全 文 ：农业生物技术科学
中国农学通报 第24卷 第2期 2008年 2月
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基金项目：国家自然科学基金资助项目“拟南芥草酸不敏感突变体的分子分析及其机制研究”(No30671347)；公益性行业（农业）科研专项经费“油菜
菌核病早期诊断技术与成灾规律研究”（nyhyzx07-054）。
第一作者简介：陈晓婷，女，1968年出生，浙江永康人，副教授，在职博士研究生，主要从事植物逆境生理生化研究。通信地址：350002福建农林大学生
命科学学院化学生物系，Tel:0591-83789478，E-mail：levtring@126.com。
通讯作者：王宗华，男，1962年出生，福建尤溪人，研究员，博士生导师，主要从事分子植物病理的研究，通信地址：350002福建农林大学海外学院，
Tel：86-591-83790312，E-mail：wangzh@fjau.edu.cn。
收稿日期：2007-11-13，修回日期：2007-12-13。
枯草芽孢杆菌草酸脱羧酶转化拟南芥研究初报
陈晓婷 1,2,陈芳芳 2,郑 麟 1,林志伟 1,王爱荣 3,鲁国东 2,王宗华 1,2
(1福建农林大学生命科学学院，福州350002；2生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002；
3福建农林大学计算机与信息学院，福州350002)
摘 要:多种真菌在致病过程中会分泌草酸,这些草酸产生菌寄主范围广,可以导致上百种植物病害,造
成世界范围农作物的严重减产。草酸可以通过氧化与脱羧两种途径降解。该研究克隆了枯草芽孢杆菌
的草酸脱羧酶基因 Yvrk,并构建其植物表达载体,通过农杆菌浸花转化拟南芥,收获种子,用除草剂
Basta筛选获得15株转基因植株,对其中的11个株系分别离体接种菌核病菌,24h后量病斑,发现有6
株转基因植株的病斑显著小于野生型。PCR验证发现大部分转基因植株确有Yvrk的存在,实验结果说
明草酸脱羧酶基因确能一定程度上缓解真菌病害。
关键词:拟南芥;枯草芽孢杆菌;草酸脱羧酶;菌核病菌
中图分类号:Q784 文献标识码:A
PreliminaryStudyonTransformationofAnOxalateDecarboxylaseGene
fromBacilussubtilisintoArabidopsisthaliana
ChenXiaoting1,2,ChenFangfang2,ZhengLin1,LinZhiwei1,WangAirong3,
LuGuodong2,WangZonghua1,2
(1ColegeofLifeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002;
2KeyLaboratoryofBio-pesticideandChemistryBiology,MinistryofEducation,Fuzhou350002;
3ComputerandInformationColege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002)
Abstract:Oxalicacid(OA)isconsideredasoneoftheubiquitouspathogenicfactorsformanyfungalplant
pathogens.TheseOA-producingpathogensinfecthundredsofplantsandcauseseverelossofcropsworld-
wide.TherearetwowaystodegradeOAwhichisoxidationanddecarboxylation.OxalatedecarboxylaseYvrk
fromBacilussubtilis168wasclonedanditsplantexpressionvectorwasconstructed.Yvrkwastransfered
intoArabidopsisthalianabyfloraldip.ThetransgenicseedswereselectedbyBastaand15transgenicplants
wereobtained.SclerotiniasclerotioruminfectionAssaysdemonstratedthat6transgenicplantslesionsizes
weresignificantlysmalerthanwildtypebydetachedleavesinfection.PCRamplifiedYvrkinmostofthe
transgenicplants.Theseresultsindicateanovelapproachtodeveloptransgenicplantsresistanttofungalin-
fection.
