全 文 ：第 38卷第 3期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.38, No.3
2 0 0 9年 6月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) 2 0 0 9 , Jun.
拟南芥叶色突变体 ems3的基因定位
姜　妍 , 王晓萌 , 杨仲南
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:ems3是经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变筛选得到的一拟南芥叶色突变体.通过背景纯化
与遗传分析 ,发现 ems3突变体是单基因隐性控制.利用图位克隆的方法对叶色基因 EMS3进
行了定位 ,结果表明:EMS3位于第 5条染色体分子标记 MHF15和 MHF152之间 55kb的区间
内.生物信息预测 ,该区间包括有 16个基因.这些结果为该基因的克隆及叶绿体发育过程中的
功能研究奠定了基础.
关键词:拟南芥;叶色突变体;图位克隆;分子标记
中图分类号:Q946　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2009)03-0287-06
　　　　　　　　　　
收稿日期:2008-12-19
基金项目:973计划(2009CB118504).
作者简介:姜　妍(1985-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;王晓萌(1982-), 女 ,上海师范
大学生命与环境科学学院硕士研究生;杨仲南(1965-), 男 ,博士 , 上海师范大学生命与环境科学学院教授.
0　引　言
叶绿体是半自主型细胞器 ,在高等植物中 ,由前质体发育而来.叶绿体除了光合作用外 ,还参与了氨
基酸 、脂肪酸 、植物生长物质 、核苷酸 、维生素以及次生代谢产物的合成.叶绿体由直径 0.2 ～ 0.5 μm的
前质体发育(biogenesis)而来[ 1] .叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素.叶绿素突变是辐射
诱发与组织培养过程中存在的一种普遍现象 , 它最明显的特点是叶色发生了变异.叶色突变往往直接
或间接影响叶绿素的合成和降解途径 , 因此叶色突变体又被称为叶绿素缺陷突变.
叶绿素突变体早在 1930 ～ 1940年就有研究 , 它是一种非常明显的性状突变 , 具有十分重要的价
值.目前 , 关于植物叶色突变的表型描述已有很多 , 在拟南芥 、水稻 、玉米 、高粱 、棉花 、小麦 、大麦和大
豆等植物中均有报道[ 2, 3] .叶色突变的主要特点是叶色表型发生了变异 ,表现为不正常的白化 、黄化 、浅
绿 、绿白 、白翠 、黄绿 、绿黄和条纹等 [ 4] ,并可导致控制叶绿素生物合成和叶绿体发育的重要基因的沉默
或失活 ,直接或间接影响叶绿素的合成和降解 ,改变叶绿素含量 ,影响植物的光合作用以及叶绿体生物
发生等生命过程 [ 5, 6] .在部分经济作物中 , 叶色突变体也被应用于杂交育种.因此 ,研究叶绿体发育和叶
色突变的相关基因具有重要的理论意义和应用价值.
本实验室筛选到一株经 EMS诱导的拟南芥叶色突变体 ems3.该突变体植株发育较野生型迟缓 ,真
叶叶色也较野生型浅 ,且致死.本研究对该突变体进行背景纯化 、遗传分析 、电镜观察 ,并用图位克隆的
方法对叶色基因 EMS3进行了精细定位.为以后该基因的克隆以及研究其在植物发育过程中的功能奠
定了基础.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
野生型拟南芥 (Arabidopsisthaliana):生态型 Columbia(Col),生态型 Lansbergerecta(Ler).拟南
芥突变体 ems3:由本实验室用 EMS诱变得到的叶色突变株系.
1.1.2　数据库
本实验所需数据信息来源于:htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ , htp://www.arabidopsis.org/
(TAIR)和 htp://www.genevestigator.ethz.ch/.
1.2　方法
1.2.1　材料种植
拟南芥在 0.1%的琼脂糖中 4℃春化 2 ～ 4d后培养在黑土 ,蛭石 ,珍珠岩(1∶6∶0.25)的混合土中.
