全 文 ：生物物理学报 第二十四卷 第五期 二八年十月
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.24 No.5 Oct. 2008
收稿日期：2007-10-18
基金项目：国家自然科学基金 （30370087）和国家基础科学人才
培养基金 （J0630644）
通讯作者：王崇英，电话：(0931)8914155，传真：(0931)8912561，
E-mail：wangcy@lzu.edu.cn
0 引 言
蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，从整体蛋
白质水平上，在一个更加深入、更加贴近生命本质
的层次上探索和发现生命活动的规律和重要生理、
病理现象。蛋白质双向电泳 （two-dimensional
elecrophoresis， 2-DE）、 生 物 质 谱 （mass
spectrometry，MS）和生物信息学 （bioinformatics）
是蛋白质组学的三种最重要的核心技术[1]。蛋白质
组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，将
生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立
蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋
白质组学，这样更符合蛋白质组学的本质。另一种
策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质
组成的变化，主要目标是研究差异蛋白质及其功
能，如不同生理状态下植物的差异蛋白质，研究差
异蛋白质及其编码基因的功能[2]。
实验条件下的热激反应为基因翻译和翻译后水
平的研究提供了诸多有用的信息。植物体暴露在高
温条件下将引起基因表达迅速而剧烈的变化，包括
正在进行的基因转录的终止和新基因转录的起始，
以及一些正常 mRNAs 的翻译减少。通常的情况
是，大多数基因关闭或者减弱，并且一些称作热激
（heat shock，HS）的特异基因，被迅速诱导到一
个高水平[3,4]。HS基因编码的蛋白使细胞通过两种
策略在有害的高温条件下存活：一类热激蛋白
(heat shock proteins，HSPs) 作为分子伴侣防止蛋
白变性和聚合，其它的 HSPs (包括泛素和特定的
蛋白激酶) 负责非天然蛋白的降解。热激反应本质
上是瞬时的，在热激处理 35 min 后就可以检测到
热激蛋白 mRNA量的增加及新合成的热激蛋白的
出现，并且在开始 1到 2小时后达到最高峰。
本实验室利用 T-DNA 插入诱变技术获得了
600 多个拟南芥启动子诱捕系 （promoter trap
lines），分离到一个多效突变体，其最显著的特征
是生长发育迟缓、营养生长阶段延长、叶片等器官
体积减小、植株矮化、抗逆性降低。我们用
TAIL-PCR对突变体的相关基因进行了克隆，通过
核苷酸序列比对分析发现，该基因为热激蛋白相关
基因，命名为 Athspr (heat shock protein-related in
Arabidopsis thaliana)。随后，我们对该突变体进行
了遗传学分析，突变体与野生型的杂交子一代表现
为野生型，而 F2群体中野生型性状和突变体性状
的植株分离比例为 3∶1，说明该突变体为隐性单
热激条件下拟南芥 Athspr突变体叶片蛋白的表达分析
胡 喆， 吴庆丰， 李 萍， 孙英莉， 许声涛， 王新宇， 王崇英
（兰州大学生命科学学院细胞生物学研究所，兰州 730000）
摘要：以拟南芥野生型和突变体 Athspr为材料，采用双向电泳技术对其在 0 h（对照）、2 h 及 8 h 热激条件
下的叶片全蛋白进行了分离。应用 ImageMaster软件从以上蛋白电泳图谱中分别鉴定出 1000多个蛋白点，发现其
蛋白表达谱在野生型和突变体中存在明显差异。同时选取在野生型和突变体中表达明显有差异的 3个高丰度蛋白
质点进行了质谱鉴定，并进一步通过 GPS-MASCOT进行了数据库检索，鉴定出这三个蛋白质组分分别为富含甘
氨酸的 RNA 结合蛋白 7、细胞色素 b6-f复合物铁硫亚单位及放氧增强蛋白 1-2。以上 3个蛋白均与植株在胁迫条
件下的抗性有关。推测由于 T-DNA 的插入使得突变体中 Athspr基因的功能受到了影响，进而影响了其下游其他
基因的表达和上述 3种蛋白的表达与功能，产生了突变体的耐热能力以及其他逆境条件下抗逆性下降的一系列表
型改变。
关键词：拟南芥；Athspr突变体；热激；双向电泳；质谱分析
中图分类号：Q942.6
2008年生 物 物 理 学 报
基因突变体[5]。当在 30℃轻微热胁迫下培养时，发
