全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2009年 10月, 31(10): 1037―1042
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2009−01−05; 修回日期: 2009−03−23
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30871325, 30600368)资助
作者简介: 喻达时(1983−), 男, 硕士。专业方向：生物化学与分子生物学
赵琼(1977−), 女, 硕士。专业方向：生物化学与分子生物学
喻达时, 赵琼同为第一作者。
通讯作者: 郭新红(1976−), 女, 博士, 教授, 研究方向: 发育分子生物学。Tel: 0731-8881565; E-mail: xinhong@hnu.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2009.01037
拟南芥 CK1A基因功能初步研究
喻达时, 赵琼, 邓克勤, 郭新红
湖南大学生命科学与技术研究院, 化学生物传感与计量学国家重点实验室, 长沙 410082
摘要: 利用 RT-PCR 方法从拟南芥中分离了 1 个 CK 基因家族成员 CK1A, 该基因的 ORF 全长 2 112 bp, 编码
一条 703 个氨基酸残基的多肽。构建了 CK1A 基因的植物表达载体 35S: GFP: CK1A, 采用基因枪法进行的洋葱
表皮细胞 GFP 瞬时表达实验表明, 荧光信号主要分布在细胞核上, 显示 CK1A 基因的产物可能在细胞核上发挥
作用。半定量 RT-PCR 分析表明: CK1A 基因在花中表达量最大, 其次是茎和根, 在叶和叶柄中表达量较弱。蓝
光使 CK1A 基因的表达升高, 12 h 时表达量明显增加, 24 h 时表达量下降。酵母双杂交结果显示 CK1A 蛋白在蓝
光下能与 CRY2 蛋白发生相互作用, 暗示 CK1A 基因可能参与拟南芥的蓝光信号传导途径。
关键词: 拟南芥; CK1A 基因; 基因克隆; 表达分析; 酵母双杂交
Preliminary studies on the function of Arabidopsis CK1A gene
YU Da-Shi, ZHAO Qiong, DENG Ke-Qin, GUO Xin-Hong
State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, Institute of Life Science and Technology, Hunan University, Changsha
410082, China
Abstract: A casein kinase 1 protein gene, CK1A, was isolated from Arabidopsis seedlings by RT-PCR method. This gene
contains an open reading frame of 2 112 bp, which encodes 703 amino acids. The plant expression vector of 35S: GFP:
CK1A was constructed by the Gateway System. The 35S: GFP: CK1A fusion protein was localized to the nucleus in onion
epidermal cell, indicating that the product of CK1A gene plays a role in the cell nucleus. The semi-quantitative RT-PCR
analysis showed that CK1A was highly expressed in flowers, stems and roots, but less in leaves and leafstalks. The yeast
two-hybrid analysis demonstrated that CK1A and CRY2 can interact in vivo under blue light, which indicates that CK1A
may play an important role in blue light signal induction of Arabidopsis.
Keywords: Arabidopsis; CK1A gene; gene cloning; expression analysis; yeast two-hybrid
蛋白质磷酸化是生物体内蛋白质功能调节的重
要方式。在细胞内, 蛋白质的磷酸化是由多种蛋白
质激酶参与, 它控制着细胞的生长、代谢和分化[1]。
酪蛋白激酶(Casein kinase, CK)是广泛存在于真核生
物的丝/苏氨酸蛋白激酶, 包括 CK1 和 CK2 两大亚
类。CK2 是一种多效的能利用 ATP 或 GTP 作为磷
酸基团供体的蛋白激酶, 由 4个亚基 αα′ββ′组成。报
道有 160种蛋白在体外被 CK2修饰, CK2与转录调
控、细胞增殖、信号传导、发育和肿瘤发生等有关[2]。
CK1 是以单体形式在体内各组织以及在细胞各种膜

