全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2008年 12月, 30(12): 1615―1621
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2008−04−08; 修回日期: 2008−06−06
基金项目: 中国科学院“百人计划”择优资助项目[Supported by “Hundred talents” Program of the Chinese Academy of Sciences]
作者简介: 蒋细兵(1982−), 男, 硕士研究生, 专业方向：植物基因功能分析。E-mail: wrkyprotein@yahoo.com
通讯作者: 余迪求(1964−), 男, 研究员, 研究方向：植物功能基因分析、植物抗逆信号传导及分子生物学。E-mail: ydq@xtbg.ac.cn

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.01615
拟南芥 Peptide5和 Peptide6的表达谱分析
蒋细兵 1, 2,余迪求 1
1. 中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部, 昆明 650223;
2. 中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要: 通过对 5 个拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)预测性多肽进行 RT-PCR 分析, 在 mRNA 水平证实了 Peptide5
和 Peptide6 预测性多肽的真实性。表达谱分析表明: 两基因在不同的发育期和不同的组织普遍表达, 为组成型
基因; 对 NaCl、聚乙二醇 4000(PEG4000)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、机械损伤和冷害做出基因转录水
平的响应。启动子顺式作用元件分析提示, 拟南芥 Peptide5 基因可能参与了次生木质部的形成。
关键词: 预测性多肽基因; Peptide5; Peptide6; 表达谱; 顺式作用元件分析
Expression profile analysis of Peptide5 and Peptide6 in Arabidopsis
JIANG Xi-Bing1, 2, YU Di-Qiu1
1. Kunming Section, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China;
2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Two predicted peptide genes in Arabidopsis thaliana L., Peptide5 and Peptide6, was confirmed by RT-PCR in
mRNA level. The expression profile indicated that both genes were generally expressed at different developmental stages
and tissues as constitutive gene expression, and they also responded to six treatments including NaCl, PEG, MeJA (methyl
jasmonate), SA (salicylic acid), cold and wound in transcription level. Analysis of the promoter sequence suggests that Pep-
tide5 in Arabidopsis may contribute to the secondary xylem formation.
Keywords: predicted peptide gene; Peptide5; Peptide6; expression profile; cis-acting element analysis
大量动物研究表明, 多肽可能以其序列和翻译
后修饰的多样性而成为动物胞间互作最为普遍的介
质。一直以来, 亲脂性小分子化合物被认为是高等
植物胞间互作的主要信号分子, 近来大量的研究已
表明, 植物多肽参与了植物生长与发育等不同方面
的调控, 包括植物防御、细胞增殖、分生组织调控、
自交不亲和、组织脱落、豆科植物根瘤形成等过程。
对其功能和作用方式较明确且被公认为植物多肽激
素的有: 响应机械损伤并系统性诱导防御蛋白基因
转录的系统素(Systemin), 包括番茄系统素(TomSys)
和富含羟脯氨酸糖肽 (HypSys, hydroxyproline-rich
glycopeptides)[1~3]; 使看护培养的分子原理得以解释
并参与细胞增殖的植物硫肽激素(PSK)[4]; 由花粉绒
毡层分泌并随花粉的发育沉积于花粉鞘, 与柱头乳
突细胞分泌的 SLG/SRK受体复合物相互识别, 产生
孢子体自交不亲和反应的 SCR/SP11[5~7]; 通过直接
与 CLV1 的胞外域结合, 以配基—受体形式发挥功
能[8],参与茎分生组织干细胞分生与分裂平衡维持的
CLV3[9]。目前, 植物多肽功能研究主要集中在发育
等过程, 对其响应环境因子并未见报道。而本文研