现野生型生长速度缓慢，营养生长阶段向生殖生长
阶段转变较正常条件培养下延迟 40天左右，而突
变体在培养 100天左右时仍然处于营养生长状态，
丝毫没有抽苔的迹象，植株矮小短簇，叶片丛生，
其生殖生长受到严重抑制。RT-PCR反应显示，在
正常生长条件及 38℃热激胁迫处理条件下生长的
野生型和突变体中该基因的表达在转录水平上并无
明显差异。为了进一步研究该突变体与野生型在蛋
白表达水平上的差异，本研究采用双向电泳技术对
野生型和突变体在 0 h （对照）、2 h及 8 h热激条
件下的叶片全蛋白进行了分离，以野生型为对照，
分析了突变体在不同热激条件下叶片蛋白谱的表达
变化，初步鉴定了 3个在野生型和突变体中表达差
异显著的蛋白点，并讨论了他们的功能。
1 材料和方法
1.1 植物材料和生长条件
拟 南 芥 （Arabidopsis thaliana） 野 生 型
（ecotype C24）和通过 T-DNA 介导的启动子诱捕
技术获得的突变体 Athspr，在 22℃、冷光照明
（强度为 120 uE/m2·sec、光周期为 16 h 光照 /8 h
黑暗）和 50%相对湿度的生长条件下培养。30日
龄的拟南芥材料在人工气候培养箱中 38℃热激处
理 2 h及 8 h 后取叶片为材料，以未经任何热激处
理 （即 0 h 热激）的材料作为对照。
1.2 TCA-丙酮沉淀法制备蛋白样品
取拟南芥叶片 300 mg ，液氮研磨，加 30 mg
水不溶性 PVP，悬浮于 900 μl TCA- 丙酮液 (含
0.07% β-巯基乙醇) 中，－20℃沉淀蛋白质 1 h 或
过夜，离心 （13000 r/min，4℃，15 min）， 去上
清，沉淀用 80%、100%冷丙酮各洗 1 次，－20℃
放置，挥发丙酮后获得蛋白质干粉，小量分装，冻
存于－80℃。
1.3 双向电泳 （2-DE）
1.3.1 第一向固相化 pH 梯度等电聚焦电泳 (IPG
IEF)
本 实 验 主 要 参 照 文 献 [6,7] 和 Amersham
Pharmacia Biotech 双向电泳操作指南进行，并对
裂解液和等电聚焦程序做了适当改进。将样品按
1∶10 (w/v) 溶于样品裂解液 〔7 mol/L 尿素，
2 mol/L硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L Tris-base，
2% IPG 缓冲液 (pH 4~7)，65 mmol/L DTT〕中，
并进行蛋白质定量，再与水化液 〔8 mol/L尿素，
2% CHAPS，0.5% TritonX-100，0.002%溴酚蓝，
0.5% IPG 缓冲液 （pH 4~7），18 mmol/L DTT〕
按一定比例混合，使其中所含蛋白质的量符合上样
要求。将 60 μg 蛋白质样品加入持胶槽，编制
IPGPhor 等电聚焦程序，进行溶胀和等电聚焦电
泳，溶胀和等电聚焦在 20℃下自动进行。
1.3.2 第二向 SDS-PAGE 垂直板电泳
将聚焦好的胶条取出放入加有 DTT 的平衡
液Ⅰ，摇床上振荡 15 min，弃去平衡液Ⅰ，加入
含有 IAA 的平衡液Ⅱ进行第二步平衡，平衡
15 min，用湿润的滤纸吸去胶条多余的平衡液。已
平衡好的 IPG 胶条放置于二向凝胶 (12.5%) 的顶
端，排除气泡，加入分子质量标准蛋白，用封胶琼
脂糖封固胶条后电泳，先以 10 mA 电泳 30 min，
使蛋白质从 IPG 胶条中泳出，然后 30 mA 电泳
5 h 左右，至溴酚蓝前沿到达胶板底部 1 cm时停
止电泳。
1.4 凝胶图像获取及分析
采用考马斯亮蓝和银染[8,9]联合使用的染色法进
行染色。银染时不再经过固定步骤且在敏化时不加
戊二醛。胶板取下后立即置于考马斯亮蓝染色液中
固定和染色，然后在脱色液中脱色至几乎无底色，
考染后的胶板由于蛋白质已经被固定，可直接进入
银染的敏化，然后经过染色、显色和终止，每一步
骤后都要用去离子水漂洗。使用 LabScan 控制的
ImageScanner 扫描凝胶图像，以 ImageMaster 2D
Platinum Version 5.0 分析双向电泳图谱，先对原
始图像进行一系列处理，如凝胶图像格式转换、凝
胶图像修剪，去除水平和竖直条纹，去除背景噪
音，进行灰度值设定等，再进行蛋白点的鉴定、匹
配、编辑、数据分析和输出。
1.5 蛋白点的切取和胶内酶切
初步选取了在野生型和突变体中表达强度明显
有差异的 3个高丰度蛋白质点从胶上切下，斑点用
50%乙腈和 50 mmol/L碳酸氢铵脱色 20 min，移去
其中的溶液，重复两次。用 100%乙腈干胶
10 min，再移去其中的乙腈，然后用真空冷冻干燥
机使胶粒完全干燥。干胶粒用 12.5 ng/μL 的
Trypsin 溶液 37℃过夜酶解。完成酶解的胶粒中加
