全 文 ：第 7 卷　第 1期
2003年 3 月
生命科学研究
Life Science Research
Vol.7　No.1
Mar.2003
拟南芥紫色酸性磷酸酶基因(AtPAPs)
对磷饥饿的响应
李东屏1 ,王道文2
(1.湖南师范大学 生命科学学院 , 中国湖南 长沙　410081;2.中国科学院遗传与发育生物学研究所 ,中国北京　100101)
摘　要:根据拟南芥基因组测序所获得的信息 , 对拟南芥 2 号染色体上 7个可能的紫色酸性磷酸酶基因进行
了 cDNA克隆 、测序及生物信息学分析 ,并对其在磷饥饿状态下转录水平的表达模式进行了研究 , 发现大部分
的 AtPAPs都是组成性表达的 ,只有 AtPAP9 , AtPAP10 是诱导表达的 ,其中 AtPAP9 的转录产物是磷饥饿重新诱
导的 ,而 AtPAP10 是磷饥饿诱导增加的.
关键词:拟南芥;紫色酸性磷酸酶;磷饥饿
中图分类号:Q945.78　　　　　　　　　文献标识码:A 文章编号:1007-7847(2003)01-0065-05
Responses of Putative Purple Acid Phosphatase Genes
in Arabidopsis thaliana (AtPAPs)to Phosphorus Starvation
LI Dong-ping1 ,WANG Dao-wen2
(1.Life Science College of Hunan Normal University , Changsha 410081 , Hunan , China;
2.Institute of Genetics and Developmental Biology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101 , China)
Abstract:Seven putative PAP cDNAs on chromosome 2 of Arabidopsis thaliana have been amplified and cloned by
means of RT-PCR and oligonucleotide primers designed according to the sequence information produced by AGI.
Suspension cell culture of Arabidopsis was established and applied to study the transcription patterns of the PAP
genes under the condition of phosphorus starvation.The results showed that most of the PAP genes were expressed
constitutively.The transcription of two of them were induced upon phosphate starvation.
Key words:Arabidopsis thaliana;purple acid phosphatase (PAP);phosphorus starvation
(Life Science Research ,2003 ,7(1):065 ～ 069)
　　紫色酸性磷酸酶是一类金属水解酶 ,它能催
化磷酸酯或酸酐的水解而生成无机磷酸根
(Pi)[ 1] .目前 ,已在几种植物中发现缺磷能诱导紫
色酸性磷酸酶基因的转录或者诱导 PAP 蛋白分
泌到胞外 ,显示 PAPs可能在植物磷营养中起重要
的作用[ 2 ～ 4] .拟南芥具有基因组小 、生活史短 、培
育简单 、转化高效 、并易于筛选突变株系用于功能
分析等优点 ,因此被作为模式植物进行研究.拟南
芥测序计划(AGI)的完成为拟南芥的研究提供了
更详尽的背景资料.在拟南芥中共有28个可能的
紫色酸性磷酸酶基因(AtPAP 1 ～ AtPAP28)[ 5] .本
文报道了拟南芥2号染色体上 7个可能的紫色酸
性磷酸酶基因的克隆以及它们对磷饥饿响应的
结果.
1　材料与方法
1.1　引物的设计
根据拟南芥测序所得结果 ,对第二条染色体
收稿日期:2002-12-29;修回日期:2003-02-21
作者简介:李东屏(1966-),男 ,湖南安乡人 ,湖南师范大学讲师 ,博士 ,主要从事植物分子遗传学研究 , E-mail:dongping_lee@hotmail.
