全 文 ：第 33卷第 6期
20 1 0年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.6
Nov .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)06-0026-05
拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性
邢继红1 , 　班红卫2 , 　瓮巧云1 , 3 , 　董金皋1
＊ (1.河北农业大学 植物分子病理学实验室 , 河北 保定 071001;
2.河北省东光县农业局 , 河北 东光 061600;3.河北北方学院 , 河北 张家口 075000)
摘要:为明确拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性 ,并筛选具有抗性的拟南芥材料 , 试验通过对拟南芥 11 个
生态型进行接种试验 ,研究其对 21 个灰葡萄孢菌株的反应 , 结果发现 , 有 10 个灰葡萄孢菌株对拟南芥的 11 个
生态型表现抗/感差异。其中 Co l-0 、Ws-0 和 Ler生态型接种灰葡萄孢菌株 BC18 后表现典型的抗病和感病反
应。组织病理学试验进一步确定了 Col-0、Ws-0 生态型为抗病生态型 ,而 Ler为感病生态型 , 试验结果为进一步
的植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定基础。
关　键　词:拟南芥;生态型;灰葡萄孢;抗病性
中图分类号:S 432.23 文献标志码:A
Resistance of different Arabidopsis ecotypes to Botrytis cinerea
XING Ji-hong1 , BAN Hong-wei2 , WENGQiao-yun1 , 3 , DONG Jin-gao1
(1.Plant Molecular Pa tho lo gy Lab., Agricultural Univer sity o f Hebei , Baoding 071001 , China;
2.Agriculture Bureau of Dongguang County Hebei Pr ovince , Dongguang 061600 , China;
3.Hebei No rth Univer sity , Zhang jiakou 075000 , China)
Abstract:To identify the resistance o f different Arabidopsis eco types to Botry tis cinerea and
screen Arabidopsis materials w hich show ed resistance w hile being infected by Botry t is , 11 Ar-
abidopsis eco types w ere inoculated by 21 isolates of Botry tis cinerea.10 iso lates displayed dif-
ferent symptoms on the leaves of different Arabidopsis ecotypes.Col-0 ecotype and Ws-0 eco-
ty pe we re resistant to isolate BC18 of B .cinerea , Ler ecotype w ere susceptible symptoms to i t.
After inoculation , Co l-0 eco type show ed immunity symptoms , while Ws-0 ecotype had HR re-
sponse.To identi fy the resistance o f Co l-0 ecotype to iso late BC18 of B-cinerea , Cell histo logy
of Col-0 , Ws-0 and Ler ecotypes af ter being inoculated by high concentration of B .cinerea
spores were observed.Resul ts indicated that Col-0 and Ws-0 ecotypes show ed HR response af-
ter being inoculated w ith high concentration of B.cinerea.It also suggested that Col-0 and Ws-
0 ecotypes had high resistant response to B.cinerea.The f inding s w ill lay the founda tion fo r
cloning of resistance gene and genetic improvement.
Key words:Arabidopsis thaliana ;ecotypes;Botryt is cinerea;resistance
＊收稿日期:2010-09-09
基金项目:河北省自然科学基金项目(08B021)和河北农业大学“ 9816”科技重点项目资助.
作者简介:邢继红(1977-),女 , 河北省沧州人 , 博士 ,副教授 , 主要从事微生物与植物分子互作研究.