入 50%乙腈和 0.1% TFA 60 μl，抽提酶解肽段
30～40 min，重复 2～3次。吸取上清液，置于另
一离心管中。肽段提取重复三次并合并上清液。将
肽段溶液在 N2中吹干浓缩，备用于质谱鉴定。
362
第 5期 热激条件下拟南芥 Athspr突变体叶片蛋白的表达分析
Fig.1 Two-dimensional electrophoresis images of wild type
and mutant Athspr. (A), (C) and (E): Two-dimensional
electrophoresis images of leaf proteins from Arabidopsis
wild type subjected to heat shock for 0, 2 and 8 h; (B),
(D) and (F): Two-dimensional electrophoresis images of
leaf proteins from Arabidopsis mutant subjected to heat
shock for 0, 2 and 8 h
(A) (B)
(C) (D)
(F)
4 5 6 7pH
Mr
kDa
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
14.1
14.4
Table 1 Analysis of protein spots
Map No. Gel Name Class Group Spots
A Wild type CK CK REF 1272
B Athspr CK CK 1 1224
C Wild type 2h-HS Treat 1 1338
D Athspr 2h-HS Treat 1 1111
E Wild type 8h-HS Treat 1 1308
F Athspr 8h-HS Treat 1 1169
1.6 质谱分析及数据库检索
样品用 4700 串联飞行时间质谱仪 〔4700
Proteomics Analyzer (TOF/TOFTM) (Applied
Biosystems，USA)〕进行质谱分析，激光源为
355 nm 波长的 Nd:YAG 激光器，加速电压为
20 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采
集数据。PMF 质量扫描范围为 700～3500 Da，且
强度最大的几个峰进行串联质谱分析；图谱用
myoglobin 酶解肽段进行外标校正。所得质谱分析
结 果 进 行 GPS ( Applied Biosystems， USA)
-MASCOT (Matrix Science，London，UK) 数据库
检索。搜索参数设置：数据库为 NCBInr；检索种
属为 rattus，数据检索方式为 combined；最大允许
漏切位点为 1；采用胰蛋白酶进行消化。质量误差
范围设置：PMF 0.3 Da，MS/MS 0.4 Da；在数据
库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰都通过手工
剔除。
2 结果与分析
2.1 拟南芥叶片蛋白质双向电泳图谱分析
采用双向电泳技术分别对 0、2及 8 h热激处
理的野生型和突变体叶片蛋白质进行分离。经过染
色后，以 LabScan 控制的 ImageScanner扫描凝胶，
获得的双向电泳图像结果见图 1。
由图 1可以看出野生型和突变体叶片总蛋白的
分布模式非常相似，这些蛋白质在分子质量 14.1～
116.0 kDa 的范围内都有分布，大部分的叶片蛋白
质都集中在 pH 5～7的范围内，只有少数蛋白质点
出现在 pH 3～5的范围内。蛋白点的分辨率高，重
复性好，无论是蛋白质点的大小、外形、位置都非
常相似。
2.2 突变体与野生型叶片蛋白质表达差异分析
电泳图像 （图 1）经 ImageMaster 软件分析，
进行了蛋白点鉴定和凝胶自动匹配。根据凝胶报
告，应用 ImageMaster 软件从以上蛋白电泳图谱中
分别鉴定出了 1000 多个蛋白点，图像显示大多数
蛋白点都能得到很好的再现。在不同热激条件下野
生型中的蛋白点种类均明显多于突变体，见表 1。
在差异蛋白的分析中，通常认为表达丰度差异
超过 1.5～2倍的蛋白点是可信的[10]。因此我们选
取了差异超过 2倍的蛋白点进行了统计分析，结果
表明：与未经任何处理的对照相比较，野生型热激
2 h后表达丰度差异超过 2倍的蛋白点有 28个，其
中上行调节的有 18个点，下行调节的有 10个点，
新出现 20个点，消失 19个点；而在突变体中，与
对照相比较，热激 2 h后差异超过 2倍的蛋白点有
23个，其中上行调节的有 11个点，下行调节的有
