全 文 ：www.cjb.org.cn 研究论文 / Research Article
生物物理学报 2011年 6月 第 27卷 第 6期:
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27 No.6 Jun. 2011:
517-527
517-527
病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥
导致自噬和光合作用的抑制
杨 柳 1, 2, 董浚键 1, 2, 陈文利 1, 2
1. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州 510631；
2. 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州 510631
收稿日期：2010-12-09；接受日期：2011-02-17
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划 (IRT0829)，“863”计划项目(2007AA10Z204)，广东省科技
攻关项目 (2007A020300008-6)，华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目
通讯作者：陈文利，电话：(020)85211375-8221，E-mail：chenwl@scnu.edu.cn
摘要：在病原菌侵染下， 植物体是如何通过超敏反应限制病原菌扩增的， 到目前为止还不清楚。
最近的研究显示自噬起了必要的作用， 可见， 研究自噬和超敏反应的机制非常重要。 本研究通
过观察在非寄主病原菌突变体丁香假单胞菌番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv. tomato
DC3000， Pst DC3000) 的侵染下， 拟南芥光合功能的变化及自噬现象出现的情况， 以为进一步
研究植物抗病机理提供实验基础。 以野生型拟南芥为材料， 采用光谱分析和叶绿素荧光成像分
析手段， 研究不同浓度的 Pst DC3000 侵染对拟南芥离体叶片光合功能的影响； 以转基因野生型
拟南芥 (绿色荧光蛋白标记的自噬基因 8a) 幼根为材料， 应用共聚焦显微镜， 研究不同浓度的
Pst DC3000诱导拟南芥自噬的情况。 实验发现， OD600=0.2的 Pst DC3000侵染， 可显著诱导拟南
芥叶片活性氧的积累和迸发， 并会引起拟南芥叶片光合作用效率的下降。 同时发现， 该病原菌
处理 2 h， 可导致拟南芥根中自噬小体的产生 。 用 2,7- 二氯二氢荧光素二乙酯 ( 2,
7-dichlorodihydrofluorescein diacetate， H2DCFDA) 标记活性氧， 检测了 Pst DC3000 作用下叶片
活性氧产生量的变化， 发现， 在 OD600=0.2的 Pst DC3000作用下， 90 min内， 叶片组织中的活性
氧产生了明显的积累。 以上结果说明： Pst DC3000 侵染叶片， 导致了活性氧迸发和光合系统的
受损， 进而推测这两个结果具有相关性； 在植物与病原菌的互作系统中， 光合系统的变化规律
可以作为典型的指标来加以检测。
关键词：丁香假单胞菌番茄致病变种； 拟南芥； 光合功能； 细胞自噬； 活性氧
中图分类号：Q945.78
DOI：10.3724/SP.J.1260.2011.00517
引 言
丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae) 是一种重要的植物病原细菌，根据其宿主特异
性，该菌可分为 50多个致病变种[1]。丁香假单胞菌番茄致病变种 (Pseudomonas syringae pv.
tomato，Pst) 即为其中的一个致病变种，其菌体为短杆状，直或稍弯，单细胞，大小为
(0.1～1) μm × (1.5～4) μm，革兰氏阴性，在含蔗糖的培养基上能产生绿色荧光，超过
517
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.6｜Jun. 2011
研究论文 / Research Article 生物物理学报 2011年 第 27卷 第 6期
41℃不能生长。该菌能够侵染番茄和拟南芥 [2]。Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
(Pst DC3000) 是 Pst的模式种，2003年，Buell等[3]报道了它的全基因组序列，这是丁香假
单胞菌属中第一个被完全测序的菌株，此工作的完成为研究 Pst的致病机理奠定了基础。
细胞自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在
的一种共同机制，可以净化自身多余或受损的细胞结构，在进化过程中高度保守。在植物
发育、逆境胁迫、饥饿及衰老过程中，细胞自噬具有确定的作用。近年来的研究表明，各
种程序性死亡过程中，都会有自噬活动的发生。细胞自噬不仅在植物衰老过程中通过降解
细胞自身的成分维持衰老细胞的生存，在病原菌诱导的细胞程序性死亡 (programmed cell
death，PCD) 过程中，还可能通过自噬促进死亡的信号分子，将细胞的死亡控制在受到感
染的组织局部[4]。
在酵母中，已经发现了超过 30 个自噬基因 (Autophagy-related genes，Atg genes)。
ATG8是第一个通过 ATG4蛋白酶暴露 C-端的氨基乙酰加工而成的。ATG7活化 ATG8和
