全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1073
杂交方法获得的拟南芥蔗糖转运蛋白基因SUC3/SUC5双突变体及其PCR
鉴定
吴晓丹 张立军* 白雪梅 李敏 阮燕晔
沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳110161
提要 文章以拟南芥T-DNA插入纯合突变体atsuc3和atsuc5为亲本，采用传统杂交技术与PCR鉴定相结合的方法获得
了atsuc3/atsuc5纯合双突变体。
关键词 拟南芥；atsuc3/atsuc5双突变体；杂交；PCR
Acquired Sucrose Transporter Gene SUC3/SUC5 Double-mutant of Arabidopsis
thaliana by Cross and Its PCR Identification
WU Xiao-Dan, ZHANG Li-Jun*, BAI Xue-Mei, LI Min, RUAN Yan-Ye
College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
Abstract In this research, we crossed T-DNA inserted mutants atsuc5 with atsuc3 to produce atsuc3/atsuc5
double-mutant and used PCR to identify homogeneous double-mutant. In addition, the problems of cross and
PCR process were discussed.
Key words Arabidopsis thaliana; atsuc3/atsuc5 double-mutant; cross; PCR
收稿 2006-08-08修定　 2006-11-07
* 通讯作者(E-mail: ljzhang@syau.edu.cn, Tel: 024-
88487163)。
蔗糖是植物光合作用中最先形成的游离糖，
也是光合产物运输的主要形式。蔗糖转运蛋白在
蔗糖的跨膜转运、分配和在库组织中的代谢等过
程中均起重要作用(Barker等2000；Dreyer等
1999)。目前，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中
已经鉴定出9个蔗糖转运蛋白基因(AtSUC或
AtSUT)序列，同属一个基因家族(http://www.
arabidopsis.org/info/genefamily/sucrose.html)。其
中，研究较多的是AtSUC1和AtSUC2。已发现
AtSUC2定位于伴胞质膜中(Stadler和Sauer 1996);
而AtSUC1主要在叶柄的筛管中表达，这可能与外
渗蔗糖的回收有关(Stadler等1999)。近年来，也
有关于AtSUC3和AtSUC4的报道，前者在维管组
织附近的细胞和心皮细胞中表达，它可能具有促
使种荚开裂的功能(Meyer等2000) ；后者主要在
较小的叶脉中表达，此蛋白对蔗糖具有高亲和力
(Weise等2000)。目前，多用反向遗传学的方法
探索基因的表达规律，而对蔗糖转运蛋白生理功
能和基因家族中各成员之间相互关系的报道尚未
见，多基因突变体的获得则是后者得以进行的重
要前提。本文以atsuc3、atsuc5纯合单突变体(均
为T-DNA插入引起的突变)为亲本，采用传统杂
交法并结合PCR技术获得atsuc3/atsuc5纯合双突
变体。此种突变体可为反向遗传学方法研究蔗糖
转运蛋白基因功能及其基因家族中各成员之间的相
互关系提供实验材料，同时也表明用杂交技术获
得拟南芥多基因突变体是可行的。
材料与方法
材料为我们实验室从拟南芥生物资源中心
(Arabidopsis Biological Resource Centre, ABRC)提供
的编号为SALK_092412和SALK_077715拟南芥
(Arabidopsis thaliana)种子中分别筛选并扩繁得到
的atsuc5和atsuc3纯合单突变体种子(原种为Co-
lumbia-0型)，均为T-DNA插入倒置的突变体株系
种子。野生型(Columbia-0型)种子，由英国伯明
翰大学提供。
种子置于湿润滤纸上并于4℃下春化3~4 d
后，播种于盆土(营养土:草炭土:蛭石=1:1:1)中，室
内培养，温度18~25℃，相对湿度50%~80%，每
天10 h光照/14 h黑暗，光强约150 mmol·m-2·s-1。
亲本植株开花后，进行人工杂交。以atsuc5
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2006.06.013
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1074
纯合单突变体为母本，atsuc3纯合单突变体为父
本。在解剖镜下，用镊子除去前一日开花的母本
的全部萼片、花瓣和雄蕊。若去雄花的雌蕊柱头
已有花粉，说明该雌蕊已授粉，不用作为杂交的
母本，即予以除去。对解剖镜下未见沾染其他花
粉的雌蕊于10 h后再观察，若柱头毛失去光泽并
开始萎蔫，则说明该雌蕊已授粉，也予以除去。
若柱头毛密集、润泽，表明该雌蕊未接受其他花
