不同胁迫条件(低钾、
低钙、ABA和 NaCl)的表型分析。
2． 2． 1 athak5 T-DNA 纯合突变体的鉴定 athak5
T-DNA插入突变体是在野生型拟南芥(Col-0)的第
4 号染色体的 7 798 565 位置上插入了一段 T-DNA
而形成的功能缺失型突变体。利用插入的 T-DNA
序列上游引物 LP、T-DNA 序列下游引物 ＲP 和插入
的 T-DNA上特异性序列作为引物，根据不同大小的
PCＲ产物条带，判断植物的基因型。对试验所需的
拟南芥纯合突变体种子进行分子鉴定，以保证试验
材料的可靠性。结果见图 3。
图 3 拟南芥 T-DNA插入突变体 PCＲ鉴定结果
Fig． 3 PCＲ products of athak5
2． 2． 2 拟南芥野生型 Col-0 与 athak5 在钾浓度梯
度条件下生长情况 AtHAK5 是由低钾诱导的高亲
和性钾离子通道蛋白，而 athak5 是功能缺失型突变
体。因此，它们在不同的钾浓度培养基上的表型不
同。将拟南芥野生型 Col-0 与 athak5 分别播种于不
同钾浓度梯度的培养基上，其表型见图 4。
由图 4 可知，Col-0 与 athak5 突变体的根长随着
培养基中钾浓度的降低，总体呈下降趋势;在相同钾
浓度处理条件下，athak5 突变体的根比 Col-0 短，说
明 AtHAK5 基因在维持植物根系正常生长方面有重
要作用;随着培养基中钾浓度的降低，Col-0 与
6 期 张彦桃等:拟南芥高亲和性钾转运体 AtHAK5 参与植物根对盐胁迫及 ABA的反应 217
athak5 突变体的根长差距逐渐增加，在无钾培养基
上 athak5 突变体的根长只有 Col-0 根长的 1 /2，说明
athak5 突变体对低钾环境更为敏感。
2． 2． 3 拟南芥野生型与 athak5 突变体在钙浓度
梯度条件下生长情况 本试验根据不同钾浓度下
Col-0 和 athak5 的植物表型，分别选取了 50 μmol /L
和 1 mmol /L 这 2 个不同钾浓度作为诱导的背景条
件，分析 AtHAK5 基因是否参与了植物对低钙环境
的响应。
＊＊ ． P ＜ 0． 01;* ． 0． 01 ＜ P ＜ 0． 05。图 5 ～ 7 同。
＊＊ ． P ＜ 0． 01;* ． 0． 01 ＜ P ＜ 0． 05． The same as Fig． 5 － 7．
图 4 Col-0 与 athak5 在不同钾浓度培养基上根长分析
Fig． 4 The root length of Col-0 and
athak5 under various K + levels
A．正常钾(1 mmol /L K +) ;B．低钾(50 μmol /L K +)。
A． Normal K +(1 mmol /L K +) ;B． Low K +(50 μmol /L K +)．
图 5 不同钙浓度处理拟南芥 Col-0 及 athak5 的根长
Fig． 5 The root length of Col-0 and athak5 under various Ca2 + levels
A、B．正常钾(1 mmol /L K +) ;C、D．低钾(50 μmol /L K +)。图 7 同。
A，B． Normal K +(1 mmol /L K +) ;C，D． Low K +(50 μmol /L K +)． The same as Fig． 7．
图 6 正常钾及低钾环境不同钠浓度处理拟南芥 Col-0 与 athak5 的生长情况及根长
Fig．6 Growing condition and root length of Col-0 and athak5 under normal potassium and low potassium supplementing with different Na+
218 华 北 农 学 报 29 卷
在低钾(50 μmol /L K +)及正常钾(1 mmol /L
K +)的培养基上，Col-0 与 athak5 的根长随着培养基
中钙浓度的降低总体均呈下降趋势，说明 Col-0 与
athak5 对低钾与低钙环境敏感;2 种钾浓度培养基
中添加不同浓度的钙，当植物生长于低钙(100
μmol /L)的条件下时，Col-0 和 athak5 的根长都明显
变短，athak5 比 Col-0 根长只是略有差异，表明
AtHAK5 基因在植物根对低钙环境的响应过程中不
起主要作用(图 5)。
2． 2． 4 拟南芥野生型与 athak5 突变体在钠浓度梯
度条件下生长情况 为了研究 athak5 基因在植物
盐胁迫响应中的作用，对拟南芥 Col-0 及 athak5 突
变体在低钾及正常钾情况下，添加不同浓度的盐
(0，10，20，50，100 mmol /L NaCl)，观察植物的根及
整个植株的生长情况，结果见图 6。
由图 6 可知，正常钾条件下，高盐(50，100
mmol /L)情况下拟南芥 athak5 突变体根长显著小于
野生型 Col-0(图 6-B)，在 100 mmol /L NaCl 条件下