ATG12，活化的 ATG8和 ATG12与他们各自的结合酶 ATG3和 ATG10结合，导致结合酶
转移标签蛋白到特定的靶蛋白磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，PE) 和 ATG5上，
使 ATG8的 C-端氨基乙酸与 PE的氨基、ATG12的 C-端氨基乙酸与 ATG5的一个特异的
赖氨酸 ε-氨基之间分别形成异构肽。ATG12-ATG5与 ATG16结合形成一个复合体，该复
合体能促进 ATG8-PE 的形成。ATG8-PE 和 ATG12-ATG5 协助自噬小体的组装，且
ATG8-PE包埋在自噬小体的膜中。在自噬小体的加工过程中，位于外膜的 ATG8-PE中的
部分 ATG8可被 ATG4蛋白酶释放，而位于内膜的 ATG8-PE，则和自噬小体一起进入液泡
并被降解。拟南芥与酵母同源，因此，绿色荧光蛋白标记的 ATG8a (green fluorescent
protein tagged ATG8a，GFP-ATG8a) 中自噬基因的诱导表达，即可代表细胞发生了自噬[5]。
在病原菌侵染下，植物体如何通过超敏反应限制病原菌扩增，到目前为止还不清楚，
但是自噬显然起到了必要作用，控制和操纵自噬可以作为一种潜在的、保护植物免受病原
菌侵染或控制植物体本身防卫反应的方法，因此，研究自噬和超敏反应的机制非常重要。
本研究采用光谱分析和叶绿素荧光检测分析手段，研究病原菌侵染对植物光合功能的
影响，具有快速、无损伤等特点。活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 是植物防御过程
中诱导细胞自噬的非常重要的信号分子，通过扩散可以诱导邻近组织的防卫反应。本研究
观测了病原菌 Pst DC3000侵染的拟南芥叶片经 DCF (dichloro fluorescein) 标记后 ROS的
产生量 (即 525 nm峰值)，以及光系统Ⅰ (photosystem Ⅰ，PSⅠ) (730 nm) 和光系统Ⅱ
(photosystem Ⅱ，PSⅡ) (680 nm) 在处理后的变化情况。叶绿素荧光动力学技术在测定叶
片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面有着独特的作用，具有
反映“内在性”的特点[6,7]。本文通过比较固定荧光产量 (Fo)、最大荧光产量 (Fm)、受抑制
程度 (lnh)、最大光化学量子产量〔Fv/Fm[Y(Ⅱ)]〕和非调节性能量耗散的量子产量Y(NO)，研
究病原菌 Pst DC3000侵染对拟南芥叶片光合作用的影响。利用激光共聚焦显微镜观察手
段，探究 Pst DC3000侵染下拟南芥细胞死亡中的早期信号事件，并观测介入的 ROS等信
号分子的产生及定位，检测细胞器形态和功能的改变。
518
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
杨柳等：病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制 研究论文 / Research Article
材料与方法
实验材料与试剂
拟南芥种子哥伦比亚野生型 (ecotype Columbia，Col) 为本实验室保存，转基因 GFP-
ATG8a由日本植物科学中心 Kohki Yoshimoto教授惠赠。种子于 4℃春化 3 d，在人工培养
室内培养，培养条件为 16 h光照、8 h黑暗，光照强度 120 μmol/L·m2·s，温度 22℃，相对
湿度 82%。野生型幼苗长至 30天大小、GFP-ATG8a种子萌发后一周左右进行相关实验。
Pst DC3000菌种由华南师范大学生命科学学院阳成伟教授惠赠。该菌在 KB培养基上，于
28℃培养，至 600 nm 波长处的吸光度值 (OD600) 为 2 时，进行离心，菌体用 10 mmol/L
MgCl2悬浮至所需 OD600的值。2,7-二氯二氢荧光素二乙酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein
diacetate，H2DCFDA)购自 Sigma公司 (St Louis，MO，USA)。
实验方法
植株注射侵染
取长势相近的拟南芥植株中形态学一致的叶片，用去除针头的 1 ml注射器吸取 1 ml菌
液，将注射器的注射口紧贴叶片背面，避开导管系统及中脉，用力缓慢推入菌液。只有少
量 (约 10 μl) 会渗透进入叶片，以看到接种处叶片区域润湿为标准。注射等量的 10 mmol/L
MgCl2作为空白对照。注射后的植株放在盘中，用保鲜膜覆盖以保持湿度。
叶绿素荧光成像观测与分析
采用调制荧光成像系统 Mini-IMAGlNG-PAM (Walz，Effeltrich，Germany) 测定拟南芥
叶片的叶绿素荧光。测量光频率为 1 Hz、强度 0.5 μmol/m2·s，光化光强为 165 μmol/m2·s，
持续 10 min；饱和脉冲强度为 2500 μmol/m2·s，持续 0.8 s。测定前，叶片先暗适应 15～
20 min，每隔 0.5 h测定一次，得到固定荧光 Fo和最大荧光 Fm。然后，打开光化光，诱导
荧光动力学，并间隔 20 s打开饱和脉冲，测量瞬时荧光 F和光适应下的最大荧光 Fm。测得
的叶绿素荧光参数按 Genty等的公式[8,9]计算。
荧光光谱仪的使用和光谱分析
用荧光光谱仪 (Lambda 35 UV/VIS，PerkinElmer，American) 对 Pst DC3000侵染 3 h
后的拟南芥叶片的叶绿体荧光光谱进行测定。设定时间序列，每隔 15 min测定一次，在