com;王道文(1965-),男 ,河南信阳人 ,中国科学院遗传与发育研究所研究员 ,博士生导师
上的 7个PAP 基因设计引物如下:
AtPAP7FP (5′CGACCATGTTCTTCTTA TGGATCT 3′);　AtPAP7RP (5′GGTTCAGGTATTATGCCCATGCCT 3′);
AtPAP8FP (5′C TCCAAAGTCTCTCAATGGATAGC 3′);AtPAP8RP (5′GTCTGACCATCGATTAGATATCGG 3′);
AtPAP9FP (5′ACGTCGACTTTTTGACTAACCACCAT 3′);AtPAP9RP (5′GGTCGACAAATCTGTGTGGCAAAC 3′);
AtPAP10FP(5′TCAGGATCCAAAAATGGGTCGTG 3′); AtPAP10RP(5′TCCGG TACCTCATAGATTCTCAAG 3′);
AtPAP11FP(5′AACCATATG GAGTTGAGTCAC 3′); AtPAP11RP(5′ACTGGATCCTAAGCAGTCTCCTCC 3′);
AtPAP12FP(5′GCAGGATCCTCGTCTCGGATTCAG 3′);AtPAP12RP(5′CCAGGTACCACAGTCACTAACTGA 3′);
AtPAP13FP(5′CTTCTTCGCTGCAACAAAACATT 3′); AtPAP13RP(5′CTACTTGGTTTAGTTGCAAACCGA 3′).
1.2　RT-PCR及 cDNA克隆
用 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)从拟南芥幼
苗中提取总 RNA ,然后用Gibco公司的 RT 反转录
出 cDNA , ExTaq 酶系(TaKaRa)进行 PCR ,连接到
pGEM-Teasy 载体(Promega)上 ,再进行测序 、分析.
1.3　AtPAP基因转录水平表达模式的研究
1.3.1　拟南芥愈伤组织及悬浮细胞系的建立 、继
代及磷饥饿处理
按Hu(2000)[ 6] 的方法进行.细胞低磷处理时
KH2PO4的浓度由 2mmol L降至10μmol L ,第 0 、1 、
3 、5 d分别收集细胞 ,提取 RNA.
1.3.2　AtPAP 基因转录产物的半定量 RT-PCR
分析
按文献[ 7]的方法进行.将所提的 RNA 样品
定量 ,每样取 10μg 量作反转 ,合成单链 cDNAs.用
组成型的维管蛋白基因引物(UniTuF:5′GAGG-
GACTATGGCCGTTTAG 3′;UniTuR:5′CACTTCAC-
CCGACCATTCAATGG 3′)进行 PCR 扩增 , 比较
PCR不同的循环数(20 、24 、28 、32)时各样品之间
转录水平的差异.同时 ,以一已知受磷饥饿诱导的
紫色酸性磷酸酶基因 AtPAP 17[ 4] (FP:5′CCTC-
CAGGTACCTTTCATCGATC 3′;RP:5′TAAGCAG-
GAAGGGTACCTAGCCT 3′)作对照 ,以确定系统的
可靠性.再以 AtPAPs引物进行 RT-PCR扩增 ,以比
较低磷处理不同时间内 , AtPAPs 转录水平的
高低.
2　结果与分析
2.1　二号染色体上 AtPAP 基因的 cDNA克隆和
序列分析
在对拟南芥2号染色体上的 7个 AtPAP 基因
进行克隆 、测序后 , 所得结果已登陆到 GenBank
中 ,其序列号及基因大小如表 1所示.从测序的结
果来看 , AtPAP9-AtPAP13的编码区核苷酸的序列
及推导的氨基酸序列与拟南芥基因组测序中 AGI
预测的结果一致 , 其中 , AtPAP12 与前人的报道
(Cheuk ,序列号:AY065067)有一个碱基和一个氨
基酸的差异 , 这可能是 PCR或测序的误差引起
的.但 AtPAP7和 AtPAP8的编码区序列和推导出
的氨基酸序列与 AGI 预测的结果有很大的不同
(数据略),这是由于预测的内含子剪切位置的误
差引起的 ,这也显示基因组测序不能完全替代常
规的基因克隆和测序工作.而且 , AtPAP8的编码
序列与 Yamada(序列号:AY065434)和 Schenk (基
因名:SmAth ;序列号:AF200827)的测序结果各不
尽一致.尤以 Schenk[ 8] 的 SmAth 差异最大 ,其前
780个碱基序列与我们的结果一致 ,但 3′端的序
列包含了很多的碱基缺失和插入.