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究结果提示, 植物多肽可能普遍参与了植物不同阶
段的发育 , 并对环境因子的改变做出转录水平的
响应。
利用生物信息学方法进行全基因组搜索, 研究
人员发现拟南芥基因组内存在大量的预测性多肽[10],
但这些多肽存在的真实性和相应的分子生物学功能
仍然需要大量的研究工作来验证和解析。本实验基
于RT-PCR技术, 从mRNA水平检测该数据库内的 5
个预测性多肽, 并对验证的多肽进行表达谱分析。
表达谱借助 Bio1D 软件进行象素化处理, 获得对应
的 mRNA相对表达量柱状图。启动子顺式元件分析
提示 Peptide5 可能参与了次生木质部的形成。这些
研究结果 , 将为今后该基因的功能研究提供重要
参考。
1 材料和方法
1.1 材料
实验使用的拟南芥为野生哥伦比亚生态型
(Arabidopsis thaliana L., Col.), 生长条件为温度 22
℃, 相对湿度 50%, 光照周期 10 光/14 暗(光照时间
8:30~18:30)。用于处理的材料为 3 w苗龄, 除 4℃冷害
处理则采用全光照, 其他均保持原光照周期。
RNA提取试剂盒和 DNaseⅠ由天根生化科技有
限公司提供(货号 DP402 和 RT411), 反转录试剂盒
和 PCR聚合酶采用MBI公司产品(货号 1632), 引物
由上海生物工程有限公司合成 , PCR 仪器型号为
PTC-100, 凝胶成像系统为 Vilber lourmat。
本文研究的 5 个预测性多肽均位于拟南芥 1 号
染色体, 来自 Lease和Walker于 2006年建立的数据
库 (http://peptidome.missouri.edu/)[10], 基本信息见
表 1。
1.2 方法
总 RNA提取采用柱型硅胶吸附法提取, 并进行
DNaseⅠ消化。反转录采用 Oligo-d(T)18反转录 1 µg
总 RNA, 1 µL反转录产物用作 PCR模板, 反转录产
物−80℃保存(具体操作步骤请参考试剂盒手册)。
为了保证实验结果的可靠性, 每组反应均配有
阳性对照和阴性对照, 分别以拟南芥基因组DNA和
ddH2O为模板。只有目的 PCR产物与阳性对照位置
一致且阴性对照无产物; 或目的 PCR 无产物且阴性
和阳性均正常, 才认可 PCR 结果。Actin2 作为内标
基因; PCR循环数基于预实验, 选择适宜的次数; 每
组 RT-PCR重复 3次以上。
PCR体系(30 µL): Taq buffer (10×)3 µL; MgCl2
(25 mmol/L) 2 µL; dNTP (2.5 mmol/L each) 2 µL; 正
向和反向引物(0.1 µg/µL)各 2 µL(引物序列见表 2);
Taq 聚合酶(5 U/µL) 0.25 µL; 模板 1 µL, 水补齐
至 30 µL。PCR循环程序: 95℃, 5 min→(95℃, 45 s
→Tm℃, 45 s→72℃, 30 s)n→72℃, 5 min(Tm表示复
性温度, n表示循环数, 见表 2)。

表 1 本文多肽的基本信息(前原蛋白的下划线, 标示预测的信号肽)
Table 1 The basic information of the five predicted peptides (predicted N-terminal signal sequences are underlined for prepro-
protein )
简称
Abbreviation
检索名
Name
基因序列
Gene sequence
前原蛋白
Preproprotein

Peptide2 ath_mu_ch1_22top
ATGAGTCAAAGGAATTCACAGTGGAACTATCTCAAGAACA
TGATCATTGGCTTCTTATTGTTCATCTCCATCATTGGCTGG
ATCATTCTGGTTCAAGAGGTCAAATTATATATACATAACG
GATCTAAGAAGTATAGTGTAGTCAATTAA
MSQRNSQWNYLKNMIIGFLL
FISIIGWIILVQEVKLYIHNGS
KKYSVVN

Peptide3 ath_mu_ch1_48top
ATGCTATTGTTGACTAGATATAAATTTGGTGTGTGCAGTGA
TACACAACTTTTATTCGTATACACACTCTGGTTTTTGAAGG
AAATATCAGAATCCTTATATCATACTAAAATTATGCATAA
TCATCAAATAAATAAGTATATTAAGATTTATTAA
MLLLTRYKFGVCSDTQLLFV
YTLWFLKEISESLYHTKIMHN
HQINKYIKIY

