全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 1期，第 25-30页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.1, 25-30
研究论文
Research Article
抗草甘膦基因 GR79Mt表达载体的构建及拟南芥和苜蓿的遗传转化
孙展 郑兴卫 李聪 * 苗丽宏
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京, 100193
*通讯作者, licong0520@sina.com
摘 要 为获得抗草甘膦苜蓿株系，本研究在抗草甘膦基因 GR79Mt序列前加叶绿体转运肽基因 CTP2序
列，并在启动子和终止子两端分别加入 PvuⅠ酶切位点，插入到载体 pCAMBIA2300中，成功构建植物表达
载体 pCA-GM。采用 CaCl2冻融法将其转入农杆菌中，进一步基于农杆菌介导法进行了目的基因的拟南芥和
紫花苜蓿转化。经 PCR和 RT-PCR验证，目的基因已转入拟南芥中。本研究共得到 12株苜蓿抗性苗，经
PCR分析鉴定，其中两株转化成功，结果初步表明已将目的片段基因转入苜蓿中。本研究可为抗除草剂苜蓿
的应用提供了种质资源和参考方法。
关键词 拟南芥,紫花苜蓿,载体构建草甘膦抗性,遗传转化
Construction of Expression Vector of Glyphosate Resistant Gene GR79Mt
and Genetic Transformation in Arabidopsis thaliana and Medicago sativa
Sun Zhan Zheng Xingwei Li Cong * Miao Lihong
Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing, 100193
* Corresponding author, licong0520@sina.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000025
Abstract In order to get glyphosate-resistant transgenic alfalfa, we added the chloroplast transit peptide gene CTP2
to the 5 end of the existing glyphosate-resistant gene GR79Mt sequence. Plus restriction enzyme sites of PvuⅠ at
both ends before it was insert into the vector of pCAMBIA2300, and the plant expression vector pCA-GM was
constructed. The plasmid was transferred into Agrobacterium strain LBA4404 by CaCl2 freeze-thaw method, and
then transformed into Arabidopsis thaliana and Medicago sativa by Agrobacterium-mediated transformation system.
PCR and RT-PCR detection proved that the GR79Mt gene has been transformed into the genome of A. thaliana.
Twelve transgenic alfalfas were got totally, the result showed that two transgenic alfalfas were successfully got.
The results provided germplasm and methods for the application of glyphosate-resistant alfalfa.
Keywords A. thaliana, M. sativa, Expression vector construction, Glyphosate resistant, Transformation
收稿日期：2013-04-26 接受日期：2013-06-10 网络出版日期：2013-06-14
URL: http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1611-mpbopa
基金项目：本研究由十二五国家科技支撑计划(2011BAD17B01)和农业部苜蓿保种专项共同资助
拟南芥(Arabidopsis thaliana L. Heynh.)是遗传学
和分子生物学研究中公认的双子叶模式植物(曹仪
植, 2004)。而紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上
栽培最早、利用最广泛的多年生豆科牧草，具有“牧
草之王”的美誉(曹致中, 2002,中国农业出版社, pp.