粉，即用作为杂交的母本。操作时，用镊子挑
取父本的雄蕊，在解剖镜下将花粉涂布在母本柱
头上，注明杂交亲本的代码。通常柱头授粉10 h
后柱头毛开始萎蔫，3 d后种荚即伸长，据此判
定杂交成功与否。杂交成功后，将母本植株的其
他花蕾除去，杂交的种荚变黄时，收获F1种子。
对F1植株进行PCR检测，确认杂交成功的F1进行
自交，收获F2种子。
PCR法检测时，采用杨双等(2005)的方法提
取拟南芥幼苗的总DNA，用作PCR的模板。参
考李敏等(2006)对拟南芥T-DNA插入突变体的
PCR鉴定方法，进行检测和筛选。PCR引物设计
参照SIGnAL的相关资料(http://signal.salk.edu/
isectprimers.html)。AtSUC5基因引物和T-DNA的
引物LBal由上海博亚生物技术有限公司合成，
AtSUC3基因引物由北京三博远志生物技术有限公
司合成。PCR反应总体系均为20 mL：1 mL模
板、引物各1 mL (20 mmol·L-1)、0.4 mL dNTPs
(10 mmol·L-1)、2 mL 10×PCR缓冲液、3.6 mL
MgCl2 (25 mmol·L-1)、1 U Taq-DNA聚合酶、10.8
mL ddH2O。反应程序为：94℃变性5 min；94℃
变性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min，35
个循环；再于72℃延伸7 min。
通过2次引物不同的PCR (分别称为PCR 2和
PCR 3，同样的名称和体系也用于下述对F2群体
的筛选)，对F1植株进行检测，以确定杂交结果。
PCR 2的引物为AtSUC5基因的LP (5 gcaaataatt-
agaattttctcgca 3)和RP (5 t aagtcttttcttgttaatgtgg
3)，对目的基因AtSUC5进行扩增。杂交母本为
atsuc5纯合突变体，其AtSUC5基因由于已插入了
T-DNA，PCR结果为阴性，但杂交成功后，F1
从父本处获得未突变的AtSUC5基因，因而PCR
结果呈阳性，而未杂交成功的F1，无PCR产物。
PCR 3的引物为T-DNA的LBa1 (5tggttcacgta-
gtgggccatcg 3)和AtSUC3基因的LP (5 tcgacaccg-
agtcactcatcg 3)，目的是检测AtSUC3基因中是否
含有插入的T-DNA，用以验证PCR 2的结果，从
而防止假阳性的出现。母本atsuc5纯合突变体的
AtSUC3基因中未插入T-DNA，因而对于未杂交
成功的F1来说，无PCR产物，但杂交成功的F1
可从其父本atsuc3纯合突变体中获得插入T-DNA
的AtSUC3基因，因而PCR 结果呈阳性。2次PCR
的退火温度分别为50和58℃。
PCR筛选F2植株时，通过4次引物不同的PCR
(分别称为 PCR 1、PCR 2、PCR 3和PCR 4)从
F2群体中筛选出纯合双突变体。PCR 1的引物
为AtSUC3基因的LP和RP (5 tcaccttcacaatcac-
acaca 3)，以检测在F2群体中是否存在AtSUC3基
因的纯合插入，无扩增产物的植株用于下一轮筛
选；PCR 2的目的是检测F2群体中是否存在AtSUC5
基因的纯合插入，对两轮PCR均无扩增产物的植
株进行下两轮验证；PCR 3和PCR 4 (引物为LBa1
和AtSUC5基因的LP)，分别确证T-DNA在 tSUC3
和AtSUC5基因中的插入情况，进一步验证PCR 1
和PCR 2的结果。PCR 1和PCR 4退火温度分别为
50和58℃。本文为便于说明F2所有可能的PCR结
果及基因型，在实验过程中仍保留了非目标株。
以琼脂糖电泳检测PCR产物时，用1.7%琼
脂糖凝胶(内含0.5 mg·mL-1 Goldveiw)检测扩增结
果，于波长300 nm处观察，照相记录。所用DNA
分子量标准为GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus
(MBI，购自上海生物工程有限公司)。
实验结果
1 F1植株的PCR检测
图1显示 ：(1)泳道2和3分别为野生型和atsuc3
纯合单突变体，其AtSUC5基因未突变，可见条
带清晰的扩增产物，分子大小介于900~1 031 bp
之间；泳道4为atsuc5纯合单突变体，其AtSUC5
基因由于插入了T-DNA而无扩增产物；泳道5和
6显示出AtSUC5基因特有的扩增条带，因而判断
这2个植株已通过杂交，从父本获得了未突变的
AtSUC5基因；泳道7无扩增产物，说明杂交未
成功(图1-a)。(2)泳道2和4无扩增产物，说明野
生型和atsuc5纯合单突变体的AtSUC3基因中无T-
DNA插入；泳道3为atsuc3纯合单突变体，有条
带清晰的扩增产物，分子大小介于600~700 bp之
间；泳道5和6的PCR结果呈阳性，因而判断这
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2个植株已通过杂交从父本获得插入了T-DNA的
AtSUC3基因；泳道7无扩增产物，说明杂交未
成功(图1-b)。
2 F2植株的PCR筛选
图2显示：(1)泳道6~9、11、12的F2和泳
道2的野生型可见清晰的产物条带，产物分子大
小为900 bp左右，说明它们的AtSUC3基因未突
变；泳道4、5、10的F2与泳道3的atsuc3纯合