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区室分布广泛的激酶, 与 DNA修复、代谢调控、有
丝分裂和信号传导的调节等过程有关[3~6]。CK1是真
核生物中非常保守的多基因家族, 酵母中发现有 4
个 CK1 基因。酿酒酵母为 HRR25、YCK1、YCK2
和 YCK3; 裂殖酵母为 Ckil、Cki2、Hph1和 Hhp2[7]。
在哺乳动物中发现有α、β、γ、δ和 ε等 5个亚家族,
CK1γ亚家族目前发现有 CK1γ1、CK1γ2 和 CK1γ3
三个成员。近年来, 在高等动物中有关 CK基因的研
究有过一些报道[8~11], 但在高等植物中对 CK1 的性
质及作用的研究不多, 对它们在植物中的生理功能
所知甚少。以前在拟南芥基因组中搜索到 21个可能
的 CK1家族成员, 其中有 6个 CK1基因的 cDNA克
隆被分离到, 对它们的磷酸化作用等进行了初步描
述[12~15]。目前, 关于拟南芥 CK1基因家族成员在植
物体内确切的生理功能的研究尚不多见。本文从拟
南芥幼苗组织中分离了 1个 CK1基因家族成员 CK1A,
研究了该基因的组织表达特征, 采用 Gateway 系统成
功地构建了 CK1A 基因的植物表达载体 35S: GFP:
CK1A, 通过酵母双杂交实验显示CK1A蛋白在蓝光
下能与 CRY2 蛋白发生相互作用, 暗示 CK1A 基因可
能参与拟南芥的蓝光信号传导途径。本研究对进一步
深入探索该基因的生理功能具有一定的参考价值。
1 材料和方法
1.1 植物材料
野生型拟南芥为 Columbia生态型。将拟南芥种
子用 70%酒精溶液浸泡, 吸出后用无菌水清洗 4~6
次, 然后用 0.1% HgCl2浸泡 7 min, 吸出后用无菌水
清洗 4~6次, 放入 4℃冰箱春化 4 d。播种时, 用 0.1%
琼脂悬液悬浮后将种子均匀点播在含 0.8%琼脂固体
培养基表面, 置 22℃光照培养箱培养。移栽的植株
则置于培养室中于长日照条件下生长。取 4~5 片叶
期的幼苗在液氮中速冻后 , 保存于−80℃冰箱用于
RNA 抽提、目标基因克隆和 RT-PCR 分析。分别收
取成年植株的根、茎、叶、叶柄、花等, 在液氮中
速冻后保存于−80℃冰箱用于目标基因的组织表达
分析。以生长在 22℃条件下暗培养 6 d的拟南芥进
行蓝光处理, 光强为 100 μmol/m2·s, 处理时间分别
为 0、1、6、12、24 h。分时段收获不同处理的材料,
在液氮中速冻后保存于−80℃冰箱用于目标基因的
表达分析。
1.2 CK基因家族成员的预测及系统进化树的构建
检索NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Protein-
protein BLAST (blastp)后台蛋白数据库, 并加入 TIGR
(ftp://ftp.tigr.org/pub/data/)的蛋白数据库作为对比和
补充, 对拟南芥全基因组 CK 基因家族成员进行预
测。多重序列比对利用 DNAStar 软件包中的
MegAlign 工具, 序列联配结果经过人工校正后构建
系统发生树。
1.3 RNA的分离与 cDNA 第一链的合成
总RNA的抽提采用RNAeasy Mini Kit (Ambiogen
生物技术有限公司 )按照说明进行 , 反转录按照
Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase Instruction
操作, 取 2 μg经 DNaseI处理的总 RNA用于 cDNA
第一链的合成, 产物作为 RT-PCR模板。
1.4 半定量 RT-PCR分析
CK1A基因的 RT-PCR引物为 CK1A(+)(5′-AATG
GATGCTGGAACTGG-3′)和 CK1A (−)(5′-GTGGGAT
GCTTAGGATGAGA-3′)。内参 Actin-2的 RT-PCR引
物为 Actin(+)(5′-GCAAGTCATCACGATTGGTG-3′)
和 Actin(−)(5′-ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3′)。
PCR程序为: 95℃预变性 3 min, 95℃ 30 s, 52℃ 30 s,
72℃ 30 s, 30个循环后延伸 10 min。每个 RT-PCR
分析重复 3遍。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.5 CK1A基因 GFP融合表达载体的构建
CK1A基因的 PCR扩增: 根据 TAIR (http://www.
arabidopsis.org/)预测的 CK1A 的 mRNA 序列设计一
对特异性引物, 在上游和下游引物的 5′端分别加入
attB1 和 attB2 位点, 利用 Gateway 技术进行克隆。
CK1A 全长 cDNA 扩增的引物如下: 5′端引物为 5′-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAT
GCCGGAGCTTCGCCGT-3′; 3′端引物为 5′-GGG
GACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTCAAG
ATACAGTTCGGCCATAGCT -3′。PCR反应程序为:
95预变性 1 min, 95℃ 10 s, 60℃ 1 min, 72℃ 1.5 min,
共 30 个循环。用 1%的琼脂糖凝胶电泳回收约为
2 100 bp的 PCR产物。BP重组反应: 利用 Invitrogen
公司的 BP 重组试剂盒, 将 CK1A 基因 PCR 扩增后
纯化的片段与入门载体 pDONR201按照试剂盒说明