190)。杂草是制约人工草地高产优质的主要因素之
一，合理控制田间杂草对苜蓿苗期草地成功建植，提
供高产优质的苜蓿干草都具有重大意义(郭德金和刘
丽华, 2004;郭艳艳等, 2012)。国际市场检验标准中规
定，商品苜蓿草杂草含量需在 8%以下，这对大田生
产中的杂草控制提出了更高的要求。
草甘膦是一种广谱、低毒、高效的灭生性有机膦
除草剂，在农业生产中应用广泛。草甘膦的作用机理
是竞争性抑制 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶
(EPSP合成酶)的活性，使芳香族氨基酸合成受阻，导
致植株死亡(朱玉等, 2003)。利用天然或突变的具有
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Molecular Plant Breeding
草甘膦抗性的 EPSP合成酶基因，即可获得具有草甘
膦抗性的植株。Shah等(1986)将高表达的 EPSP合成
酶基因插入植物染色体中，产生对草甘磷具有耐受
性的作物。Comai等(1985)研究表明，将编码对草甘
膦不敏感的 EPSP合成酶的 aroA突变基因转入植物
中，大幅增强了转基因植物的草甘膦抗性。Gox基因
编码草甘膦氧化还原酶，该基因的产物能够把草甘
膦降解成无毒物质，转化植物后同样具有草甘膦抗
性(Zhou et al.,1995)。
植物转基因方法主要有病毒转化(Vainstein et
al., 2011)、原生质体电激法(Miao and Jiang, 2007)、
基因枪法(Taylor and Fauquet, 2002)和农杆菌介导法
(Fraley et al., 1986)。其中农杆菌介导的转化方法是
应用最广泛、最为有效的转化方法。近年来，抗草甘
膦转基因作物研究进展迅速，主要围绕大豆、水稻等
主要农作物，在苜蓿上的转化研究国内尚未见报道。
本研究采用国内具自主知识产权的抗除草剂草甘膦
抗性基因 GR79Mt，通过农杆菌介导法转化拟南芥和
紫花苜蓿，以期为研究抗草甘膦苜蓿提供理论基础
和育种材料。
1结果与分析
1.1重组载体的鉴定
提取大肠杆菌中质粒 pCA-GM，用特异性引物
GR-F和 GR-R扩增 GR79Mt基因片段，电泳结果显
示，在 1 300 bp处得到条带(图 1)，与预期相同。用限
制性内切酶 PvuⅠ单酶切质粒 pCA-GM，显示原核表
达框和合成基因两个条带；用 SpeⅠ和 BamHⅠ双
酶切载体质粒，也切出 1 500 bp 左右的目的条带
(图 2)。上述结果均表明，载体 pCA-GM已构建成功。
1.2 T-DNA区鉴定
以 pCA-GM载体质粒为模板，TB-F/TB-R 为引
物，进行 PCR扩增，获得长度为 3 600 bp 左右的条
图 1 GR79Mt基因 PCR检测
注: M: DL2000 marker; 1: GR79Mt扩增片段
Figure 1 PCR testing of GR79Mt gene
Note: M: DL2000 marker; 1: GR79Mt PCR segment
图 2 pCA-GM质粒酶切鉴定
注: M: DL5000 marker; 1:质粒 PvuⅠ单酶切; 2:质粒 SpeⅠ和
BamHⅠ双酶切
Figure 2 Identification of pCA-GM vector
Note: M: DL5000 marker; 1: pCA-GM vector digested by PvuⅠ;
2: pCA-GM vector digested by SpeⅠ and BamHⅠ
图 3 pCA-GM载体 T-DNA区 PCR检测
注: M: DL5000 marker; 1: T-DNA扩增片段
Figure 3 PCR testing of T-DNA segment
Note: M: DL5000 marker; 1: T-DNA PCR segment
带(图 3)，与预期大小一致。表明转化质粒 pCA-GM
的 T-DNA区中含目的基因元件。
1.3 转基因拟南芥植株的获得及 PCR 和 RT-PCR
检测
因拟南芥的遗传转化体系相比紫花苜蓿来说已
比较成熟，本研究以农杆菌介导法先进行了拟南芥
的遗传转化，以便为苜蓿的转化提供经验。拟南芥转
化中共获得了 10株抗草甘膦的转基因植株，从中选
取 2 株进行了分子鉴定，以转基因拟南芥基因组
DNA 为模板，GR-F 和 GR-R 为引物，PCR 结果表
明这 2株拟南芥均成功扩增出 GR79Mt基因(图 4)。
TRIzol法提取转基因拟南芥和非转基因拟南芥的总