通讯作者:董金皋(1963-),男 , 河北省邢台市人 , 教授 ,研究方向:植物分子病理学.E-mail:shmdjg@hebau.edu.cn
　第 6期　 邢继红等:拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性
　　由灰葡萄孢(Botryt is cinerea)引起的灰霉病是
一种世界性的重要病害 。该病菌寄主范围广 ,可侵
染多种植物 ,常造成重大经济损失 。近年来 ,国内外
学者对植物与灰葡萄孢互作已经进行了大量研究 ,
明确了植物激素水杨酸(SA)[ 1] 、茉莉酸(JA)[ 1] 、乙
烯(ET)[ 2] 和胞内信号分子一氧化氮(NO)[ 3] 对灰葡
萄孢的抗性反应均有调节作用 。且获得了一些植物
抗灰霉病相关基因 ,如:BOS1 、BOS 2 、BOS3 、BOS 4 、
SS I2 、EDS 5 、PAD4 和 B IK1。其中 BOS 1 、BOS 2 、
BOS3 、BOS 4和 B IK 1是拟南芥受灰葡萄孢侵染诱
导表达的基因。BOS1基因编码的 R 2R3MYB 转录
因子蛋白与茉莉酮酸酯信号转导途径交互作用[ 4] ;
BOS2 、BOS 3和 BOS4是灰葡萄孢侵染必需的 3个
独立的抗性相关基因 , BOS2 、BOS 3和 BOS4 可能
分别影响植保素的水平 ,对乙烯和茉莉酸的反应[ 5] ;
B IK1基因编码一个定位在膜上的由灰葡萄孢诱导
表达的激酶 ,作用于识别或传导病原菌侵染的早期
阶段 ,对于拟南芥抗生物胁迫和非生物胁迫都有着
重要的作用[ 6] ;而 S S I2和 EDS 5 、PAD4 基因共同
作用来调节对灰葡萄孢侵染的保卫反应[ 7] 。虽然对
植物与灰葡萄孢互作已经进行了大量研究 ,但目前
在实践中仍主要依靠化学防治 。由于植物种植资源
中尚无抗灰霉病的材料或品种 ,抗病育种难以进行 。
基于此 ,本试验选用不同的拟南芥生态型 ,研究其对
不同灰葡萄孢菌株的反应 ,筛选具有抗性的拟南芥
材料 ,并通过组织病理学方法研究灰葡萄孢的侵入
和菌丝扩展情况 ,在细胞学水平上进一步确定拟南
芥对灰葡萄孢的抗性 ,为进一步研究拟南芥抵抗灰
葡萄孢的分子机制奠定基础 ,促进植物抗病基因的
克隆和相关作物的遗传改良。
1　材料和方法
1.1　试验材料
供试拟南芥生态型:Col-0 、C24 、NahG 、Sha 、
Ws-2 、Nd-1 、Est-1 、Kas-1 、Ws-0 、Bay-0 、Ler 由美国
Donald Danfor th Plant Science Center 的夏亦荠博
士提供。
供试植物病原菌:供试的 21 个菌株灰葡萄孢
(Botry tis cinerea)均为河北农业大学真菌毒素实验
室保存菌种 。
1.2　病原菌接种
选取供试拟南芥生态型的 4周龄植株 ,用微量
移液器在叶片上接种 ,每叶片接种灰葡萄孢孢子悬
浮液 5μL(4×106 ～ 8×106 个/mL)。接种后将植
株置于 23 ℃光照培养室内保湿培养(每天 8 h 光
照 ,16 h黑暗)。
1.3　表型鉴定
观察接种后的拟南芥不同生态型的症状表现。
亲和性互作:以叶片有水渍状病斑 ,并且病斑周围有
黄色晕圈;接种部位有明显的菌丝层;接种叶片褪绿
变黄 、干枯 ,并随时间的延长病斑逐渐扩展 。非亲和
性互作:接种部位没有任何症状;表现过敏性坏死斑
点;接种叶片褪绿变黄 ,逐渐变为褐色 ,且随时间的
延长并不扩展。
1.4　组织病理学鉴定
将接种后的拟南芥植株分别在接种 1 、2 、3和
4 d后取样 ,以不接种的为空白对照。将拟南芥叶片
在染色液(20 mL 乙醇 、10 mL 苯酚 、10 mL 水 、10
mL 83%乳酸 、10 mg 台盘兰)中煮沸 2 ～ 5 min后 ,
用饱和水合氯醛(2.5 g/mL)溶液进行脱色。脱色
后清水漂洗 3 ～ 4 次 ,加入 50%的甘油在显微镜下
观察。
2　结果与分析
2.1　病原菌接种后的表型鉴定
将 21个灰葡萄孢菌株接种拟南芥 11个生态型
后 ,鉴定其抗性表现(见表 1)。从表 1可以看出 ,其
中 11个菌株(灰葡萄孢 BC1 、BC2 、BC3 、BC4 、BC5 、
BC6 、BC8 、BC13 、BC14 、BC16和 BC17)与拟南芥 11
个生态型均表现亲和反应;另外 10 个菌株(BC7 、
BC9 、BC10 、BC11 、BC12 、BC15 、BC18 、BC19 、BC20
和 BC21)接种拟南芥不同生态型后抗病性表现有差
异 ,有的表现为亲和反应 , 有的则表现为非亲和
反应。