培养时在其上层罩一层塑料膜以保持湿度 ,当拟南芥萌发出子叶后去掉塑料膜.16h光照处理 , 8h黑暗 ,
湿度保持在 60% ～ 70%,温度控制在 22 ～ 25℃,光照强度为 50 μEm-2s-1 ,营养液为 plantnutrientsolu-
tion(PNS).
1.2.2　突变体的背景纯化与遗传分析
以拟南芥野生型 Ler为父本 ,突变体为母本进行回交得到 F1代 , F1代自交后得到 F2代.种植并观
察 F2代表型 ,统计 F2代中浅绿色突变体和正常叶色的比例.
1.2.3　突变体定位群体的建立
ems3突变体定位群体是由 Col对 ems3突变体的杂合子进行杂交 ,取其杂合子与 Col野生型杂交得
到 F1代种植 ,其自交子代为 F2代 ,则 F2代的突变体即是图位克隆所需要的定位群体.
1.2.4　分子标记
根据拟南芥数据库上所提供的拟南芥基因组多态性数据库(htp://www.arabidopsis.org),设计 In/
Del标记.用 2.5%的琼脂糖进行凝胶电泳验证两个亲本 Ler和 Col之间的多态性.
1.2.5　突变体基因的初定位
(1)选取 50株突变体;
(2)抽取植物的总 DNA:取突变体材料于离心管中加 600 μLLysisbufer(0.2mol/LTris.C1 pH8.
0, 0.05 mol/LEDTApH8.0, 7 mol/L尿素 , 2%十二烷基肌氨酸钠)研磨 ,加 500 μL酚 /氯仿;12000r/
min离心 5 min,取上清;加 600 μL异丙醇 , 1 /10体积 3 mol/LNaOAC(pH5.2);12, 000 r/min离心 10
min,弃上清;70%的酒精洗一次 , 37℃干燥 ,加入 50 μL无菌水 , -20℃保存(参照 Sun等方法 [ 7]并作适
当改进);
(3)分别取 DNA2μL,每 10株 DNA混在一起制备成 5个 DNA池 ,用设计的分子标记为引物进行
PCR扩增;
(4)PCR的反应体系:总体系为 30 μL,在 0.2 mL的 PCR离心管中加入下列试剂:无菌水 20.5
μL, 10×PCR缓冲液 3μL, dNTP(2×10-3 mol/L)2 μL,上游引物(1×10-5 mol/L)1.5μL,下游引物(1
×10-5 mol/L)1.5 μL, DNA模板 1 μL, Taq聚合酶(6 U/μL)0.5 μL.混匀;
(5)PCR反应程序:将反应的 PCR离心管置于 PCR仪中 , 95℃预变性 3 min, 94℃变性 20s, 52℃退
火 20s, 72℃延伸 20s,循环次数为 40个 ,在 72℃保持 10min.PCR反应结束后 ,用 2%的琼脂糖进行电
泳 ,并利用 TanonGIS凝胶图像处理系统拍照.
1.2.6　突变体基因的精细定位
用高通量的方法 [ 8]提取突变体单株的 DNA,根据初定位结果选择 、合成新的分子标记对这些植株
进行基因型分析 ,对目的基因进行精细定位.
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(a)PNS培养基上生长 7d的 ems3突变体;
(b)PNS培养基上萌发 7d的 Ler野生型;
(c)PNS培养基上萌发 14d的 ems3突变体;
(d)PNS培养基上萌发 14d的 Ler野生型;
(e)同时在 PNS培养基上萌发 10d的 Ler野生
型(左)和 ems3突变体(右);
(f)同时在 PNS培养基上萌发 10d的 Ler野生
型(左)和 ems3突变体(右)的侧面拍照;
图 1　培养基上生长的拟南芥表型观察
2　结果分析
2.1　突变体 ems3的表型与遗传分析
ems3突变体是经化学诱变剂 EMS诱导拟南芥野生型
Ler种子筛选得到的叶色突变植株.该突变体在蛭石中能正
常萌发.突变体萌发后形成为浅绿色的子叶 ,且该突变体在
形成 2 ～ 4片真叶后死亡.另外 , ems3突变体植株发育相对
野生型比较迟缓 ,真叶叶色也较野生型浅(图 1).