表 1　克隆的 AtPAPs的大小及登陆到 GenBank里的序列号
Table 1　cDNA cloning of AtPAPs and their accession number in GenBank
基因名
Name of genes
编码区核 苷酸数目
Number of the coding
region nucleotides
推导的氨基酸残基数
Number of the deduced amino
acid residues
基因序列号
Accession number in GenBank
AtPAP7 987 328 AF492659
AtPAP8 1008 335 AF492660
AtPAP9 1956 651 AF492661
AtPAP10 1407 468 AF492662
AtPAP11 1326 441 AF492663
AtPAP12 1410 469 AF492664
AtPAP13 1551 516 AF492665
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　　另外 ,我们还在 AtPAP10 和 AtPAP13中发现
和证实了剪切变异体(数据略.序列号:AY090893 ,
AY090894),显示它们可能编码不止一个蛋白.
2.2　AtPAP与其它真核生物 PAP序列比较
PAP 是一种金属水解酶 ,在人 、动物 、植物 、真
菌等真核生物中都有发现.在蛋白质的一级结构
上 ,它们具有相同的与两个金属离子结合的保守
序列(图 1).对 AtPAP7-13与其它种的系统树比较
分析显示 ,AtPAPs可以分为高分子量和低分子量
PAP 两大类(图 2),其中AtPAP7和AtPAP8与动物
的PAPs为低分子量 PAPs;而 AtPAP9-13 与真菌
的PAPs属高分子量 PAPs类.
图 1　低分子量类群几个 PAPs 蛋白一级结构的比较
5个方框内为 PAP的保守基序(XDXG;GDXXY;GNHX;VXXH;GHXH), 7 个＊代表与两个金属离子结合的氨基酸.
Fig.1　Comparation of the deduced amino acid sequences of several LMW-PAPs
The boxed sequences are conserved motifs(XDXG;GDXXY;GNHX;VXXH;GHXH).The asterisks below represent the metal-ligating
residues.
图 2　AtPAP7-AtPAP13 与其它真核生物 PAP 的系统树比较
GenBank中序列号分别为:AF200824 (Gma);AF236108(Gma-LMW);S51031(Pvu);AF236109(Pvu-LMW);P13686(Hsa);
Q05117 (Mmu);P09889 (SSc);U18554(Afi)U18553(Ani).
Fig.2　Phylogenetic tree of AtPAP7-AtPAP13 to other eukaryotic PAPs
Accession number of the genes in GenBank:AF200824 (Gma);AF236108 (Gma-LMW);S51031(Pvu);AF236109(Pvu-LMW);
P13686(Hsa);Q05117(Mmu);P09889(SSc);U18554(Afi)U18553(Ani).
67第 1期　　　　　　　　李东屏等:拟南芥紫色酸性磷酸酶基因(AtPAPs)对磷饥饿的响应　　　　　　　　　
2.3　磷胁迫条件下 AtPAP 基因在转录水平的表
达模式
2.3.1　低磷胁迫对微管蛋白基因 UniTu 和 At-
PAP17在转录水平上表达的影响
由图 3可以看出 ,微管蛋白基因在 RT-PCR
同一循环数不同处理时间时所扩增的 cDNA产物
相当 ,表明 UniTu 在磷饥饿的情况下确实是组成
型表达的.同时 , AtPAP17的半定量 PCR结果也显
示它受磷饥饿的诱导 ,与前人的研究结果一致 ,这
从一方面说明以半定量 PCR的方法来研究基因
转录水平的变化趋势是可靠的;另一方面也表明
该磷饥饿处理对相关基因的影响是有效的.
图3　UniTu 和 AtPAP17 在低磷处理不同天数及 RT-
PCR不同循环数的扩增效果
P+ 、P-表示含磷与低磷培养基处理悬浮细胞;0 、1 、3 、5
表示悬浮细胞在含磷或低磷培养基处理的天数;20、
24、28 、32表示 RT-PCR时不同的循环数.
Fig.3　The expression pattern of UniTu and AtPAP17 as
the control under Pi starvation by semiquantitative PCR
P+ and P- represent the samples taken from phosphate suffi-
cient and phosphate deficient suspension cultures respectively.
The samples were taken at the time point of 0 , 1 , 3 , 5 days.
RT-PCR assay were conducted with 20 , 24 , 28 and 32 cycles
separately.