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　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
表 1　拟南芥不同生态型对不同病原菌的反应
Table 1　Responses of different Arabidopsis ecotypes to different pathogens
病原真菌
Pa thogens
Co l C24 NahG Sha Ws-2 Nd-1 Est-1 Kas-1 Ws-0 Bay-0 Ler
灰葡萄孢 BC1 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC2 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC3 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC4 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC5 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC6 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC7 - + - + - + + - + + +
灰葡萄孢 BC8 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC9 + + - + - - + - + + +
灰葡萄孢 BC10 + + + + + - + + + + +
灰葡萄孢 BC11 - - - + - - - - - + +
灰葡萄孢 BC12 + - + + + + + - + + +
灰葡萄孢 BC13 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC14 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC15 - - - + - + + - - - -
灰葡萄孢 BC16 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC17 + + + + + + + + + + +
灰葡萄孢 BC18 - + - + - - + - - + +
灰葡萄孢 BC19 - - + - - + + - - - +
灰葡萄孢 BC20 - - - + - - - - - - +
灰葡萄孢 BC21 - - - + + - - - - + +
　　注:“ +”表示亲和反应;“ -”表示非亲和反应.
　　试验中发现 ,拟南芥不同生态型接种同一种病
原菌后虽然都表现为亲和或非亲和反应 ,但各自的
症状和严重程度并不完全相同。如 Col-0 和 Ws-0
生态型 ,接种灰葡萄孢菌株 BC18后均表现为非亲
和反应。Co l-0生态型在接种部位没有任何症状 ,而
Ws-0生态型则在接种部位出现过敏性坏死斑点(见
图 1-A 、B);Ler 和 Bay-0 生态型对灰葡萄孢菌株
BC18菌株都表现为亲和反应。 Ler 生态型则在接
种部位出现水渍状病斑 ,病斑透明 、褐色 ,周围有黄
色晕圈 ,Bay-0生态型在接种部位叶片褪绿变黄(见
图 1-C 、D)。Ws-0 、Ler和 Nd-1生态型对灰葡萄孢
菌株 BC16菌株都表现为亲和反应 ,但3个生态型症
状表现不同 , Ler 生态型接种叶片褪绿变黄 、干枯 ,
Ws-0和 Nd-1生态型在接种部位均有明显的菌丝
层 ,且 Nd-1 生态型整片叶呈湿腐状(见图 1-E 、F 、
G);Col-0 、Ws-0 和 Kas-1 生态型对灰葡萄孢菌株
BC17都表现为亲和反应 ,所表现的症状都呈湿腐
状 ,但是发病的严重程度不同。Co l-0生态型接种后
症状较轻 ,Ws-0生态型次之 , Kas-1生态型的症状
最为严重 ,整株呈湿腐状(见图 1-H 、I 、J)。
图 1　拟南芥不同生态型接种灰葡萄孢后的症状
Fig.1　Symptoms of different Arabidopsis ecotypes inoculated with isolates of B.cinerea
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　第 6期　 邢继红等:拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性
　　在有差异的 10 个灰葡萄孢菌株中 ,菌株 BC18