图 4 GR79Mt基因转化拟南芥植株的 PCR鉴定
注: M: DL2000 marker; 1~2:转化植株; P:质粒 pCA-GM
Figure 4 PCR analysis of transformed A. thaliana plants
Note: M: DL2000 marker; 1~2: Transformed plants; P: Plasmid
pCA-GM
26
RNA，利用 M-MLV反转录酶获得 cDNA，用特异性
引物 GR-F和 GR-R对 cDNA进行 PCR检测。转基
因拟南芥扩增出一条约为 1 300 bp的条带(图 5)，与
目的片段 1 322 bp相符合。以上结果证明 GR79Mt基
因已成功整合到拟南芥基因组中，并可以正常转录。
图 5 GR79Mt基因转化拟南芥植株的 RT-PCR鉴定
注: M: DL2000 marker; 1~2:转化植株; ck1:阴性对照; ck2:质
粒 pCA-GM
Figure 5 RT-PCR analysis of transformed A. thaliana plants
Note: M: DL2000 marker; 1~2: Transformed plants; ck1: Nega-
tive control (non-transgenic A. thaliana); ck2: Plasmid pCA-GM
1.4转基因苜蓿植株的获得
苜蓿下胚轴切成约 5 mm小段，在愈伤组织诱导
培养基上培养 2周左右，形成初期愈伤组织(图 6A)，
农杆菌侵染后继续诱导培养。将愈伤组织转入分化
培养基中，继续培养 4周左右，上面出现绿色芽点，
形成了成熟的胚状体(图 6B)。继续培养，当再生芽
长至 1 cm左右时将其切下，转入生根培养基中培养
(图 6C)。形成完整的植株后(图 6D)，移栽到花盆中，
在温室条件下继续生长。
图 6紫花苜蓿转基因植株的再生
注: A:愈伤组织; B:胚性愈伤组织; C:诱导生根; D:抗性植株
Figure 6 Regeneration of transformed alfalfa
Note: A: Callus; B: Embryonic callus; C: Root induction; D: Re-
generation plant
1.5转基因苜蓿的 PCR检测
经植物组织再生培养，共获得了 12株苜蓿抗性
植株，选择 2株转化植株做 PCR鉴定，分别以质粒
pCA-GM和未转基因苜蓿 DNA为阳性和阴性对照。
利用引物 GR-F和 GR-R对提取的植物基因组 DNA
做 PCR检测，均扩增得到 1 300 bp左右的条带，与
目的片段的大小一致(图 7)。结果初步表明，目的基
因已整合到苜蓿基因组中。
图 7转基因苜蓿的 GR79Mt基因 PCR检测
注: M: DL2000 Marker; 1~2:转基因苜蓿; ck1:阴性对照; ck2:
阳性对照
Figure 7 PCR testing of GR79Mt gene in transgenic alfalfa
Note: M: DL2000 marker; 1~2: Transgenic alfalfa; ck1: Negative
control; ck2: Positive control
2讨论
近年来，苜蓿转基因研究已取得很大进展，采用
农杆菌介导的紫花苜蓿转化体系也逐渐成熟。对苜
蓿进行转基因性状改良主要集中在包括抗病、抗虫、
抗逆和品质改良等方面(乔建江等, 2006)，以期增加
产量并提高品质。刘锡娟等(2007)使用花粉管通道法
将 epsps基因转入棉花中，获得具有草甘膦抗性的转
基因植株，并可耐受 4‰浓度的草甘膦异丙胺盐喷
洒。抗草甘膦转基因大豆在全球范围的种植面积也
不断增加。转抗草甘膦基因作物以大豆、水稻、棉花
等作物为主，在苜蓿中的研究国内未见报道。刘艳芝
等(2004)将 bar基因导入草原 1号苜蓿，经叶片筛选
试验证实转基因植株对除草剂草丁膦具有抗性，但
bar基因更多是作为筛选标记基因用于抗虫(冯道荣
等, 2001)、抗真菌(贾小霞等, 2009)等方面的研究。由
于草丁膦价格高昂，在农业生产应用中不太现实。而
草甘膦使用成本很低，因此开发具有草甘膦抗性的
苜蓿具有重大的现实意义。本实验所构建的载体中
目的基因亦可作为筛选标记基因，代替通常植物表
达载体中所含的报告基因(如 bar基因, gus基因, gfp
基因等)，转化成功后无需进行报告基因敲除，此外还
可以尽量降低外源标记基因带来的潜在环境影响。
抗草甘膦基因对土壤微生物的影响及基因漂移产生