2.3.2　磷饥饿对拟南芥 AtPAPs在转录水平表达
的影响
从图 4 可以看出 ,在克隆的 7个 AtPAPs 中 ,
大多数是组成型表达的 ,只有 2个 AtPAPs是低磷
诱导表达的.其中 , AtPAP 11 是强诱导型的.在 Pi
正常情况下 ,细胞中没有 AtPAP11的转录产物 ,当
磷饥饿1 d后 ,有少量转录产物出现 ,3 d以后 ,转
录产物被大量诱导表达.AtPAP 12 是磷饥饿诱导
增强型 ,即在 Pi正常情况下 ,细胞中就有少量基
因转录产物存在 ,当细胞处于磷饥饿状态时 ,其转
录产物明显增加.
图 4　磷饥饿处理后 AtPAPs的 RT-PCR结果比较
P+ 、P-表示含磷与低磷培养基处理悬浮细胞;0 、1 、3 、5
表示悬浮细胞在含磷或低磷培养基处理的天数.
Fig.4　Semiquantitative PCR results of AtPAPs after the
treatment of Pi starvation
P+ and P- represent the samples taken from phosphate suffi-
cient and phosphate deficient suspension cultures respectively.
The samples were taken at the time point of 0 , 1 , 3 , 5 days.
3　讨论
PAP 在动植物中都存在 ,其作用现在还不很
明了.在动物中 , PAP 为约 35 kD左右的单体 ,属
低分子量 PAP 类群 ,与其结合的两个金属离子为
Fe
3+-Fe2+[ 9] .在哺乳动物体中 , PAP 与铁转运 、
骨的重吸收等功能有关[ 10] .在植物中 ,已有的研
究表明 ,PAP 为约 55 kD的同源二聚体 ,属高分子
量PAP 类群 ,与其结合的金属离子为 Fe3+-Zn2+
或Fe3+-Mn2+[ 11] ,体外的生化酶催化分析表明 ,
它们能水解多种含磷底物 ,但不同 PAP 对含磷底
物的作用有选择性.拟南芥上 2 号染色体上存在
的7个 PAPs 中含有两种类型的 PAPs ,与其结合
的金属离子也可能会多种多样.如 AtPAP7和 At-
PAP8蛋白分子量约 35 kD ,与其结合的金属离子
就有可能为 Fe3+-Fe2+ ,其功能也可能不仅是与
磷代谢有关.AtPAP9-AtPAP13属高分子量 PAP 类
群 ,其功能可能与磷代谢密切相关.AtPAP11 和
AtPAP12受体外低磷胁迫的调节 ,很可能它们如
AtPAP17一样 ,是分泌性的蛋白 ,在植物缺磷时它
们能大量表达并分泌到根际土壤中 ,降解土壤中
的含磷底物 ,起应急的作用;而 AtPAP9 、AtPAP10
和AtPAP13是组成型表达的酶 ,它们可能在细胞
内分解储存的或需要重新利用的含磷有机物 ,参
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与细胞内磷稳态的日常维持 ,而且对含磷底物有
选择特异性.如 AtPAP13 与从大豆分离到的植酸
酶GmPhy 有较高序列同源性.该植酸酶基因在大
豆萌发后幼苗的子叶中特异的表达 ,分解储存在
子叶中的植素 ,为幼苗的生长发育提供磷源[ 12] ,
我们推测AtPAP13很可能是拟南芥用来分解利用
植素的酶.我们正在用昆虫表达系统表达出的蛋
白进行体外催化活性分析 ,以初步确定它们利用
含磷底物的特异性.当然 ,对它们在植物体内生理
功能的确定还有赖于用基因Knock-out 、RNAi等技
术筛选突变体和转基因植物后进行的功能分析.
用半定量 RT-PCR方法鉴定基因在转录水平
的表达趋势 ,近几年得到较广泛运用[ 7 ,13 , 14] .该法
虽然不能体现基因在细胞内的 mRNA的真实水
平 ,但在时间或空间表达上还是能体现一个变化
趋势的.在我们克隆到的 7个 AtPAP 中 ,有 2个基
因是与磷饥饿应答紧密相关的 ,它们在植物缺磷
时能起重要作用 ,对它们功能及其相关的信号传
导过程正在研究当中.
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