经过多代繁殖后 ,其产孢力和致病力都非常的稳定 ,
故选择菌株 BC18作为进一步试验的供试病原菌 。
同时选择了对其表现抗病的Ws-0和 Col-0生态型
及对其表现感病的 Ler 生态型为进一步研究的对
象。在 Col-0 、Ws-0和 Ler 生态型之间抗感差异极
为显著 ,有免疫类型和极感病类型;并有可能获得抗
病基因 ,因为抗病基因诱导的抗病性一般为高抗/免
疫的性状;并且 Co l-0和 Ler生态型已经测序 ,有利
于进行抗病基因的遗传分析和染色体定位 ,抗病基
因在抗病表型及高感类型之间存在显著差异 ,可能
是有无的差异 ,也可能是表达量的差异 ,有利于获得
差异表达的基因 。
2.2　组织病理学鉴定
试验对拟南芥 Col-0 、Ws-0和 Ler 生态型接种
后的细胞组织形态进行显微观察 ,比较灰葡萄孢的
孢子在拟南芥 3个生态型叶片上的萌发 、侵入及扩
展情况(图 2)。可以看出 ,接种 1 d 后 ,3 个生态型
都没有出现坏死细胞 , Ler 生态型叶片上大量的病
菌孢子萌发侵入;接种 2 d后 , 3个生态型均出现不
同程度的细胞死亡情况 。Ler生态型出现大面积的
坏死细胞群 ,而 Col-0生态型死细胞群的数量和面
积极少;接种 3 d后 ,3个生态型叶片上的死细胞群
的数量和面积较第 2天都明显增大 ,但抗病生态型
Col-0和Ws-0的死细胞数量和面积仍然很少 ,感病
的 Ler生态型则很多;接种 4 d后 , Col-0 、Ws-0生态
型死细胞群的数量和面积较第 3天没有明显的扩
展 ,而 Ler 生态型细胞死亡范围明显增大 。从 3个
生态型接种后的苗期症状可以看出 ,Co l-0生态型绝
大多数的叶片上没有任何症状 ,只有少数的下部叶
片上有过敏性坏死现象;Ws-0生态型大多数的叶片
上表现过敏性坏死或坏死斑 ,随时间的延长细胞死
亡的范围并不扩展;而 Ler生态型出现水浸状 、周围
有黄色晕圈的病斑 ,随时间的延长 ,叶片大面积腐烂
直至整株死亡。
图 2　拟南芥 Col-0 、Ws-0 和 Ler生态型接种灰葡萄孢 BC18 菌株后细胞组织形态
Fig.2　Cell histology of Col-0 , Ws-0 and Ler ecotypes of Arabidopsis infected by isolate BC18 of B.cinerea
3　讨论与结论
拟南芥是目前研究植物-病原物互作的典型模
式植物[ 8] 。国内外学者对拟南芥与灰葡萄孢的互作
已经进行了大量研究 ,最初研究主要集中在对灰葡
萄孢侵染后诱导产生的化学物质的鉴定与作用
上[ 9-11] ;近年来 ,研究工作主要集中在对灰霉病抗性
相关的拟南芥突变体的研究上 ,通过对一些灰葡萄
孢感病增强明显的突变体的研究 ,鉴定 、分离到了
BOS1 、BOS2 、BOS 3 、BOS4 、B IK 1等拟南芥抗灰霉
病相关基因[ 4-6] ,这些基因失活 ,拟南芥的感病性增
强 。但是由于其使用的拟南芥材料(野生型)均感灰
霉病 ,因此所获得的基因均为灰葡萄孢侵染后诱导
表达的基因 ,且由于所使用的均是感灰霉病材料 ,致
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　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
使在突变体的筛选(主要是感病强弱的症状区分)及
抗灰霉病基因的获得上均造成相当大的困难 。基于
此 ,本试验选用 11个拟南芥生态型 ,研究其对 21个
灰葡萄孢菌株的反应 ,旨在筛选具有抗性的拟南芥
材料 。为进一步研究拟南芥抵抗灰葡萄孢的生化和
分子机制奠定基础 ,促进植物抗病基因的克隆和相
关作物的遗传改良。
试验发现 ,在供试的 21 个灰葡萄孢菌株中有
10个菌株对拟南芥的 11 个生态型表现抗/感差异 。
通过接种试验确定了灰葡萄孢菌株 BC18及对其表
现非亲和反应的 Ws-0 、Co l-0生态型和对其表现亲
和反应的 Ler生态型作为进一步试验的研究对象 。
试验从细胞学角度进一步确定了 Col-0 、Ws-0 生态
型为抗病生态型 ,而 Ler为感病生态型 。今后的工
作将应用差异表达技术挖掘拟南芥抗灰葡萄孢的相
关基因 ,并通过功能互补试验验证基因在拟南芥抗
灰霉病过程中的作用 ,为农作物的抗病育种提供很
好的抗性资源。
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(编辑:李　川)
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