Peptide5 ath_mu_ch1_138top
ATGCTTATCAGTATCAGCCCACTGATATTTGTGATACCAGT
ATCATCTGACGTGGCTTCTTCTGATTGGTTACATTTGACAA
AAGCAAAAAATATTATATATATTTATTAA
MLISISPLIFVIPVSSDVASSD
WLHLTKAKNIIYIY

Peptide6 ath_mu_ch1_163top
ATGTTTTTTGCATTTTTGGTTGTTATATGTTGGCAGCATGC
AGCAGCCAACGAGTTATGTGTAGATGCTGGTTCAACCAAC
TCGACCTATATGGGTTATAGTTATACGAGTTGTTGA
MFFAFLVVICWQHAAANELC
VDAGSTNSTYMGYSYTSC

Peptide12 ath_mu_ch1_372top
ATGTCGTTAATGTTGTCTTTTTTTCTTTCACTTCCGTCTGTT
TTTTTTGTGGTATTGGTTAATTCGAAAAGATTCGGAACCTA
TTGGCCGGCAAAAAAGTTATCCAAATGA
MSLMLSFFLSLPSVFFVVLVN
SKRFGTYWPAKKLSK


第 12期 蒋细兵等: 拟南芥 Peptide5和 Peptide6的表达谱分析 1617


表 2 RT-PCR 使用的引物、复性温度和循环数
Table 2 Primer sequence, annealing temperature, and cycles used in RT-PCR
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′→3′)
复性温度
Tm (℃)
循环数
Cycles
Actin2 ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT GAAACATTTTCTGTGAACGATTCC 63.4 23
Peptide2 TCTATAGAAAAACGGGTGGGA TCAAGTCTCGTTTTGTTTTAATTGA 60.4 44
Peptide3 CTTTGTCAATAGTTGCTAACATGCT TATATGCAGATCCACACGCA 60.5 44
Peptide5 ATATGCTTATCAGTATCAGCCCA AGGTGATACTCACAAAATATCATCAA 59.6 39
Peptide6 ACTGACAAATCTGACTTGGCTT TTGAACCATAAATTCGGTCAA 60.0 39
Peptide12 TTACTGCCAGCATTATCAGAAGA TGACACGTGTAATTCTTCTTTTTGT 60.8 44

象素化做柱状图: 采用胶浓度为 2.0%的 agarose
胶分离 PCR产物, 利用 Bio1D软件对 Vilber lourmat
凝胶成像系统收集目的条带, 进行亮度总象素转换;
将目标基因的不同时间点 PCR 产物分别与其对应
Actin2相除, 获得该处理组某时间点 mRNA相对表达
量, 并制作对应样品的 mRNA相对表达量柱状图。
2 结果与分析
2.1 Peptide5和 Peptide6为组成型表达
正常条件生长的野生型拟南芥(Col.), 分别在
其营养生长期(3 d、2 w和 3 w)和生殖生长期(5 w)
的不同器官(根、莲座叶、茎生叶、花分生组织和
花)进行取材, 获得 Peptide5和 Peptide6相应的表
达谱。Peptide5和 Peptide6在营养生长期的第 3 d、
2 w和 3 w, 以及生殖生长期(5 w)的根、莲座叶、茎
生叶、花分生组织和花器官都有表达(图 1); 尽管在
2 w时, Peptide5表达很弱, 但仍有明显可见的扩增
条带。随着发育的进行(3 d→5 w), Peptide5和 Peptide6
的表达总体呈现上升的趋势, 并在花分生组织和花器
官中表达最高。基于 Peptide5和 Peptide6在不同的发
育期和不同的器官均有表达的结果, 认为 Peptide5 和
Peptide6基因的表达模式为组成型表达。
2.2 Peptide5和 Peptide6对 NaCl和 PEG的响应
PEG4000(10%)采用根灌, NaCl(300 mmol/L)采
用活体原位全株喷施 , 分别处理野生型拟南芥 (3
w)1 h、6 h和 24 h; PCR扩增对应的总 RNA反转录
产物, 获得 Peptide5 和 Peptide6 对 NaCl 和 PEG 响
应的表达谱。对于 NaCl的响应, Peptide5在“1 h”
上升至最高, 随后相对表达量维持在较对照为 2 倍
的水平; Peptide6同样在“1 h”上升到最高的相对表
达水平, 随后降至对照的一半水平, 到“24 h”达到
近最高表达水平的状态(图 2, A)。对于 PEG的响应,
Peptide5 和 Peptide6 均受 PEG 强烈诱导, 相对表达
量最高的均为对照的 4 倍左右, 变化趋势基本一致;
只是 Peptide5的相对最高表达量出现在“6 h”, 而
Peptide6出现在“1 h”(图 2, A)。