第 10期 喻达时等: 拟南芥 CK1A基因功能初步研究 1039


书进行重组反应, 重组产物转化大肠杆菌 DH5a 的感
受态细胞, 得到入门克隆, 用含卡拉霉素 50 μg/mL
LB平板筛选阳性克隆, 然后交测序公司测序, 得到阳
性重组子 pDONR201-CK1A。LR 重组反应: 利用
Invitrogen 公司的 LR 重组试剂盒 , 将克隆至
pDONR201上的 CK1A基因与目标载体 35S-GW-GFP
按照试剂盒说明书进行重组反应 , 转化大肠杆菌
DH5ɑ 的感受态细胞, 用含氨苄青霉素 100 μg/mL
LB 平板筛选阳性克隆, 通过菌落 PCR 检测阳性克
隆, 得到 35S: GFP: CK1A阳性重组子。
1.6 亚细胞定位
亚细胞定位参照邓克勤等[16]所述方法进行。
1.7 CK1A与 CRY2的酵母双杂交
酵母双杂交系统筛选参照 Match maker gal4双
杂交系统 3 操作流程进行(Matchmaker Gal4 Two
Hybrid System 3 & Libraries User Mannual. PT3247 1,
Clontech, USA)。CRY2全长 cDNA引物为: CRY2F:
5′-CAATTGATGAAGATGGACAAAAAG-3′; CRY2R:
5′-CTCGAGTCATTTGCAACCATTTTTTC-3′。CK1A
全长 cDNA引物为: CK1AF: 5′-GAATTCATGCCGG
AGCTTCGCCGT-3′; CKA1R: 5′-CTCGAGTCAAGA
TACAGTTCGGCCATAGCT-3′。将 CRY2和 CK1A编
码区分别克隆到相应的诱饵质粒 pBridge (Clontech)
和猎物质粒 pGADT7(Clontech)中, 将诱饵质粒与猎
物质粒共同转化 Y190酵母细胞。取 200 μL酵母转
化菌液均匀涂布在 SD 三缺(-LEU-TRP-HIS)平板上,
分为两组, 一组在黑暗条件下培养,一组在蓝光条件
下培养。均保持温度 30℃, 培养 2~4 d。然后做β-
半乳糖苷酶滤膜分析: 采用β-半乳糖苷酶滤膜分析
检测报告基因 LacZ被激活情况。将滤纸放在生长有
酵母 SD 三缺(-LEU-TRP-HIS)培养基的平板上, 使
酵母克隆影印在滤纸上, 将沾有克隆的滤纸在液氮
中速冻 10 s, 室温裂菌。含有酵母克隆的滤纸面向上,
放在另一张同样大小浸有 Z buffer/X-gal 的滤纸上,
30℃或室温下孵育, 8 h内观察颜色变化。
2 结果与分析
2.1 CK基因家族成员的预测及系统进化树的构建
对拟南芥全基因组 CK 基因家族成员进行了
预测, 共检测到 27 个 CK 基因。图 1 表明 CK 基
因家族成员之间的亲缘关系, 系统发生树为 CK
家族成员的后续研究提供参考数据。本研究主要
对该家族中的 AT3G13670 基因(CK1A)的功能进
行初步分析。
2.2 CK1A蛋白表达的亚细胞定位
CK1A 基因的 PCR 产物纯化后经克隆测序, 结果
表明该基因的ORF全长 2 112 bp, 编码 703个氨基酸。