90 min 内，观察光谱中 PSⅠ (730 nm) 和 PSⅡ (680 nm) 的峰值，以及经荧光探针
H2DCFDA标记后 ROS的产生量 (525 nm峰值，即 ROS的相对测定值) 在 Pst DC3000处理
后的变化情况。ROS荧光探针 H2DCFDA溶解于 DMSO后，配制成浓度为 200 μmol/L的母
液，避光保存于－20℃冰箱。取对照组和处理组中注射在同样位置且同样大小的叶片，以相
同的方式 (注射位点对准光路) 将拟南芥叶片放入比色杯中，加水和 H2DCFDA探针母液至
终浓度为 5 μmol/L，于黑暗中静置 15～20 min，置于专用架上并固定，然后进行测定。计
算机会自动记录每次测量的数据，并将其处理为一系列随激发光波长增长而变化的曲线。
具体参数设置如下：激发波长 488 nm，激发狭缝 10 nm，发射狭缝 8.5 nm，扫描速度
200 nm/min，扫描波长范围 600～800 nm或 500～800 nm (DCF标记条件下)[7]。
519
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.6｜Jun. 2011
研究论文 / Research Article 生物物理学报 2011年 第 27卷 第 6期
结果表明，被浓度为 OD600=0.02和 0.2的 Pst DC3000菌悬液侵染的叶片，出现了明显
的浸湿状、缺绿和皱缩等胁迫现象，且随着浓度的增加更加明显。而注射 MgCl2的叶片，
在注射后一天，除注射位置有少许破损外，与未注射叶片无明显差异。
叶绿素荧光成像检测结果
不同浓度 Pst DC3000侵染的拟南芥叶片，其叶绿素荧光成像的变化见图 2。Fo、Y(Ⅱ)
和Y(NO)等叶绿素荧光参数结果见图 3。
从图 2可以看出，随着侵染浓度的升高，叶绿素荧光各个参数的成像发生了显著的变
化，表明叶片受损伤程度增强。由 Inh行叶片图像变化的情况可以看出，随着侵染浓度的
增加，从注射位置向四周扩散的橙色斑块明显增加 (代表受抑制程度的增加)，说明在病原
图 1 不同浓度 Pst DC3000侵染条件下，拟南芥叶片
受损伤程度对比 通过注射器注射的方法，分别向拟南
芥叶片注射 OD600=0.02和 0.2的 Pst DC3000菌悬液，对
照组注射 10 mmol/L的 MgCl2，在注射当天和第二天分
别拍照，箭头所指为被侵染的叶片
Fig.1 Damage of Arabidopsis leaves after infection
by different concentrations of Pst DC3000 for days
Arabidopsis leaves were infiltrated by injecting Pst
DC3000 at OD600=0.02 and 0.2, mock leaves were
infiltrated by syring with 10 mmol/L MgCl2. Pictures
were taken one and two days after inoculation. The
arrows indicate the leaves that were injected
染色检测分析
将 Pst DC3000侵染后的叶片，于 3,3-二氨基联苯胺 (3,3-diaminobenzidine，DAB) 染
液中染色 30 min 后，用无水酒精脱色，然后使用体式显微镜 (Zeiss Lumar V12，
Carl-Zeiss，Germany)，在 80×镜下拍照[10]。
激光共聚焦扫描显微成像观察
激光共聚焦扫描显微镜 (LSM 510/ConfoCor2和 LSM 510 META，Carl-Zeiss，Jena，
Germany) 使用氩离子激光器，绿色荧光蛋白自发荧光以 488 nm的激发光激发，选择合适
的分色镜后，通过 500～550 nm的带通滤光片探测。物镜为 100倍的油镜。图片使用软件
Zeiss Rel 3处理。
将转基因 GFP-ATG8a拟南芥的幼根置于细胞培养皿，然后分别用 OD600=0.02和 0.2的
Pst DC3000菌液处理后，置于共聚焦显微镜下观察。
结果与分析
Pst DC3000侵染引起的拟南芥叶片损伤
不同浓度 (OD600=0.02，OD600=0.2) 的 Pst DC3000侵染条件下，拟南芥叶片受损伤程度
对比结果如图 1所示。
520
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
杨柳等：病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制 研究论文 / Research Article
图 2 不同浓度 Pst DC3000 侵染拟南芥叶片的叶绿素荧光成像 (A)对照组注射 10 mmol/L 的
MgCl2；通过注射器分别向拟南芥叶片注射(B)OD600=0.02和(C)0.2的 Pst DC3000菌悬液；每隔 0.5 h
测定一次，通过叶绿素荧光仪测定并导出图片
Fig.2 Fluorescence image of Arabidopsis leaves after infection by different concentrations of
Pst DC3000 for 3 h Leaves were infected with medium (A) control (mock, 10 mmol/L MgCl2), or
with Pst DC3000 at (B) OD600=0.02 and (C) 0.2. The leaves were scaned every fifteen minutes.