图 1 Peptide5 和 Peptide6 在不同发育期和组织的表达谱
R: 根; RL: 莲座叶; CL: 茎生叶; FM: 花分生组织; F: 花。图中“S”
表示循环数, 下同。
Fig. 1 Expression profile of Petide5 and Peptide6 at differ-
ent developmental stages and tissues
R: Root; RL: Rosette leaf; CL: Cauline leaf; FM: Floral meristems;
F: Flower. “S” means cycles and same meaning for the following
figures.

2.3 Peptide5和 Peptide6对 MeJA和 SA的响应
水杨酸 (SA, 2 mmol/L)、茉莉酸甲酯 (MeJA,
100 µmol/L)采用活体原位全株喷施, 分别处理野生
型拟南芥(3 w)1 h、6 h和 24 h; PCR扩增对应的总
RNA反转录产物, 获得 Peptide5和 Peptide6对 SA和
MeJA响应的表达谱。响应茉莉酸甲酯处理, Peptide5
和 Peptide6 的相对表达量呈上升的趋势 , 分别在
“1 h”和“6 h”达到峰值, 并同时在“24 h”降低。
但当 Peptide5 仍维持较对照 2 倍多的表达水平时,

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Peptide6 的表达量已较对照下降了 30%左右(图 2,
B)。在响应水杨酸时, Peptide5和 Peptide6首先出现
降低的趋势, 均在“1 h”的表达量较对照降低了 1
倍左右; 并在“6 h”显著升高, 表达量分别为对照
的 2倍多和近 3倍; 在出现峰值后的“24 h”, Peptide5
相对对照表达量虽有所下降, 但仍维持在 2 倍的水
平, 而 Peptide6此时基本无表达(图 2, B)。
2.4 Peptide5和 Peptide6对机械损伤和冷害的响应
机械损伤(Scissor)采用灭菌小剪刀 , 对叶面进
行不伤主叶脉的模拟机械损伤; 冷害在 4℃环境中
进行。两处理分别在 1 h、6 h和 24 h取材, 总 RNA
经反转录后进行 PCR, 获得 Peptide5 和 Peptide6 对
机械损伤和冷害响应的表达谱。模拟机械损伤诱导
Peptide5 和 Peptide6 持续增加表达量, 高峰值均出
现在“6 h”; 随后 2者在“24 h”出现不同程度的
降低, 但仍维持在相对对照 2倍的水平(图 2, C)。冷
害诱导 Peptide5持续增强表达, 并在“24 h”达到峰
值, 相对表达量为对照的近 3倍; Peptide6在“6 h”
前持续降低, 并在“24 h”突然增加, 相对表达量为
“6 h”的 2倍多, 并高出对照 40%左右。




图 2 Peptide5 和 Peptide6 对 6 种逆境因子响应的表达谱
A: Peptide5和 Peptide6对 NaCl和 PEG响应的表达谱; B: Peptide5和 Peptide6对 MeJA和 SA响应的表达谱; C: Peptide5和 Peptide6对机械损
伤(Scissor)和冷害(Cold)响应的表达谱。
Fig. 2 Expression profile of Petide5 and Peptide6 in response to 6 stress factors
A: Expression profile of Petide5 and Peptide6 in response to NaCl and PEG treatments; B: Expression profile of Petide5 and Peptide6 in
response to MeJA and SA treatments; C: Expression profile of Petide5 and Peptide6 in response to wound and cold treatments.