12个点，新出现 8个点，消失 8个点。野生型在
363
2008年生 物 物 理 学 报
1 2 3 4 5
Types of changed protein spots
30
25
20
15
10
5
0
Q
ua
nt
ity
of
ch
an
ge
d
pr
ot
ei
n
sp
ot
s
Fig.2 Changes of protein expression profiles of both wild
type and Athspr under heat-shock (compared with wild type
and Athspr without heat-shock treatment). 1: Quantity of
changed protein spots; 2: Quantity of up-regulated protein
spots; 3: Quantity of down-regulated protein spots； 4:
Quantity of new emerged protein spots; 5: Quantity of
disappeared protein spots. □ : 2 h heat shock to C24;
: 2 h heat shock to Athspr; ■: 8 h heat shock to C24;
: 8 h heat shock to Athspr
热激 8 h后，与对照相比较，表达丰度差异超过 2
倍的蛋白点有 23个，其中上行调节的有 9 个点，
下行调节的有 14个点，新出现 8个点，消失 8个
点；突变体在热激 8 h后，与对照相比较，差异超
过 2 倍的蛋白点有 13个，其中上行调节的有 3个
点，下行调节的有 10个点，新出现 5个点，消失
7个点 （见图 2）。比较分析热激前后的蛋白表达谱
发现，2 h和 8 h热激处理后野生型蛋白表达谱的
变化情况均大于突变体，表明野生型可能对热激胁
迫的反应更为强烈，而突变体则比较弱，说明在热
激条件下突变体不能象野生型那样快速、有效地调
控相关基因和蛋白的表达以对抗外界有害的热环
境，因而表现出耐热性降低、生长迟缓，甚至生殖
生长停止等现象。
热激前后野生型与突变体叶片蛋白表达差异情
况分析结果表明，在 0 h热激时，突变体与野生型
相比较，表达丰度差异超过 2 倍的蛋白点有 21
个，其中上行调节的有 9个点，下行调节的有 12
个，新出现 3个点，消失 6个点；在 2 h热激时，
表达丰度差异超过 2倍的蛋白点有 31个，其中上
行调节的有 8个点，下行调节的有 23个，新出现
3个点，消失 5个点；在 8 h热激时，表达丰度差
异超过 2倍的蛋白点有 22个，其中上行调节的有
17个点，下行调节的有 5个，新出现 3个点，消
失 3个点。在正常生长条件下，与野生型相比较，
突变体中有 6种蛋白未表达，3种新的蛋白表达，
并且有较多的蛋白表达下调。同样的趋势也出现在
2 h热激处理后突变体与野生型蛋白表达谱中 (见
图 3)。以上几种未表达的蛋白可能对于维持植株
正常生长发育以及在热激条件下细胞正常功能的维
持有着重要的作用。而在 8 h热激后，与野生型相
比较，突变体有着更多的蛋白上调表达。这些蛋白
可能在缺乏上面几种在野生型中具有的热激相关蛋
白的情况下，通过某些补偿机制高量表达出来，使
细胞在长时间热激条件下能够存活。
2.3 差异蛋白点的获取
为了研究以上差异蛋白的性质及功能，我们初
步选取了在野生型和突变体中表达差异明显的 3
个高丰度蛋白质点 (见图 4、5、6) 进行质谱分析。
图 4中标号为 31206 的蛋白点仅在野生型 0 h热激
条件下有比较强烈的表达，在 2及 8 h热激后没有
表达。而在对照及热激处理后的突变体中都没有表
达，软件自动匹配时，没有对应匹配点。表明此蛋
白在突变体中的表达受到了 T-DNA 诱捕基因活性
的直接或间接的影响，此 31206点在质谱分析中编
为 1＃点。图 5中标号为 32882 的蛋白点在野生型
0 h热激条件下有强烈表达，在 2及 8 h热激后都
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第 5期 热激条件下拟南芥 Athspr突变体叶片蛋白的表达分析
Fig.4 Magnified images of protein spot 31206 of Arabidopsis wild type and
mutant. (A)～(C): Magnified images of protein spot 31206 of Arabidopsis
wild type subjected to heat shock for 0, 2 and 8 h; (D)～(F): Magnified