Experiments were performed three times with similar results. The false colour code depicted at the
bottom of each image ranged from 0.000 (black) to 1.000 (purple)
(A) 0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
F 0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Time (h)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Time (h)
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
FmF
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Time (h)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Time (h)
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
Y(
II)
(C)
(B)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Y(
N
O
)
(D)
*
**
** *
*
** **
**
*
** **
****
* * *
图 3 不同浓度 Pst DC3000侵染的拟南芥叶片中，叶绿素荧光参数 Fo、Fm、Y(Ⅱ)和 Y(NO)的变化 分别用
OD600= 0.02和 0.2的 Pst DC3000菌悬液侵染叶片，对照组用 10 mmol/L MgCl2注射。每个结果重复 6次。通过叶
绿素荧光仪测定并导出数据，用数据处理软件制作成柱状图并进行显著性差异分析。 ：MgCl2； ：OD600=0.02；
：OD600=0.2
Fig.3 Changes in fluorescence after Pst DC3000 infection by different concentrations for 3 h Shown is the
fluorescence parameters Fo, Fm, Y(Ⅱ) and Y(NO) that were measured with six independent Arabidopsis leaves
infected with Pst DC3000 at OD600 of 0.02 and 0.2. Mock control were infected with 10 mmol/L MgCl2. Each
value is the x±s from five leaves, *P＜0.05, **P＜0.01. : MgCl2; : OD600=0.02; : OD600=0.2
521
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.6｜Jun. 2011
研究论文 / Research Article 生物物理学报 2011年 第 27卷 第 6期
图 4 不同浓度 Pst DC3000侵染的拟南芥叶片中，光系统 PSⅠ(730 nm)和 PSⅡ(680 nm)的峰值变化 (A) 10 mmol/L
MgCl2侵染；(B) OD600=0.02的 Pst DC3000侵染；(C) OD600=0.2的 Pst DC3000侵染。每隔 15 min测定一次，具体参数
设置为：激发波长 488 nm，激发狭缝 10 nm，发射狭缝 8.5 nm，扫描速度 200 nm/min，扫描波长范围 600～800 nm
Fig.4 Changes in PSⅠ (730 nm) and PSⅡ (680 nm) response after infection by different concentrations of
Pst DC3000 for 3 h Shown is the fluorescence intensity measured in 6 leaves with or without Pst DC3000 infection.
(A) Mock infection (MgCl2 10 mmol/L) as a control; Infection by Pst DC3000 at OD600 of (B) 0.02 or (C) 0.2. The
leaves were scaned every fifteen minutes. Detailed preferences: excitation wavelength was 488 nm, excitation slit was
10 nm, emission slit was 8.5 nm, scanning speed was 200 nm/min, wavelength scanning area was 600～800 nm
菌侵染下，叶片的光合作用受到了明显抑制。图 3显示，当侵染浓度增加后，拟南芥的 Fo
和Y(NO)随着时间的变化都有所升高。Fo代表不参与 PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，是
PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量，与叶绿素浓度有关。Y(NO)表示植物通过其他形
式减少进入光化学途径的能量占总吸收能量的比例，是光损伤的重要指标。若Y(NO)升高，
表明光化学能量转换和保护性的调节机制不足以将植物吸收的光能完全消耗掉。实验发现，
经高浓度的 Pst DC3000侵染过的拟南芥叶片，随着时间的推移，其Y(Ⅱ)和 Fm出现了下降。
Y(Ⅱ) 反映了 PSⅡ反应中心内的光能转换效率，于叶片暗适应 20 min后测得，该参数在正常
条件下变化极小，不受物种和生长条件的影响，在逆境条件下会明显下降。Fm是 PSⅡ反
应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映通过 PSⅡ的电子传递情况，经暗适应 20 min
后测得，Fm的下降表明植株的最大荧光效率下降。实验结果显示，Pst DC3000侵染造成
了拟南芥叶片光合效率的下降，进而影响了其光合作用的正常进行。
Pst DC3000诱导拟南芥叶片中 PSⅠ和 PSⅡ的变化
用 OD600=0.02和 0.2两种浓度的 Pst DC3000侵染拟南芥叶片，观测其 PSⅠ (730 nm)
和 PSⅡ(680 nm) 峰值在处理后的变化情况 (见图 4)。结果表明，对照组的 PSⅠ(730 nm) 和
PSⅡ (680 nm) 峰值随着时间的增加略有降低 (图 4A)，在 90 min内，PSⅠ下降 1.84%，
PSⅡ下降 1.91%；OD600=0.02的初始峰值相对升高，且随着时间的增加而上升，在 90 min
内，PSⅠ上升 3.11%，PSⅡ上升 3.82% (图 4B)；OD600=0.2的初始峰值更高，且随着时间的
增加，峰值大幅上升，在 90 min内，PSⅠ上升 7.72%，PSⅡ上升 23.46% (图 4C)。光谱特
征曲线对应的 680 nm和 730 nm峰值大幅升高，显示 OD600=0.02和 0.2的 Pst DC3000侵染，
对拟南芥叶片的光合作用形成了早期胁迫。
522
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
杨柳等：病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制 研究论文 / Research Article
图 6 Pst DC3000侵染引起拟南芥叶片表面活性氧的
累积 对叶片进行不同浓度的侵染 (OD600=0.02和 0.2)
3 h后，经 DAB染色体式显微镜成像。叶片上的斑块
和斑点显示叶片表面活性氧的分布情况
Fig.6 Accumulation of the active oxygen on the
surface of the leaf after Pst DC3000 infection.