突变体的生长情况明显比 Col-0 弱(图 6-A) ;在低钾
情况下，添加 10 mmol /L NaCl 即可引起突变体根长
与野生型显著差别(图 6-D) ，而在 50，100 mmol /L
NaCl 的培养基上突变体的生长情况与野生型也有
明显差别，甚至 100 mmol /L NaCl 会抑制突变体的
发芽(图 6-C)。低钾环境中 athak5 突变体对高盐环
境更为敏感，说明 AtHAK5 参与了拟南芥对盐的胁
迫响应。
2． 2． 5 拟南芥野生型与 athak5 突变体在 ABA浓度
梯度条件下生长情况 ABA 是影响植物生长的一
个重要的逆境胁迫。研究证实，ABA 在植物种子发
育及非生物胁迫中起着重要作用，同时也可以作为
一种内源的信号物质调节离子进入木质部微管组织
及调节气孔的开度。本试验利用组织化学染色和
Ｒeal time ＲT-PCＲ 实验证实 ABA 可以引起表达量
升高。同时进一步利用 Col-0 和 athak5 在低钾和正
常钾条件下表型的差异，明确 AtHAK5 基因在植物
响应 ABA过程中的作用，结果见图 7。
图 7 正常钾及低钾环境不同 ABA浓度处理拟南芥 Col-0 与 athak5 的生长情况及根长
Fig． 7 Growing condition and root length of Col-0 and athak5 under normal potassium
and low potassium supplementing with different ABA
在外界环境钾浓度正常的条件下，分别添加 0，
0． 1，0． 3，0． 6 μmol /L 的 ABA 后，野生型 Col-0 与
athak5 突变体的根长逐渐变短，但根长差距不明显
(图 7-A)。当添加 1． 0 μmol /L 的 ABA 后，突变体
的根长为野生型植物根长的 79%(图 7-B) ，统计学
分析没有显著差异。在外界环境钾浓度低时，分别
添加 0，0． 1，0． 3 μmol /L 的 ABA 后，观察到野生型
Col-0 与 athak5 突变体在植物根长方面差距不大;
当添加 0． 6 μmol /L 的 ABA 后，突变体的根长为野
生型植物根长的一半，当添加 1． 0 μmol /L 的 ABA
6 期 张彦桃等:拟南芥高亲和性钾转运体 AtHAK5 参与植物根对盐胁迫及 ABA的反应 219
后，突变体的根长仅为野生型植物根长的 19%(图
7-C，D)。说明在外界环境钾浓度低时，athak5 突变
体对 ABA较敏感。
3 讨论
Ｒoberts 等［5］以玉米根部的皮层细胞和中柱细
胞的原生质体作为研究对象，采用膜片钳技术分析
了经水分胁迫处理及 ABA 处理的 K +流，结果发现
水分胁迫或 ABA处理对根皮层的 K +通道活性没有
明显影响，而 2 种处理均明显降低了中柱细胞 K +流
出通道的活性。同时相对于水分胁迫处理，ABA 处
理明显提高了中柱细胞 K +流入通道的活性。我们
从分子水平进一步研究了其中一个高亲和性 K +通
道 AtHAK5 对于几种非生物胁迫的响应，并得出以
下结论。
3． 1 AtHAK5 基因的表达
拟南芥 AtHAK5 基因属于 KUP /HAK /KT 家族，
在低钾条件下诱导表达高亲和性钾转运体
AtHAK5。本研究在对含有 promoter AtHAK5::GUS
融合基因的拟南芥转基因植株 1172 promoter::GUS
进行组织化学染色的基础上，进一步采用 Ｒeal time
ＲT-PCＲ从 ＲNA水平上证实了除低钾条件外，其他
一些逆境条件如低钙、盐胁迫、ABA 胁迫等均可以
不同程度地诱导 AtHAK5 基因的表达。
3． 2 AtHAK5参与植物根对盐胁迫及 ABA的响应
通过对拟南芥 Col-0 和 AtHAK5 缺失突变体
athak5 表型对比分析发现，AtHAK5 参与植物对盐
胁迫及 ABA的反应。由于高浓度 Na +可以竞争性
结合植物细胞上的钾结合位点，并且通过增加钾的
外排影响植物对环境中钾的吸收利用，从而引起植
物对高浓度盐胁迫的敏感现象。在低钾环境中，由
于 AtHAK5 参与了植物对盐的胁迫反应，所以
athak5 突变体的根对盐更为敏感，表现为 10 mmol /L
NaCl 时根长明显受到抑制，而在 100 mmol /L NaCl
时不能发芽。在高浓度钾的条件下，Col-0 不能表达
AtHAK5 基因，因此，外源 ABA 不能使 Col-0 和
athak5 在表型上产生区别;但在低浓度钾的条件下，
Col-0 可以表达 AtHAK5 基因，而 athak5 缺失，所以
它们在表型上会有明显差异。因此，可以认为 ABA
能够通过调节拟南芥高亲和性钾离子通道 AtHAK5
的活性来调节钾离子的运输，从而影响植物的生长
发育。因此，拟南芥高亲和性钾离子通道 AtHAK5
参与了植物对盐胁迫及 ABA的响应。
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