images of protein spot 31206 of Arabidopsis mutant subjected to heat shock
for for 0, 2 and 8 h
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
31206
155 0 h 155 2 h 155 8 h
C24 0 h C24 2 h C24 8 h
Fig.5 Magnified images of protein spot 32882 of Arabidopsis wild type and
mutant. (A)～(C): Magnified images of protein spot 32882 of Arabidopsis wild
type subjected to heat shock for 0, 2 and 8 h; (D)～(F): Magnified images of
protein spot 32882 of Arabidopsis mutant subjected to heat shock for 0, 2
and 8 h
32882
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
155 0 h 155 2 h 155 8 h
C24 0 h C24 2 h C24 8 h
没有表达。在 0和 2 h热激处理的突变体中同样没
有检测到匹配点，但是在 8 h热激后则能检测到强
烈表达，说明该蛋白可能为维持正常细胞功能所必
须，在突变体中，热激时间延长后可能通过某种补
偿机制大量表达。此 32882点在质谱分析中编为 2＃
点。图 6中标号为 32980的蛋白点在野生型 0 h热
激条件下有强烈的表达，在 2 h热激后表达量急剧
下降，并且在 8 h热激后完全没有表达。在突变体
中，0 h热激条件下有微弱表达，而在 2和 8 h热
激后都没有表达。这个蛋白同样可能因为受到
T-DNA 插入的影响而在突变体中表达下调。并且
该蛋白可能受到热激反应的负调控，此 32980点在
质谱分析中编为 3＃点。以上 3个点表达情况对比
见表 2。
365
2008年生 物 物 理 学 报
Table 3 Mass spectrometry analysis of differentially expressing protein spots
Protein name Accession No. Protein MW Protein PI Protein score
1# Glycine-rich RNA-binding protein 7
[Arabidopsis thaliana]
Gi|544424 16879.6 5.85 405
2# Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit,
chloroplast precursor [Arabidopsis thaliana]
Gi|68566234 24350.4 8.8 43
3# Oxygen-evolving enhancer protein 1-2, chloroplast
precursor (OEE1) [Arabidopsis thaliana]
Gi|11134146 34997.7 5.92 315
2.4 差异蛋白的质谱分析
对选取的 3个蛋白点进行质谱鉴定，通过基质
辅 助 激 光 解 析 离 子 化 - 飞 行 时 间 质 谱
（MALDI-TOF-TOF）得到肽质量指纹图谱，然后
在其中选择强度最大的几个峰进行串联质谱鉴定
（MS／MS）， 所 得 结 果 用 GPS （Applied
Biosystems，USA） -MASCOT （Matrix Science，
London，UK）进行数据库检索。数据库检索结果
中每个蛋白按得分列出 10个可能的结果，当蛋白
质得分大于 66时，说明该蛋白匹配上的概率是显
著的。数据库检索表明 1#、2#、3#点分别对应富含
甘 氨 酸 的 RNA 结 合 蛋 白 7 （Glycine-rich
RNA-binding protein 7，GRP7）、细胞色素 b6-f
复合物铁硫亚单位 （Cytochrome b6-f complex
iron-sulfur subunit） 及 放 氧 增 强 蛋 白 1-2
（Oxygen-evolving enhancer protein 1-2，chloroplast
precursor，OEE1），其理化性质见表 3。
Fig.6 Magnified images of protein spot 32980 of Arabidopsis wild type and mutant.