Infection by different concentrations for 3 h were
examined for ROS accumulation by DAB staining
(patches)
图 5 不同浓度 Pst DC3000侵染的拟南芥叶片，525 nm 处光谱峰值的变化情况 (A) 10 mmol/L MgCl2侵染；
(B) OD600=0.02的 Pst DC3000侵染；(C) OD600=0.2的 Pst DC3000侵染
Fig.5 Changes of 525 nm peak values in fluorescence emission spectra from Arabidopsis leaves after
infection by different concentrations of Pst DC3000 for 3 h Shown are either (A) mock control (MgCl2 10 mmol/L),
or after infection by Pst DC3000 at OD600 of (B) 0.02 or (C) 0.2
不同浓度 Pst DC3000侵染 3 h后，用 DAB染色检测拟南芥叶片表面活性氧的产生情
况。结果显示，拟南芥叶片表面均出现了不同程度的活性氧积累和集中分布 (见图 6)。从
图中可看出，OD600=0.2的 Pst DC3000侵染的拟南芥突变体叶片表面，出现了较多的斑块区
域，显示其叶表面出现了明显的活性氧迸发和积累；OD600=0.02的病原菌侵染下，出现的斑
块区域面积相对减少；而对照组虽然也有斑块区域，但主要集中在注射位置，是注射时的
机械损伤诱导的活性氧产生，不会导致活性氧的进一步扩散和迸发积累。
Pst DC3000诱导拟南芥叶片中 ROS的产生
不同浓度 Pst DC3000侵染 3 h后的拟南芥叶片产生的活性氧经荧光探针 H2DCFDA标
记后的荧光光谱，用 Lambda 35 UV/VIS型分光光度计进行测定 (图 5)。结果表明，注射
3 h后，在 90 min内，叶片 525 nm处的峰值随着时间推移逐渐升高，说明叶片组织中的活
性氧产生了明显的积累，随着侵染浓度的增大，活性氧的积累速度明显加快、积累总量明
显增多 (图 5C)。对照组有少量的活性氧增加和积累，无注射叶片的活性氧基本不变化或只
有微小的上升 (图片无显示)。
523
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.6｜Jun. 2011
研究论文 / Research Article 生物物理学报 2011年 第 27卷 第 6期
图 7 Pst DC3000侵染引起拟南芥根中自噬小体
的形成 转基因拟南芥幼根经过 OD600=0.02 和 0.2
的 Pst DC3000侵泡 2 h后，置于激光共聚焦显微镜
下观察自噬小体的产生情况。使用氩离子激光器，
488 nm的激发光激发，通过 500～550 nm的带通滤
光片探测。物镜为 100倍的油镜。Pst DC3000处理
的根中有自噬小体的产生 (箭头所示)，而在对照组
中没有。绿色为绿色荧光蛋白荧光，Background是
透射图。比例尺为 20 μm
Fig.7 Formation of autophagic bodies in root of
GFP-ATG8a after Pst DC3000 infection
Inoculation by different concentrations for 2 h were
observed using LCSM. An Ar ion laser was used.
GFP signals were visualized with excitation at
488 nm (emission at 500～550 nm). Images were
captured with the 100 × oil immersion objectives.