抗草甘膦基因 GR79Mt表达载体的构建及拟南芥和苜蓿的遗传转化
Glyphosate Resistant Gene GR79Mt and Genetic Transformation in Arabidopsis thaliana and Medicago sativa 27
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
抗性杂草的问题，还有待于进一步研究。
在转基因作物的所有性状中，抗除草剂特性一
直占据主导地位。2008年，抗除草剂转基因作物占转
基因作物总种植面积的 80%以上(强胜等, 2010)。目
前，抗除草剂基因大多已被国外公司申请专利，并且
建立了大范围的知识产权体系。因此开发自主知识
产权的、商业化的抗草甘膦作物，成为当前国内研究
的重点。本研究所用的 GR79Mt基因由中国农业科
学院生物技术研究所提供，并拥有自主知识产权，有
效避开了产权纠纷。本研究通过农杆菌介导的方法，
成功获得 2株转基因苜蓿植株，经 PCR检测阳性转
化率为 16.7%，初步表明 GR79Mt基因已经成功整合
到苜蓿基因组中。为进一步分析转基因植株的生理
特征和抗除草剂水平提供了材料，并对我国抗除草
剂转基因苜蓿的培育和商业化应用提供了参考。
3材料和方法
3.1材料
拟南芥(Columbia生态型)、紫花苜蓿(中苜 6号)
由本实验室保存提供。抗除草剂基因 GR79Mt序列
由中国农业科学院生物技术研究所林敏研究员和
陆伟研究员提供，本实验室设计了载体元件(全长
3 156 bp)，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合
成，农杆菌 LBA4404购自鼎国龙哲。
3.2试剂与仪器
草甘膦(Glyphosate)、卡那霉素(Kan)、硫酸链霉
素(Str)、羧苄青霉素(Car)、植物凝胶(Phytagel)购自
Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物购自 Oxiod公司；
Taq DNA聚合酶、DL2000/5000/10000核酸分子量标
准购自 TaKaRa公司、质粒小提试剂盒购自 Omega
公司。其他试剂为进口或国产分析纯级，购自广达恒
益有限公司。
仪器：高压灭菌锅(MLS-3750型 , 日本三洋公
司)；超净工作台(SW-CJ-1FD型,苏州净化设备有限
公司)；恒温振荡器摇床(THZ-C 型 , 江苏太仓市实
验设备厂)；PCR 仪 (MyCyclerTM Thermal Cycler 型 ,
Bio-RAD公司)。
3.3培养基类型
农杆菌培养基为 YEB培养基；大肠杆菌培养基
为 LB培养基；预培养培养基、共培养培养基：MS+
2 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT+3%蔗糖+0.4% Phytagel；
愈伤组织诱导：SH+2 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT+
50 mg/L glyphosate +300 mg/L Car +3%蔗糖 +0.4%
Phytagel；愈伤组织分化：UM+0.2 mg/L KT+80 mg/L
glyphosate+300 mg/L Car+3%蔗糖+0.4% Phytagel；
生根培养基：1/2MS+300mg/L Car+1.5%蔗糖+0.4%
Phytagel。
3.4 引物设计
根据pCAMBIA2300序列和合成基因序列，采用
primer premier5.0分析软件设计引物。其中，GR-F和
GR-R用于 GR79Mt片段扩增，引物序列为 5-CCT-
CAAGATCACCTTGGTCAA-3和 5-GTTGTATTC-
CACATGTATTCC-3。TB-F和 TB-R用于植物表达
载体 T-DNA区扩增，引物序列为 5-TGGCAGGAT-
ATATTGTGGTG-3和 5-TTCTCTTAGGTTTACC-
CGCC-3。
3.5载体构建与合成
在 NCBI 中搜索植物表达载体 pCAMBIA2300
(GenBank: AF234315.1)，获取驱动 ntpⅡ基因的 CA-
MV35S启动子序列。HSP基因(GenBank: X06932.1)
为矮牵牛花热休克蛋白 70 的 5 非翻译前导序列
(Winter et al., 1988)，CTP2 基因(GenBank: X06613.1)
编码叶绿体转运肽，能够引导目的蛋白在芳香族
氨基酸合成场所叶绿体上的定位(Klee et al., 1987)。