图 1 拟南芥 CK 基因家族成员的系统进化树
刻度数字表示系统进化树的枝长度。

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序列比较表明, CK1A的序列与www.arabidopsis.org网
站上 AT3G13670基因预测的一致, 第 263~275位为
CK1A蛋白的丝/苏氨酸蛋白激酶激活位点。
为了确定 CK1A 基因表达的蛋白在细胞中发挥
功能的具体部位, 构建了绿色荧光蛋白与 CK1A 基
因的融合表达载体, 利用基因枪介导的洋葱表皮细
胞瞬时表达系统进行亚细胞定位分析, 结果如图 2
所示。图 2A中可以看到绿色荧光集中在洋葱表皮细
胞的细胞核; DAPI 是一种标记细胞核的荧光染料,
从图 2B中 DAPI染色结果也可以看到荧光主要集中
在细胞核, 表明 CK1A基因主要定位在细胞核中。



图 2 洋葱表皮细胞瞬时表达 CK1A 蛋白的亚细胞定位
A: 蓝光(395 nm)激发下的洋葱表皮细胞; B: DAPI染色后的洋葱表
皮细胞。

2.3 CK1A基因在不同组织中的表达情况
半定量 RT-PCR结果表明: CK1A基因在各个不
同器官中的表达水平不同, CK1A在花中表达量最大,
在茎和根中次之, 在叶和叶柄中较弱(图 3)。



图 3 CK1A 基因在拟南芥各器官中的表达

2.4 蓝光处理下 CK1A基因的表达情况
不同时间蓝光处理后的半定量 RT-PCR 结果(图
4)表明, 在黑暗条件下, 拟南芥 CK1A基因在 24 h内
的不同时间点的表达水平没有观察到明显的变化 ,
但当拟南芥从暗培养转移到蓝光下处理 1 h 后 ,
CK1A 基因表达开始增加, 12 h 时表达量明显增加,
24 h时表达量开始下降。
2.5 CK1A与 CRY2蛋白的酵母双杂交
CK1A与 CRY2的酵母双杂交结果如图 5所示。
结果表明: 在黑暗条件下培养, 不产生蓝色斑点, 半
乳糖苷没有被分解, 证明没有合成半乳糖苷酶(图 5A);