Images of Pst DC3000 treated samples show
examples of autophagic bodies (arrows) in roots
that are absent in the control leaves. Green
indicates GFP fluorescence. Background indicates
perspective view. Scale bar is 20 μm
讨 论
近年来，光谱分析技术在作物品种鉴别、质量评价及生长信息检测等方面的应用，得
到了广泛重视和长足发展[11～16]。本文的叶绿素荧光成像检测结果中，Fo的增加代表 PSⅡ反
应中心出现可逆的失活或不易逆转的破坏，说明经 Pst DC3000侵染过的拟南芥叶片，其
PSⅡ反应中心出现了可逆的失活或不易逆转的破坏，也可能是因为其类囊体膜受到了损伤。
Y(NO)的升高表明光化学能量转换和保护性的调节机制失效，这时，植物可能已经受到损
伤。Y(Ⅱ)的减少表明 PSⅡ反应中心内光能转换效率降低，而 Fm的减少则表明叶片的最大
荧光效率降低。此外，侵染 Pst DC3000的叶片中，PSⅠ和 PSⅡ也有明显的升高，进一步
说明可能是 Pst DC3000的侵染导致植物叶片反应中心出现失活或不易逆转的破坏，也可能
是其类囊体膜受到损伤，致使叶片的光合作用被强烈地抑制，光合电子传递紊乱，光合效
能降低。这些数据说明，拟南芥叶片的叶绿体随着 Pst DC3000浓度的增大明显受到了损
伤，从而导致光合功能受到抑制。而由光谱检测的病原菌侵染叶片的 ROS产生结果和
Pst DC3000诱导拟南芥根中自噬小体的产生
以转基因 GFP-ATG8a拟南芥的幼根为材料，经不同浓度的 Pst DC3000处理 2 h后，
运用激光共聚焦显微成像技术进行观察。Pst DC3000诱导拟南芥根中自噬小体的产生结果
见图 7。实验发现，经 OD600=0.02和 0.2的 Pst DC3000处理 2 h后，GFP-ATG8a的根中均
有明显的自噬小体产生 (图中箭头所示)，而在对照组中则没有。自噬小体的形成是植物的
保护和防御反应，可抵抗外界对植物的进一步损伤。
524
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
杨柳等：病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制 研究论文 / Research Article
DAB染色检测结果可知，随着 Pst DC3000浓度的增大，被侵染的叶片产生的 ROS明显增
多，这可能是植物抵抗病原菌的反应；对照组中少量的活性氧，可能是注射时造成的机械
损伤导致叶片产生了局部的活性氧积累。从上面的数据可以明显看出，Pst DC3000侵染叶
片后导致的活性氧迸发，与光合系统受损具有明显的相关性，因为在对照组中，活性氧处
于低水平而光合功能正常，随着侵染菌液浓度的增加，活性氧迸发速度和积累量明显增大，
光合功能也明显受到抑制。综合分析这几个数据，认为有两种可能：1) 叶片叶绿体为了诱
导植株自噬和抗性反应而产生较多的 ROS，大量的 ROS诱导细胞出现局部细胞死亡和防御
相关基因的表达，产生超敏反应 (hypersensitivity，HR)。叶肉细胞的自噬包括叶绿体的自噬
和降解，这两个过程都会产生活性氧，破坏细胞结构 (如叶绿体) 和酶的功能 (如光合作用
相关的酶)，使叶绿体的功能受到明显影响。这与Matias等[17]关于非寄主性病原菌侵染烟草
叶片中叶绿体产生的 ROS，在局部细胞死亡中起主要作用的结果相似。2) 植物中的烟酰胺
腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH
oxidase)，是植物与病菌互作中 ROS的重要来源，为 ROS爆发所必需，且通过调节 ROS的
产生，在植物抵抗生物胁迫中发挥重要作用[18]。钙离子 (Ca2+) 通过结合 NADPH氧化酶及
结合与磷酸化信号级联反应相关的蛋白，相互协作地参与 NADPH氧化酶的激活，在叶绿
体内存在有 Ca2+ (10～15 mmol/L) 和一定量的钙调蛋白 (calmodulin，CaM)(3%)，当受到病
原菌侵染时，叶绿体膜的通透性改变，向胞质释放 Ca2+和 CaM，以激活膜上的 NADPH氧
化酶，再通过 NADPH氧化酶诱导 ROS的大量产生，发生超敏反应，大量的 ROS继而导致
叶绿体的损伤；另外，Ca2+和 CaM的流出使某些光合作用相关的酶和蛋白的功能受到影
响，导致叶绿体光合功能受到抑制。这种病原菌导致的光合功能的抑制是由于叶绿体产生
ROS造成自身损伤，还是由于 Ca2+和 CaM的流出及 NADPH氧化酶的激活，诱导 ROS剧
增而导致自身功能下降和损伤？我们将进一步通过基因手段加以研究。如，将可抑制 ROS
产生的黄素氧还蛋白 (flavodoxin，Fld) 的基因转入拟南芥叶片叶绿体中，并使之在叶绿体
定向表达 Fld蛋白，抑制 ROS在叶绿体中的产生，检测叶绿体产生的 ROS在 HR中的作用
主导性；或者通过 Ca2+荧光指示剂标记 Ca2+，用荧光检测手段观察叶绿体中 Ca2+的运动变
化，进一步研究叶绿体在对病原菌侵染的防御中所起作用的大小。探讨是否可以通过增强
植物的其它防御途径，降低叶绿体这种防御所导致的损伤，并应用到实际生产中，使农作
物可以在抵御病害的同时保证产量。在植物 -病原菌互作系统中，我们可以将光合功能作
为典型的指标来加以监测[19]，根据光合功能的变化规律来选取和培育一些新的抗病植物，
如果抗病植物在抵抗病原菌的同时，光合功能没有受到明显抑制，这样便能在抵御病害的
同时将损失降到最低。
超敏反应程序性死亡 (hypersensitive response programmed cell death，HR-PCD) 是一
种程序性的细胞死亡，以感染部位细胞快速死亡为特征。超敏反应相关的局限性 PCD，是
植物成功对抗病原菌的免疫反应过程。在病原菌诱导的 HR-PCD过程中，只有把细胞的
PCD限制在感染部位，才能起到对植物的保护作用。自噬对 HR-PCD具有重要的控制作
用，主要通过降解促进死亡的信号和控制这些信号的来源来起作用。这些信号包括 ROS、
一氧化氮 (nitric oxide，NO)、水杨酸 (salicylic acid，SA)、茉莉酸 (jasmonic acid，JA) 和
525
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.6｜Jun. 2011
研究论文 / Research Article 生物物理学报 2011年 第 27卷 第 6期
1. Hirano SS, Upper CD. Bacteria in the leaf ecosystem with
emphasis on Pseudomonas syringae —— A pathogen, ice
nucleus, and epiphyte. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64(3):
624~626
2. Hong YM, Zhao TC. Advanced in the signal research of
pto-mediated resistance to bacterial speck disease in
tomato. Chin Agric Sci Bull, 2006, 22: 271~272
3. Buell CR, Joardar V, Lindeberg M, Selengut J, Paulsen IT,
Gwinn ML, Dodson RJ, Deboy RT, Durkin AS, Kolonay JF,
Madupu R, Daugherty S, Brinkac L, Beanan MJ, Haft DH,
Nelson WC, Davidsen T, Zafar N, Zhou LW, Liu J, Yuan
QP, Khouri HD, Fedorova N, Tran B, Russell D, Berry K,
Utterback T, Aken SEV, Feldblyum TV, Ascenzo MD,