GR79Mt是草甘膦抗性基因，具有较强的草甘膦耐受
性，其序列由中国农业科学院生物技术研究所提供。
E9 3 源自豌豆核酮糖 -1,5- 二磷酸羧化酶小亚基
(rbcS) E9 基因(GenBank: X00806.1)的 3 非翻译区，
可终止转录并指导 mRNA的多聚腺嘌呤化(Coruzzi
et al., 1984)。HSP和 CTP2间插入 EcoRⅠ、SpeⅠ酶切
位点，GR79Mt和 E9 3间插入 BamHⅠ、BglⅡ、SalⅠ
酶切位点。序列拼接完毕后由南京金斯瑞生物有限
公司合成该序列，并在两端分别添加 PvuⅠ酶切位
点。双元载体 pCAMBIA2300用 PvuⅠ酶切，留下原
核表达框，与合成序列连接，构建成植物表达载体，
命名为 pCA-GM (图 8)。
公司提供一管 TOP10 保存的穿刺菌和质粒干
粉。挑取穿刺菌在固体 LB平板上划线，37℃恒温过
夜培养，挑取单菌落于液体 LB培养基中摇菌。按
图 8载体 pCA-GM结构
Figure 8 Structure of vector pCA-GM
28
Omega试剂盒操作说明提取质粒 pCA-GM，分别进
行酶切和 PCR验证。
3.6拟南芥转化及转基因植株的检测
目的基因与植物表达载体 pCAMBIA2300连接
后，使用 CaCl2 冻融法将其导入根癌农杆菌
LBA4404中，用含有目的质粒的农杆菌侵染拟南芥
花序，继续培养后收获种子。将拟南芥种子灭菌处理
后播于含 60 mg/L草甘膦的MS培养基中，能在抗性
培养基中长出的植株移栽到营养土中温室培养。当
植株长到一定程度时，采用 CTAB法提取拟南芥转
化植株的基因组 DNA；并以此为模板，以 GR-F和
GR-R为引物进行 PCR扩增。利用 TRIzol法提取拟
南芥转化植株和非转化植株的总 RNA，进行反转录
得到 cDNA。使用引物 GR-F和 GR-R进行 PCR和
琼脂糖凝胶电泳分析。反转录反应体系为 25 μL，模
板 RNA根据浓度决定加入量，Oligo(dT)18 1 μL，5×
Reaction Buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，RiboL-
ock RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV RT 1 μL，加水补
足 20 μL。
3.7苜蓿的遗传转化
挑选籽粒饱满、色泽鲜艳的中苜 6号种子，用含
SDS的 0.1% HgCl2灭菌 10 min，均匀播种在 1/2MS
培养基中，恒温培养箱中 25℃培养一周，待植株子叶
完全伸展后，将下胚轴切成约 5 mm小段，放入 SH
诱导培养基中培养 2周，形成初期愈伤组织。农杆菌
收集菌体后用重悬液稀释 OD600值至 0.5~0.6，将愈
伤组织置于重悬液中侵染 15 min。侵染后将其转移
到共培养培养基上，28℃暗培养 2 d。将愈伤组织取
出，无菌 ddH2O冲洗三遍，再用 500 mg/L Car的无菌
水清洗一遍，无菌滤纸吸干，然后将愈伤组织置于含
草甘膦(筛选压为 80 mg/L)的愈伤组织诱导培养基
上。每隔 15~20 d更新愈伤培养基，愈伤组织出现小
绿点后，转入含草甘膦的分化培养基中，直至形成抗
性胚芽。当长出抗性芽时，将其转入不含植物激素和
草甘膦的 1/2MS培养基中诱导生根。形成完整植株
后，移栽到花盆里，温室中继续培养。
3.8苜蓿再生植株的检测
温室培养一段时间后，采集苜蓿叶片提取基因
组 DNA，以质粒 pCA-GM为阳性对照，以未转基因
苜蓿 DNA 为阴性对照，用 GR79Mt 基因的引物
GR-F 和 GR-R 进行 PCR 扩增。PCR 反应程序为
94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环 30
次；72℃ 5 min。反应结束后取 5 μL产物电泳分析。
作者贡献
孙展、郑兴卫和李聪是本研究的实验设计和试
验研究的执行人；孙展和郑兴卫完成数据分析，论文
初稿的写作；苗丽宏参与实验辅助工作；李聪是项目
的构思者和负责人，指导试验设计，数据分析，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由十二五国家科技支撑计划(2011BA-
D17B01)和农业部苜蓿保种专项共同资助。感谢中国
农业科学院生物技术研究所林敏研究员和陆伟研究
员在本研究过程所提供的帮助。
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