(A) ～(C): Magnified images of protein spot 32980 of Arabidopsis wild type
subjected to heat shock for 0, 2 and 8 h; (D)～(F): Magnified images of protein
spot 32980 of Arabidopsis mutant subjected to heat shock for 0, 2 and 8 h
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
32980
155 0 h 155 2 h 155 8 h
C24 0 h C24 2 h C24 8 h
Table 2 Analysis of differentially expressing protein spots
Spot 31206 Strong expression No
expression
No
expression
No
expression
No
expression
No
expression
Spot 32882 Relatively strong
expression
No
expression
No
expression
No
expression
No
expression
Strong
expression
Spot 32980 Strong expression Relatively weak
expression
Weak
expression
No
expression
No
expression
No
expression
Protein spots
0h heat-shock
Wild type Mutant
2h heat-shock
Wild type Mutant
8h heat-shock
Wild type Mutant
366
第 5期 热激条件下拟南芥 Athspr突变体叶片蛋白的表达分析
3 讨 论
热激蛋白的表达均受热激转录因子 ( heat
shock transcription factors，HSFs) 的调控。在高
温胁迫下，热激转录因子高效表达并结合于热激蛋
白启动子的热激元件 (heat shock element，HSE)
的共有序列“nGAAnnTCCn”上，从而吸引其他
转录因子形成转录复合体，促进热激蛋白的表
达 [11]。Charng 等 [12]发现在拟南芥中组成性表达
AtHsfA1a和 AtHsfA1b，对热激蛋白基因处于热激
时的早期表达是必需的，热激诱导的 AtHsfA2 是
拟南芥获得耐热性的主要调节因子。缺失 HsfA2
的拟南芥突变体在受到 37℃热激时，hsp70 和
hsp101的转录水平明显下降。在正常生长条件下，
拟南芥热激蛋白 AtHSP101在各个组织器官中几乎
检测不到，即只有微量表达，但在高温胁迫时，
AtHSP101表达量急剧增加和积累，并对高温耐受
有调节作用。当温度从 22℃上升到 45℃时，拟南
芥受热激诱导，高水平表达 AtHSP101，同时获得
耐热性增强，能够很好地适应高温胁迫 [13,14]。
Athspr编码一个新的蛋白，序列分析表明该蛋白多
个部分与 HSP101相似，为 HSP101相关蛋白。在
本研究中，未经热激处理以及热激处理后，野生型
的叶片蛋白表达种类均多于突变体，表明突变体中
T-DNA 的插入影响了 Athspr基因的活性，而该基
因编码的蛋白影响着突变体中与植株正常发育相关
的蛋白、HSP101耐热蛋白以及其他抗逆性相关蛋
白的表达和功能，从而造成突变体中蛋白表达数量
的减少或者几种关键蛋白活性的丧失，进而产生了
包括耐热力和其他抗逆性下降的一系列表型改变。
富含甘氨酸的 RNA 结合蛋白具有 C 末端的
RNA 识 别 基 序 （RNA-recognition motifs，
RRMs），以及 N末端的甘氨酸富集区域。差减法
分析表明 C末端的甘氨酸富集区域为其 RNA结合
活性所必需[15]。通常认为 GRPs在胁迫反应中具有
重要的作用，在冷、受伤、涝胁迫、植物激素处理
或者过滤性病毒感染的情况下编码 GRPs的 mRNA
含量增加。特别是在冷胁迫条件下，GRPs 的含量
迅速积累到很高的水平，并且促进植株对冷环境的
适应[16]。GRP7为 GRPs中的一种，是一个 17 kDa
的富含甘氨酸的小分子蛋白，它的氨基末端具有一
个假定的 RNA结合域，而 C- 末端由甘氨酸和丝
氨酸分支组成，并且散布着亲水基团。编码这个
GRP7的基因与胁迫诱导转录基因中的一类基因具
有相似的结构，而这个蛋白可能在胁迫条件下
RNA 的转录与修饰过程中具有重要的作用 [17～19]。
在本实验中，此蛋白在野生型对照中有强烈表达而
在突变体中没有表达，这一结果与突变体的耐热性
下降的性状是直接相关并吻合的，说明由于
T-DNA 的插入使得热激相关基因，即 Athspr的表
达受到影响，而后者则直接或间接调控 GRP7的表
达。GRP7在热激处理后的野生型中表达量急剧降
低，以至在电泳图谱中未能检测到其对应的蛋白
点，表明这个蛋白在拟南芥中除了受到冷、受伤、
涝胁迫等的正调控外，还受到热激胁迫的负调控。
细胞色素 b6-f 介导光系统Ⅱ （PSⅡ）和光系
统Ⅰ （PSⅠ）之间的电子传递。其组成成分细胞
色素 b6-f 复合物铁硫亚单位为光合自养生物所必
需的蛋白。它通过光能的热消散和提高 pH值来赋
予植株对光氧化损伤的抗性[20～25]。其在 0及 2 h热
激条件下的突变体中没有表达，而在 8 h热激后出
现强烈表达，表明该蛋白可能在热激反应中通过某
种补偿机制在突变体中高效表达。编码该蛋白的基
因可能作为热激基因的下游基因受到调控。
放氧增强蛋白 1-2为 PSⅡ放氧系统的 33 kDa
亚单位。在 PSⅡ结构和功能的研究中，放氧一直
是一个重要的研究方向，除了放氧反应以外，还因
为放氧机构易于受到环境胁迫的影响[26]。在高等植
物中，33、23和 17 kDa外周蛋白结合于 PSⅡ的囊
腔侧，对 PSⅡ放氧活力的维持起重要作用。其中
33 kDa蛋白对锰簇具有保护作用，又被称为锰稳
定 蛋 白 （manganese stabilizingnese protein，
MSP），其主要功能为维持锰簇的稳定性，而后者
为水分解反应发生的初始位点[27～29]。据此推测，当
高等植物受到环境胁迫时，OEE 1 蛋白有可能起
到维持 PSⅡ放氧活力的作用 [30,25]。比较热激前后
OEE 1的表达情况，在野生型中 OEE 1含量随着
热激时间增长而减少，并且在 8 h热激条件下没有
表达；而在突变体中同样是随着热激时间的增长其
表达量降低，这个结果表明 OEE 1同 GRP7一样
也受到热激胁迫的负调控。OEE 1在对照组野生
型中强烈表达，而在突变体中表达量降低，则表明
编码该蛋白基因同样受到了 T-DNA 插入的直接或