图 4 拟南芥在黑暗和蓝光处理下 CK1A 基因表达的变化
A: 黑暗下; B: 蓝光下。


图 5 CK1A 与 CRY2 蛋白的酵母双杂交实验
A: 黑暗下; B: 蓝光下。

当在蓝光条件下培养时, 有蓝色斑点出现, 说明半乳
糖苷被分解, 证明有半乳糖苷酶的合成(图 5B), 说明
CK1A在蓝光下能与 CRY2蛋白发生相互作用。
3 讨 论
本研究采用半定量 RT-PCR 分析检测了 CK1A
基因在拟南芥不同器官中的表达情况 , 结果表明
CK1A基因在花中表达量最大, 其次是茎和根, 在叶和
叶柄中表达量较弱, 暗示 CK1A 基因在拟南芥的根、
花、叶的生长发育过程中可能起调控作用。采用基因
枪法进行的洋葱表皮细胞 35S:GFP:CK1A瞬时表达实
验表明, 荧光信号主要分布在细胞核上, 显示 CK1A
基因的产物可能在细胞核上发挥作用。RT- PCR分析
表明蓝光使CK1A基因的表达升高, 12 h时表达量明显
增加, 24 h时表达量下降, 研究结果暗示 CK1A基因可
能是蓝光信号传导通路中的一个调控因子。
蓝光受体隐花色素 CRY(包含 CRY1 和 CRY2)在
植物、动物和昆虫生长发育过程中发挥极其重要的作
用。Sugano等[17]在 1998年发现拟南芥蛋白激酶 CK2
能够与生物钟相关的蛋白 CCA1(CIRCADIAN CLOCK
ASSOCIATED 1)相互作用, 并能使 CCA1蛋白磷酸
化。Daniel等[18]发现 CK2的调节亚基 CKB3过表达