第 12期 蒋细兵等: 拟南芥 Peptide5和 Peptide6的表达谱分析 1619


2.5 Peptide5启动子序列分析
基于对 CLE40、CLE19和 CLV3的启动子进行顺
式元件分析, 认为顺式作用元件 WUSATAg(TTAATG
G)[11]对 CLV3功能具有重要的作用[12]。对 Peptide5上
溯 1.5 kb 碱基序列, 分析该基因的启动子顺式作用元
件发现, 在 Peptide5 启动子序列具有 1 个 WUSA-
TAg(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html);
同时包含 1个XYLAT(ACAAAGAA), 该顺式作用元
件参与了拟南芥次生木质部形成 [13](图 3); 另外普
遍存在着大量的WRKY蛋白识别的W-box以及与发
育相关蛋白识别的元件。
3 讨 论
对 5 个预测性多肽进行了 RT-PCR 水平的验证,
除了 Peptide5 和 Peptide6 有表达且丰度很低外, 其
他 3 个均未检测到信号, 可能由于丰度极低或者并
没有表达的缘故。低丰度表达可能意味着, 其分子
生物学功能, 可能类似于系统素通过激活周边维管
组织的茉莉酸合成实现系统性防御反应的作用方式,
是通过影响特定基因的转录水平或蛋白积累实现
的。Peptide5 和 Peptide6 在植物的不同发育期和生殖
生长期的不同组织的 RT-PCR表达谱显示, 2个组成型
基因可能直接或间接地参与环境因子的响应过程。
Peptide5和 Peptide6在“1 h”, 对 NaCl和 PEG
的响应表达谱的变化趋势一致, 均呈上升态势; 该
结果显示盐害早期首先表现为对水势变化的响应,
随后凸现盐离子效应, 这也得到相关文献结果的支
持[14]。对 NaCl和冷害的响应中, Peptide5的表达量
变化情况都是较对照明显地增强, 暗示 Peptide5 在
这 2 种逆境中的响应功能类似。另外, Peptide5 和
Peptide6对MeJA和 SA响应中, 相对响应MeJA 的
先升高后回落的变化趋势, 在响应水杨酸(SA)时 ,



图 3 Peptide5 启动子序列
框内示 TATA box和起始密码子, 并令起始密码子的 A为“+1”; CAAT box 加下划线; 顺式作用元件 WUSATAg用阴影表示, XYLAT以下划
线加阴影表示。
Fig. 3 DNA sequences of Peptide5 promoter
TATA box and initiation codon are framed, and A of the initiation codon is “+1”. Cis-acting element of WUSATAg and XYLAT are both in
gray blackground. XYLAT is underlined.

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呈现出先降低后显著升高再回落的变化态势; 该
结果与普遍认为的“茉莉酸防御途径和水杨酸防
御途径拮抗”的观点基本吻合[15]。而 Peptide5和
Peptide6对 MeJA和机械损伤的响应中, MeJA与
机械损伤表达谱的变化趋势基本一致。启动子序
列分析结果预示着, 拟南芥 Peptide5 可能参与了
次生木质部的形成 ;而拟南芥是研究木质形成
(wood formation)的模式植物之一 [16], 这将为
Peptide5功能研究指明了一个方向。
尽管在 mRNA水平证实了 2个预测性多肽基因
为组成型表达基因, 并获得了包括植物激素和环境
因子在内的 6 个处理的表达谱; 但对其在不同处理
中牵涉的信号途径和发挥的功能以及如何行使该功
能, 仍需通过转基因植株进行大量的研究进行验证
与阐述。
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