者间接影响，进而造成了突变体的表型改变。
以上蛋白均与不同条件下细胞的耐热性和其他
抗逆性相关，它们可能对维持细胞的功能起着重要
367
2008年生 物 物 理 学 报
的作用。本实验虽然没有鉴定出 HSP表达的变化，
但是正常和热激条件下突变体与野生型叶片蛋白表
达谱的变化以及鉴定出的 3种蛋白表达强度的明显
差异表明，T-DNA 的插入使 Athspr蛋白的表达和
功能受到了影响，进而影响了其他相关基因的表达
和功能。本实验为进一步鉴定和分析正常与热激条
件下野生型和突变体叶片全蛋白奠定了基础，同时
为 T-DNA 诱捕基因，即 Athspr基因的表达模式和
调控方式以及多效突变体产生机理的揭示提供了实
验依据。
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Müller M, Kreis M, Delseny M, Puigdomenech P, Watson
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M, Boutry M, Bancroft I, Vos P, Hoheisel J, Zimmermann
W, Wedler H, Ridley P, Langham SA, McCullagh B,
Bilham L, Robben J, Van der Schueren J, Grymonprez B,
Chuang YJ, Vandenbussche F, Braeken M, Weltjens I, Voet
M, Bastiaens I, Aert R, Defoor E, Weitzenegger T, Bothe G,
Ramsperger U, Hilbert H, Braun M, Holzer E, Brandt A,
Peters S, van Staveren M, Dirkse W, Mooijman P, Klein
Lankhorst R, Rose M, Hauf J, K觟tter P, Berneiser S,
Hempel S, Feldpausch M, Lamberth S, Van den Daele H,
De Keyser A, Buysshaert C, Gielen J, Villarroel R, De
Clercq R, Van Montagu M, Rogers J, Cronin A, Quail M,
Bray-Allen S, Clark L, Doggett J, Hall S, Kay M, Lennard
N, McLay K, Mayes R, Pettett A, Rajandream MA, Lyne
M, Benes V, Rechmann S, Borkova D, Bl觟cker H, Scharfe
M, Grimm M, L觟hnert TH, Dose S, de Haan M, Maarse A,
Sch覿fer M, Müller-Auer S, Gabel C, Fuchs M, Fartmann B,
Granderath K, Dauner D, Herzl A, Neumann S, Argiriou A,
Vitale D, Liguori R, Piravandi E, Massenet O, Quigley F,
Clabauld G, Mündlein A, Felber R, Schnabl S, Hiller R,
Schmidt W, Lecharny A, Aubourg S, Chefdor F, Cooke R,
Berger C, Montfort A, Casacuberta E, Gibbons T, Weber N,
Vandenbol M, Bargues M, Terol J, Torres A, Perez-Perez A,
Purnelle B, Bent E, Johnson S, Tacon D, Jesse T, Heijnen
L, Schwarz S, Scholler P, Heber S, Francs P, Bielke C,
368
第 5期 热激条件下拟南芥 Athspr突变体叶片蛋白的表达分析
Frishman D, Haase D, Lemcke K, Mewes HW, Stocker S,
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Habermann K, Parnell L, Dedhia N, Gnoj L, Schutz K,
Huang E, Spiegel L, Sehkon M, Murray J, Sheet P, Cordes
M, Abu-Threideh J, Stoneking T, Kalicki J, Graves T,
Harmon G, Edwards J, Latreille P, Courtney L, Cloud J,
Abbott A, Scott K, Johnson D, Minx P, Bentley D, Fulton
B, Miller N, Greco T, Kemp K, Kramer J, Fulton L, Mardis
E, Dante M, Pepin K, Hillier L, Nelson J, Spieth J, Ryan
E, Andrews S, Geisel C, Layman D, Du H, Ali J, Berghoff
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Zidanic M, Strong C, Sun H, Lamar B, Yordan C, Ma P,
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J, Saurin W, Quétier F, Sch覿fer M, Müller-Auer S, Gabel
C, Fuchs M, Benes V, Wurmbach E, Drzonek H, Erfle H,
Jordan N, Bangert S, Wiedelmann R, Kranz H, Voss H,
Holland R, Brandt P, Nyakatura G, Vezzi A, DAngelo M,
Pallavicini A, Toppo S, Simionati B, Conrad A, Hornischer
K, Kauer G, L觟hnert TH, Nordsiek G, Reichelt J, Scharfe
M, Sch?n O, Bargues M, Terol J, Climent J, Navarro P,
Collado C, Perez-Perez A, Ottenw覿lder B, Duchemin D,