Deng WL, Ramos AR, Alfano JR, Cartinhour S, Chatterjee
AK, Delaney TP, Lazarowitz SG, Martin GB, Schneider DJ,
Tang XY, Bender CL, White O, Fraser CM, Alan C. The
complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato
pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Proc
Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 10181~10184
4. Li GL, Yan HC. Effects of autophagy in the plant innate
immune response. J Anhui Agri Sci, 2009, 37:
14581~14582
5. Taijoon C, Allison RP, Richard DV. ATG8 lipidation and
ATG8-mediated autophagy in Arabidopsis require ATG12
expressed from the differentially controlled ATG12A AND
ATG12B loci. Plant J, 2010, 62(3): 483~493
6. Ma BY, Jin SH, Xu LG, Jiang DA. Effects of chilling on
chlorophyll fluorescence characteristics in three warm-
season turfgrasses. Grassl China, 2006, 28: 58~62
7. Zhang WN, Chen WL. Role of salicylic acid in alleviating
photochemical damage and autophagic cell death induction
of cadmium stress in Arabidopsis thaliana. Photochem
Photobiol Sci, 2011, DOI: 10.1039/c0pp00305k
8. Genty B, Briantais JM, Baker NR. The relationship between
quantum yield of photosynthetic electron transport and
quenching of chlorophyll fluorescence. Acta Biochim Pol,
1989, 990: 87~92
9. Zhang SR. A discussion on chlorophyll fluorescence kinetics
parameters and their significance. Chin Bull Bot, 1999, 16:
444~446
10. Bi YH, Chen WL, Xing D. Application of delayed
fluorescence analysis and laser scanning confocal
microscope in detecting chlorophyll content of Gerbera
hybrida epidermal cell during its development. Acta Biophys
Sin, 2007, 23: 402~408
11. Chen ZQ, Chen WL, Yang CW. Effects of exogenous
salicylic acid on photosynthesis in Arabidopsis leaves based
on fluorescence spectra and delayed fluorescence
technique. Spectrosc Spectr Anal, 2009, 29: 2208~2212
12. Wang CL, Xing D, Zeng LZ. Spectroscopic research
on the mechanism for 730 nm component in delayed
fluorescence of chloroplast. Spectrosc Spectr Anal, 2006,
26: 6~10
13. Li Q, Xing D, Jia L, Wang JS. Mechanism study on the
origin of delayed fluorescence by an analytic modeling of
the electronic reflux for photosynthetic electron transport
chain. J Photochem Photobiol B: Biol, 2007, 87: 183~190
14. Zhang LR, Xing D. Rapid determination of the damage to
photosynthesis caused by salt and osmotic stresses using
delayed fluorescence of chloroplasts. Photochem Photobiol
Sci, 2008, 7: 352~360
15. Zhang LR, Xing D, Wang JS, Li LL. Rapid and
non-invasive detection of plants senescence using a
delayed fluorescence technique. Photochem Photobiol Sci,
2007, 6: 635~641
16. Zhang LR, Xing D. Methyl jasmonate induces production of
参考文献：
Ca2+。Pst DC3000处理导致 ROS的积累，失控的 ROS足以诱导自噬。在 GFP-ATG8a幼根
细胞中有自噬小体的产生，暗示 ROS对拟南芥形成一种生物胁迫，致使自噬基因的表达增
强，对细胞形成一种保护机制。自噬可通过抑制 ROS 的产生和叶绿体的聚集，阻止
HR-PCD引起的损伤向正常组织传播。最近的文献报道显示自噬与 HR密切相关[20]，控制和
操纵自噬可以作为一种潜在的保护植物免受病原菌侵染或控制植物体本身防卫反应的方法，
所以，进一步研究自噬 -HR机制，可以更加深入地理解自噬在 HR中的具体作用，为植物
防治病虫害提供新的思路和方法。
总之，我们的实验结果证实，病原菌侵染拟南芥叶片的初期，活性氧的产生先于光合
链受损，致病性病原菌 Pst DC3000可以引起自噬小体的产生。本实验室将进一步用叶片和
原生质体，采用细胞生物学、遗传学等技术手段，观察 GFP-ATG8a、GFP-ATG5 和
GFP-ATG2等携带自噬基因的转基因拟南芥叶片细胞自噬小体的产生情况，并与幼根细胞
相比较，检测 HR中叶片和幼根细胞自噬小体的产生过程及差异，进一步研究 Pst DC3000
及其非致病菌引起的 HR中，相关自噬基因的功能及其作用机理。
526
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
杨柳等：病原菌 Pst DC3000侵染拟南芥导致自噬和光合作用的抑制 研究论文 / Research Article
Autophagy and Declined Photosynthesis
in Arabidopsis during Pathogenic
Pst DC3000 Infection
YANG Liu1,2, DONG Junjian1,2, CHEN Wenli1,2
1. College of Life Science, Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development,
South China Normal University, Guangzhou 510631, China;