为了探讨该突变是否由于单基因隐性突变所造成 ,将杂
合子与拟南芥野生型 Ler回交后 ,回交一代所有植株均表现
正常表型 ,回交一代的种子种下后单株收获回交二代的种
子 ,随机取某单株的种子进行萌发实验 ,结果发现后代出现
表型分离 ,浅绿植株为 35株 ,正常植株为 115株 ,比例接近
3∶1(χ2 <χ20.05 =3.84),其他 2个单株的后代也是同样的分
离比 ,这表明该突变是单位点隐性突变(表 1).
2.2　突变体 ems3的透镜观察
由于 ems3突变体表现为浅绿色的表型 ,所以需要比较
野生型和突变体的叶绿体的超微结构.野生型的叶肉细胞
中 ,能够观察到椭圆形叶绿体 ,其内含有发育完好的类囊体
片层结构 ,能明显区分基粒类囊体和基质类囊体 , 见图 2
(2).与之相比 , ems3突变体中的叶绿体的大小比野生型的
略小 ,但也有明显的基粒类囊体和基质类囊体的分化 ,见图
2(1).这些结果说明 , ems3突变体中叶绿体发育较野生型
没有明显的差异.
表 1　ems3突变体株单株种子萌发统计突变体与正常叶色的比值
编号 浅绿植株 正常植株 总数 χ2 P值
EMS3-1 35 115 150 0.213 0.25～ 0.5
EMS3-2 28 94 122 0.213 0.25～ 0.5
EMS3-3 36 114 150 0.053 0.75～ 0.95
(1)ems3突变体的叶绿体显微结构　　　　　　　　　　　　　　　(2)野生型的叶绿体显微结构
a为淀粉粒;b为嗜锇粒;c为基粒
图 2　拟南芥叶绿体的超微结构
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2.3　突变体 ems3的基因定位
用 ems3杂合子与 Col野生型杂交的 F2代作为定位群体 ,利用分布于拟南芥 5条染色体中 24个平
均分布有明显多态性的分子标记 ,检测 2个 DNA突变体池和 2个亲本的基因组 DNA的差异 ,进行染色
体初定位.其中 18个 InDe1分子标记由本实验室根据网上(htp://www.arabidopsis.org)公布的拟南芥
全基因组 DNA多态性数据库筛选得到 ,另外 6个 SSLP分子标记 ,根据文献[ 9]报道设计.
其中第 5条染色体上的分子标记 T22D6在突变池中和亲本的基因组 DNA间检测出显著扩增差异
(图 3),这些结果表明该基因位于第 5条染色体上的 T22D6这个分子标记附近.
T22D6　　　　　　　　　NGA139　　　　　　　　　MJC20　　　　　　　　　MYN21
1, 2:2个混合 DNA池模板;L:LerDNA模板;C:ColDNA模板;LC:Col与 Ler混合 DNA模板
图 3　拟南芥突变体 ems3基因初定位在第 5条染色体的 4个分子标记电泳图
为了进一步确定该基因在染色体上的位置 ,利用新的分子标记(表 3)分析了 600个突变体单株的
基因型.重组子结果表明 ,分子标记 MHF15产生了 2个单交换 ,而分子标记 MHF152产生了 3个单交
换 ,如表 2所示.最终将 EMS3的基因精细定位在分子标记 MHF15和 MHF152这之间 ,大约 55kb的范
围内 ,如图 4显示的是这 2个分子标记在染色体中的位置.