Cooke R, Laudie M, Berger-Llauro C, Purnelle B, Masuy D,
de Haan M, Maarse AC, Alcaraz JP, Cottet A, Casacuberta
E, Monfort A, Argiriou A, flores M, Liguori R, Vitale D,
Mannhaupt G, Haase D, Schoof H, Rudd S, Zaccaria P,
Mewes HW, Mayer KF, Kaul S, Town CD, Koo HL, Tallon
LJ, Jenkins J, Rooney T, Rizzo M, Walts A, Utterback T,
Fujii CY, Shea TP, Creasy TH, Haas B, Maiti R, Wu D,
Peterson J, Van Aken S, Pai G, Militscher J, Sellers P, Gill
JE, Feldblyum TV, Preuss D, Lin X, Nierman WC, Salzberg
SL, White O, Venter JC, Fraser CM, Kaneko T, Nakamura
Y, Sato S, Kato T, Asamizu E, Sasamoto S, Kimura T,
Idesawa K, Kawashima K, Kishida Y, Kiyokawa C, Kohara
M, Matsumoto M, Matsuno A, Muraki A, Nakayama S,
Nakazaki N, Shinpo S, Takeuchi C, Wada T, Watanabe A,
Yamada M, Yasuda M, Tabata S. Sequence and analysis of
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369
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This work was supported by grants from The National Natural Sciences Foundation of China (30370087) and National Science Fund for
Talent Training in Basic Science (J0630644)
Received: Oct 18, 2007
Corresponding author: WANG Chong-ying, Tel：+86(931)8914155，Fax：+86(931)8912561，E-mail：wangcy@lzu.edu.cn
ANALYSIS OF PROTEIN EXPRESSION IN Arabidopsis MUTANT Athspr
LEAVES SUBJECTED TO HEAT SHOCK
HU Zhe, WU Qing-feng, LI Ping, SUN Ying-li,
XU Sheng-tao, WANG Xin-yu, WANG Chong-ying
(Institute of Cell Biology，School of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)
Abstract: Total proteins from leaves of Arabidopsis wild type and mutant Athspr, subjected to heat
shock for 0, 2 and 8 h, were isolated, using optimized methods of two-dimensional gel electrophoresis.
The maps were analyzed with solftware ImageMaster， and more than 1000 spots were detected
respectively, and exhibited obvious differences between mutant and wild type. The molecular weights of
most proteins were distributed in 14.1~116.0 kDa, and their isoelectric points were around pH 5~7. Three
abundant differentially expressed protein spots between mutant and wild type plants were cut off, digested
in gel with Trypsin, identified with MALDI-TOF-TOF-MS. Full amino acid sequences of proteins were
obtained and identified through searching database with GPS-MASCOT. One of them is Glycine-rich
RNA-binding protein 7 （GRP 7） , the other is Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit, and the
third is Oxygen-evolving enhancer protein 1-2, (OEE1). All of them were related with plant resistance to
stress, suggesting that T-DNA insertion could influence the functional activity of the gene in the mutant,
alter the expressions and functions of those three proteins, and then lead to the alterations of phenotypes
including decline of resistance to stress in the mutant.
Key Words: Arabidopsis; Athspr mutant; Heat shock; Two-dimensional electrophoresis; Mass
spectrometry analysis
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