第 10期 喻达时等: 拟南芥 CK1A基因功能初步研究 1041


影响了拟南芥生物钟的调节 , 进一步的实验证明
CKB3 通过调节 CCA1 的磷酸化而调控植株的生物
钟, 因此 CK2 对维持拟南芥生物钟正常功能非常重
要。近年来, Perales等[19]发现 CK2的调节亚基 CKB4
是一个核定位蛋白, 在有机生物体内以同形异构体
存在, 它的磷酸化异构体是蛋白质的泛素/蛋白酶体
降解途径的首选底物, 实验证明 CKB4 蛋白酶体降
解受拟南芥生物钟的调节。CKB3 和 CKB4 是目前被
发现与光信号传导途径有关的 2 个酪蛋白激酶基因。
在本研究中, 我们发现蓝光诱导 CK1A 基因的表达,
并出现一定的周期性, 因此, CK1A可能在拟南芥生长
发育中参与蓝光信号传导通路。在拟南芥里 CRY调控
光形态建成、开花时间和生物钟。CRY2 编码一个核
蛋白, 蓝光在转录水平对该蛋白进行调节, 它的作用
是增加拟南芥对蓝光的敏感。本研究发现 CK1A蛋白
主要定位在核中, 因此推测该蛋白可能与 CRY2 能发
生相互作用。为了更一步证明 CK1A是否与蓝光信号
传导通路有关, 我们利用酵母双杂交研究了拟南芥
CK1A与 CRY2的相互作用, 结果表明, CK1A在黑暗
下不能与 CRY2 发生相互作用 , 但在蓝光下能与
CRY2发生相互作用, 暗示CK1A基因可能参与拟南芥
的蓝光信号传导途径。
参考文献(References):
[1] Kersten B, Agrawal GK, Iwahashi H, Rakwal R. Plant
phospho-proteomics: a long road ahead. Proteomics, 2006,
6(20): 5517−5528.
[2] Johnson LN, Lowe ED, Noble MEM, Owen DJ. The
structural basis for substrate recognition and control by
protein kinases. FEBS Lett, 1998, 430(1): 1−11.
[3] Gross SD, Anderson RA. Casein kinase I: Spatial organi-
zation and positioning of a multifunctional protein kinase
family. Cell Signal, 1998, 10(10): 699−711.
[4] Bioukar EB, Marricco NC, Zuo D, Larose L. Serine
phosphorylation of the ligand-activated beta-platelet-de-
rived growth factor receptor by casein kinase I-gamma2
inhibits the receptors autophosphorylating activity. J Biol
Chem, 1999, 274(30): 21457−21463.
[5] Kemp BE, Pearson RB. Protein kinase recognition se-
quence motifs. Trends Biochem Sci, 1990, 15(9): 342−346.
[6] Gietzen KF, Virshup DM. Identification of inhibitory
autophosphorylation sites in casein kinase I epsilon. J Biol
Chem, 1999, 274(45): 32063−32070.
[7] Robinson LC, Hubbard EJ, Graves PR, Depaoli-Roach AA,
Roach PJ, Kung C, Haas DW, Hagedorn CH, Goebl M,
Culbertson MR, Carlson M. Yeast casein kinase I homo-
logues: An essential gene pair. Proc Natl Acad Sci USA,
1992, 89(1): 28−32.
[8] Tomishige N, Kumagai K, Kusuda J, Nishijima M, Hanada
K. Casein kinase I{gamma}2 down-regulates trafficking
of ceramide in the synthesis of sphingomyelin. Mol Biol
Cell, 2009, 20(1): 348−357.
[9] Lee BH, Yoon SH, Kim YS, Kim SK, Moon BJ, Bae YS.
Apoptotic cell death through inhibition of protein kinase CKII
activity by 3, 4-dihydroxybenzaldehyde purified from Xan-
thium strumarium. Nat Prod Res, 2008, 22(16): 1441−1450.
[10] Kotaka T, Ujike H, Morita Y, Kishimoto M, Okahisa Y,
Inada T, Harano M, Komiyama T, Hori T, Yamada M, Se-
kine Y, Iwata N, Iyo M, Sora I, Ozaki N, Kuroda S. Asso-
ciation study between casein kinase 1 epsilon gene and
methamphetamine dependence. Ann N Y Acad Sci, 2008,
1139: 43−48.
[11] Yang Y, Cheng P, Liu Y. Regulation of the Neurospora
circadian clock by casein kinase II. Genes Dev, 2002,
16(8): 994−1006.
[12] Ali N, Halfter U, Chua NH. Cloning and biochemical
characterization of a plant protein kinase that phosphory-
lates serine, threonine, and tyrosine. J Biol Chem, 1994,
269(50): 31626−31629.
[13] Newman T, de Bruijn FJ, Green P, Keegstra K, Kende H,
McIn-tosh L, Ohlrogge J, Raikhel N, Somerville S,
Thomashow M, Retzel E, Somerville C. Genes galore: a
summary of methods for accessing results from large-scale
partia1 sequencing of anonymous Arabidopsis cDNA
clones. Plant Physiol, 1994, 106(4): 1241−1255.
[14] Mindrinos M, Katagiri F, Yu GL, Ausubel FM. The A.
thaliana disease resistance gene RPS2 encodes a protein
containing a nucleotide-binding site and leucine-rich re-
peats. Cell, 1994, 78(6): 1089−1099.
[15] Klimczak LJ, Farini D, Lin C, Ponti D, Cashmore AR,
Giuliano G. Multiple isoforms of Arabidopsis casein
kinase I combine conserved catalytic domains with vari-
able carboxyl-terminal extensions. Plant Physiol, 1995,
109(2): 687−696.
[16] 邓克勤, 郭新红, 汪启明, 刘选明. 拟南芥磷酸酶基因
亚细胞定位与组织表达 . 西北植物学报 , 2009, 29(2):
234−239.
[17] Sugano S, Andronis C, Green RM, Wang ZY, Tobin EM.
Protein kinase CK2 interacts with and phosphorylates the
Arabidopsis circadian clock-associated 1 protein. Proc
Natl Acad Sci USA, 1998, 95(18): 11020−11025.
[18] Daniel X, Sugano S, Tobin EM. CK2 phosphorylation of
CCA1 is necessary for circadian oscillator function in Arabi-
dopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(9): 3292−3297.
[19] Perales M, Portoleé s S, Más P. The proteasome-dependent
degradation of CKB4 is regulated by the Arabidopsis bio-
logical clock. Plant J, 2006, 46(5): 849−860.