表 2　EMS3基因精细定位的重组子分布
单株序号 CIW15 MHF15 MHF152 CIW14
22 LC LL LL LL
130 LC LC LL LL
340 LC LC LL LL
383 LC LL LL LL
392 LL LL LL LC
397 LC LL LC LC
398 LC LL LC LC
406 LC LL LC LC
408 LL LL LL LC
412 LC LL LL LL
表 3　精细定位引物信息
分子标记名称 上游序列 下游序列
CIW15 TCCAAAGCTAAATCGCTAT CTCCGTCTATTCAAGATGC
MHF15 GGCCTAAGCTCAAGCAATC CAGACCAAGAAGAGAGATTG
MHF152 CATGAGTTGGAAACTTGGAG ATCTCTCGGATCGATCGTT
CIW14 CATGATCCATCGTCTTAGT AATATCGCTTGTTTTTGC
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图 4　EMS3基因精细定位
3　讨　论
拟南芥作为模式植物 ,其基因功能分析对于植物基因的研究有重要的意义.本实验室经化学诱变剂
EMS诱导获得一例致死的叶色突变体 ems3 ,该突变体能正常萌发且形成为浅绿色的子叶 ,但在形成 4
片真叶后死亡.然而 ,电镜的结果显示 , ems3突变体中叶绿体发育较野生型没有明显的差异.则该基因
虽然是叶色突变体 ,但是却能正常的形成叶绿体及类囊体结构 ,与之前报道的许多叶绿体发育不完整的
叶色突变体是不同的.因此 ,预测该基因不影响叶绿体的发育 ,而可能与叶绿素的生物合成途径有关 ,最
终导致植物无法正常进行光合作用而死亡.
图位克隆是一种正向遗传学的基因克隆方法 ,主要是通过寻找与目的基因相连锁的分子标记来进
行基因定位 [ 9] .本实验中 , EMS3已经定位到 MHF15和 MHF152这两个分子标记之间的区间 ,根据 TAIR
数据库的信息 ,该区间内含有 16个基因 ,目前正在进一步缩小区间 、克隆基因 ,并对基因的功能进行研
究.对 EMS3的进一步定位 、克隆和功能分析 ,将为更好地诠释植株发育及叶色基因致死的作用机理提
供一个有力证据.同时对于该类突变体的研究有着迫切的理论需要和广阔的应用前景.
由于叶色变异是比较常见的突变性状 ,突变基因往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解 ,改变
叶绿素含量.叶色变异通常影响突变体光合效率 ,造成作物减产 ,严重时甚至导致植株死亡.近年来 ,随
着叶色突变体的利用价值受到越来越多关注.在育种工作中 ,叶色变异可作为标记性状 ,简化良种繁育
和杂交种生产;某些叶色突变体具有特殊的优良性状 ,为作物遗传育种提供了优秀的种质资源.在基础
研究中 ,叶色突变体是研究植物光合作用 [ 10] 、光形态建成 、激素生理[ 11]以及抗病机制 [ 12]等一系列生理
代谢过程的理想材料;同时利用此种突变体可分析鉴定基因功能 ,了解基因间互作[ 13] .
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GeneticmappingofanArabidopsisthalianapigmentmutantgeneems3
JIANGYan, WANGXiao-meng, YANGZhong-nan
(ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:AnArabidopsisthalianapigmentmutantems3 wasobtainedbyenthylmethanesulfonate(EMS)mutagenesisstrategy.
Geneticanalysisindicatedthatthepigmentmutantphenotypewascontrolledbyasinglerecessivelocus.Amap-basedcloning
approachwasused, andEMS3 wasmappedtoaregionof55kbbetweenthemolecularmarkersMHF15andMHF152 onchromo-
some5.Inthisregionthereare16 annotatedgenesbasedonbioinformaticsanalysis.Theseresultswillmakecontributionstothe
molecularcloningofthisgeneandfunctionalanalysisofchloroplastdevelopment.
Keywords:Arabidopsisthaliana;pigmentmutation;mapping;InDelmolecularmarker
(责任编辑:郁　慧)
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