突变体均无条带，说明这些F2的AtSUC3基因发
生了突变，其中可能含有双突变体(图2-a)。(2)泳
道5、7、8、10~12的F2和泳道2的野生型可见
清晰的产物条带，产物分子大小介于900~1 031 bp
之间，说明它们的AtSUC5基因未突变；泳道4、
6、9的F2与泳道3的atsuc5纯合突变体一样无条
带，说明这些F2的AtSUC5基因发生了突变，其
中可能含有双突变体(图2-b)。(3)泳道6、8、12
的F2和泳道2野生型无大小介于600~700 bp之间
的PCR产物，说明无T-DNA插入到AtSUC3基因
中；泳道4、5、7、9~11的F2和泳道3的atsuc3
纯合突变体有PCR产物，说明AtSUC3基因中插
入了T-DNA (图2-c)。(4)泳道5、7、12的F2和
泳道2的野生型无PCR产物，说明无T-DNA插
入到AtSUC5基因中；泳道4、6、8~11的F2和
泳道3的atsuc5纯合突变体有PCR产物，说明
AtSUC5基因中插入了T-DNA (图2-d)。
通过上述PCR 1、2的筛选和PCR 3、4的
验证，可知图2中泳道4因无AtSUC3和AtSUC5
基因的PCR产物，且T-DNA 插入情况的验证结
果呈阳性，确定其为AtSUC3/AtSUC5基因的纯合
双突变体(表1的b型)。其余的F2也可通过对比
图1 F1植株PCR检测的电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR products of F1
1：DNA分子量标准；2：野生型；3：atsuc3纯合单突变体；4：atsuc5纯合单突变体；5~7：F1。
图2 F2植株PCR筛选的电泳图谱
Fig.2 Electrophoresis pattern of PCR products of F2
　　a、c中，1：D N A分子量标准；2：野生型；3：a t s u c 3纯合单突变体；4 ~ 1 2：F2。b、d中，1：D N A分子量标
准；2：野生型；3：atsuc5纯合单突变体；4~12：F2。
植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月1076
表1确定相应的基因型；泳道5对应c，为atsuc3
纯合单突变体；泳道6对应d，为atsuc5纯合单
突变体；泳道12对应a，为野生型；泳道7~10
分别对应e~h，基因型为一对纯合和一对杂合；
泳道11对应i，即同F1的基因型，为双杂合。
表1 基因型与PCR检测的对比
Table 1 Contrast between genotypes and PCR identifications
基因型 PCR 1PCR 2PCR 3PCR 4
a + + - -
b - - + +
c - + + -
d + - - +
e + + + -
f + + - +
g + - + +
h - + + +
i + + + +
　　 ：AtSUC3； ：AtSUC5；Ñ：T-DNA；+：有
P C R产物；-：无P C R产物。
雄配子可能的组合方式中，有4种组合的基因型
是纯合的，即为野生型、atsuc3单突变体、atsuc5
单突变体和atsuc3/atsuc5双突变体。因此，在F2
群体中筛选出atsuc3/atsuc5双突变体的概率为
1/16。虽然概率不高，但只要筛选得到1株双突
变体，其产种量即足以满足实验需要。
如果试验无需保留和分辨非双突变体植株，
则通过每次的 PCR都可以及时排除非目的植株，
以减少进行下一组 PCR时的工作量。鉴定F
2
群体
时，一般通过 PCR 1和 PCR 2就能将纯合双突变
体筛选出来，本文结果中只有纯合双突变体在这2
次电泳检测中都不会出现条带，但由于 PCR方法
本身的原因，以及为避免 PCR 1和 PCR 2出现假
阳性结果起见，应分别用 PCR 3和 PCR 4来验证
它们的真实性。用双 PCR方法检测 F
1
，也是出于
这一考虑。这除能防止 PCR出现假阳性外，通过
对 F
2
群体 4张电泳图谱的比较，还可以分辨出所
有 F
2
的基因型。
参考文献
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讨　　论
拟南芥为长日植物，长光照下提早开花(韩
玉珍等1998)，因此用作杂交的植株其光照时间不
宜过长，以免营养生长不充分，这样开出的花较
小，不易进行杂交操作。去雄时只要不损伤雌
蕊，即使去除全部的花瓣和萼片，也不影响杂交
的进行。每个花序轴上所开的第1~2朵花，通常
是不结实的，不宜用其杂交，以后生长的几朵花
方适于杂交。另外，随着植株的衰老，花逐渐
变小，杂交的成功率下降。几个杂交种荚中的F1
种子即足以满足实验需要，所以一旦确定杂交成
功，即可将母本植株的其他花蕾除去，以避免花
粉和种荚的混杂，并保证杂交种荚能够得到足够
的营养而可充分发育。
AtSUC3和AtSUC5基因分别位于拟南芥
(2n=10)的第1和第2条染色体上(http://www.
arabidopsis.org/info/genefamily/sucrose.html)，因
此在F1自交产生F2的过程中，符合孟德尔的独立
分离规律，即在减数分裂形成配子时，每对同源
染色体上的每一对等位基因发生分离，而位于非
同源染色体上的基因间可以自由组合。F2 代群体
中共有9种基因型(表1)。在F1所产生的16种雌