2. MOE Key Laboratory of Laser Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China
This work was supported by grants from the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University
(IRT0829), the 863 Program (2007AA10Z204), the Chinese Science and Technology Foundation of Guangdong Province
(2007A020300008-6), and the opening project of MOE Key laboratory of Laser Life Science, South China Normal University
Received: Dec 9, 2010 Accepted: Feb 17, 2011
Corresponding author: CHEN Wenli, Tel: +86(20)85211375-8221, E-mail: chenwl@scnu.edu.cn
Abstract: How plants are able to restrict the hypersensitivity(HR) to cells in the immediate area surrounding
an infection has, until now, been unclear. Recently, autophagy appears to be necessary for the spatial
restriction of programmed cell death, it is very important to study the mechanism of autophagy and HR.
Studying photosynthetic function and autophagy in Arabidopsis during infection by Pseudomonas syringae pv.
tomato DC3000 (Pst DC3000) has important implications in elucidating mechanisms of disease resistance.
In this paper, wild type Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia) was used to study changes in photosynthetic
function in Arabidopsis leaves after infection by different concentrations of Pst DC3000, by measuring
fluorescence spectra and chlorophyll fluorescence analysis. Young roots from transgenic Arabidopsis (green
fluorescent protein tagged ATG8a, GFP-ATG8a) was also used to study autophagy induction by different
concentrations of Pst DC3000, by laser scanning confocal microscopy. It was found that Arabidopsis
thaliana infected by Pst DC3000 (OD600=0.2) induced leaf oxidative burst and a decline in photosynthetic
efficiency. Further, autophagic bodies were observed 2 h after infection of roots. The generation of active
oxygen was also detected with the H2DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate) labeling infection by
Pst DC3000 at OD600 of 0.2. There was an obvious accumulation of active oxygen along with the time under
Pst DC3000 infection. From these data, it is concluded that infection by Pst DC3000 leads to the oxidative
burst and the damage of photosystem, which may be related to eath other. And, in plant and pathogen
interaction system, the changes of photosystem can be detected as typical indicators.
Key Words: Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000); Arabidopsis; Photosynthetic function;
Autophagy; Active oxygen
DOI: 10.3724/SP.J.1260.2011.00517
reactive oxygen species and alterations in mitochondrial
dynamics that precede photosynthetic dysfunction and
subsequent cell death. Plant Cell Physiol, 2008, 49:
1092~1111
17. Matias DZ, Nestor C, Vanesa BT, Michael M, Martin P,
Bettina H, Mohammad-Reza H. Chloroplast-generated
reactive oxygen species play a major role in localized cell
death during the non-host interaction between tobacco and
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Plant J, 2009,
60: 962~973
18. Ding KF, Tan XR. Research advances in NADPH oxidative
enzymes of plant. Chin Bull Life Sci, 2010, 22: 723~728
19. Katharina BB, Ulrich S, Andrea G, Thomas R, Susanne B.
Infection with virulent and avirulent P. syringae strains
differentially affects photosynthesis and sink metabolism in
Arabidopsis leaves. Planta, 2006, 225: 1~12
20. Hofius D, Schultz-Larsen T, Joensen J, Tsitsigiannis DI,
Petersen NH, Mattsson O, J覬rgensen LB, Jones JD,
Mundy J, Petersen M. Autophagic components contribute
to hypersensitive cell death in Arabidopsis. Cell, 2009,
137(4): 773~783
527