Keywords:Arabidopsisthaliana,Bacilussubtilis,oxalatedecarboxylase,Sclerotiniasclerotiorum
许多真菌在致病过程中都会分泌草酸（Oxalic
acid,OA）[1]。这些草酸产生菌寄主范围广，造成世界范
围农作物的严重减产[2]。同时，一些绿叶蔬菜，如菠菜、
苋菜等草酸含量很高，大大降低其营养品质。大量食用
此类叶菜甚至会导致人体肾结石、低血钙和高草酸尿
等病症[3~5]。草酸可通过脱羧和氧化两种途径分解：通
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过草酰CoA脱羧酶使草酸转化为草酰CoA或通过草
酸脱羧酶使草酸脱羧，产生 1分子 CO2和 1分子
HCOOH或通过草酸氧化酶氧化草酸产生2分子CO2
和1分子H2O2[4]。在植物中引入草酸降解酶基因，一方
面可以降低营养胁迫，另一方面，可以增强植物对病原
真菌的抗性。该研究从测序菌株枯草芽孢杆菌（Bacil-
lussubtilis168）中克隆草酸脱羧酶基因 Yvrk[5,6]，并构
建其植物表达载体，转化拟南芥，对转基因植株进行菌
核病抗性分析。为真菌病害的防治提供一条新的途径。
1材料与方法
该研究于2006年5月—2007年5月于福建农林
大学进行。
1.1材料
1.1.1菌种和质粒载体 枯草芽孢杆菌（Bacilussubtilis
168）、大肠杆菌（E.coli）DH5α、农杆菌菌株GV3101等
由实验室保存；pMD18Tvector购自宝生物工程（大
连）有限公司，植物表达载体pEGAD[7]由美国加州大
学洛杉矶分校林辰涛教授提供。
1.1.2植物材料 拟南芥（Col-4）种子由林辰涛教授提
供。2006年9月于福建农林大学功能基因组研究中
心的培养室种植野生型拟南芥，(22±1)℃，16h光照，
8h黑暗种植。12月份进行浸花转化，2007年 1月收
获种子。
1.1.3酶和化学试剂 rTaq、ExTaq购自宝生物工程（大
连）有限公司，T4ligase、EcoRI、HindII购自纽英伦生
物技术（北京）有限公司。胶回收试剂盒和质粒小提试
剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其它化学试
剂从厦门泰京生物有限公司订购，均为分析纯。
1.2试验方法
1.2.1基因组DNA的提取 枯草芽孢杆菌基因组DNA
的提取：取1.5ml菌液10000r/min离心2min，菌体沉
淀重悬于 80μl含 0.3mol/L蔗糖，25mmol/LEDTA
(pH8.0)的溶液，加10μl溶菌酶，37℃10min，加入
60℃预热的DNA提取液420μl（含100mmol/LTris、
0.5mol/LNaCl、25mmol/LEDTA、0.5%SDS）,再加
500μlTris饱和酚，加入等体积的24:1（V/V）氯仿、异
戊醇10000r/min离心6min，取上清，加等体积的无水
乙醇沉淀 DNA，12000r/min离心 10min,弃上清，用
70%乙醇洗1次，12000r/min离心5min，弃上清，吹
干，加入50μl无菌双蒸水，-20℃保存。
拟南芥基因组DNA的提取：取3、4片8w龄的转
基因植株叶片，按文献[8]提取基因组DNA。
1.2.2枯草芽孢杆菌 Yvrk的克隆 扩增Bs168Yvrk基
因的引物为：
E-OXD-F：5-CCGGAATTCCCTTTCACCTTCTC
TTTCTGCTAT-3；
E-OXD-R：5-CCCAAGCTTAAGCGGCAAGTCT
TTTATTTACTG-3。
引物 5端添加 EcoRI、HindII酶切位点。取
Bs168基因组 DNA50ng为模板，以 E-OXD-F和
E-OXD-R为引物，进行PCR反应。程序为：94℃预变
性 5min，94℃变性 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，
30~33个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1%的琼
脂糖凝胶电泳后，回收纯化，连接到 pMD18Tvector，
转化 DH5α，在含有 IPTG和 X-gal的 LB（含 100
mg/LAmp）固体培养基上，利用蓝白斑筛选，挑取白色
菌落。通过 PCR和双酶切验证获得重组质粒
pMD-Yvrk。
1.2.3植物表达载体的构建 将表达载体质粒pEGAD
和pMD-Yvrk用EcoRI、HindII双酶切，获得目的片
段，通过T4ligase连接，转化DH5α，在含有Kana
(50mg/L)的LB培养基上筛选转化菌落，通过PCR和
双酶切验证获得重组质粒pEGAD-Yvrk。
1.2.4拟南芥的转化与抗性植株的筛选 将质粒 pE-
GAD-Yvrk用冻融法转入GV3101感受态细胞，在含
Kana和Rif(50mg/L)的培养基上筛选转化菌落，PCR
验证，阳性克隆命名为GV3101-Yvrk。将GV3101-Yvrk
接到5mlLB(50mg/LRif和50mg/LKana)液体培养
基中，28℃，250r/min培养至对数期，1:100转接到200
mlLB(含50mg/LRif和50mg/LKana)液体培养基中，
28℃，250r/min摇至 OD600约为 0.8，5000r/min离心
15min，重悬于 1/2MS+5%蔗糖，调 OD600为 0.8，并加
0.2%Silwet-77，采用菌液浸花法(30s)转化初花期的拟
南芥，黑暗保湿处理1~2d。1周后再转化1次，收获种
子，在含0.03%的Basta的土壤中筛选阳性植株。
1.2.5抗性植株的PCR检测 提取抗Basta植株的基因
组DNA进行转基因植株中Yvrk的PCR检测，引物为：
T-OXDF：5-GACAAGCAGAAGAACGGCAT-
CAA-3；
T-OXDR：5-CGTCAAACACGAGCAGGAACT-
CA-3。
反应程序为：94℃预变性 5min，94℃变性 1min，
55℃ 1min，72℃ 1.5min，30~33个 循 环 ，72℃ 延 伸
10min。
1.2.6抗性植株的菌核病菌致病性分析 每株取3片叶
接种，在接种后的24h测量病斑直径[9]。
1.3统计分析
数据用DPS数据处理系统分析。
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2结果与分析
2.1枯草芽孢杆菌 Yvrk的克隆及其植物表达载体的
构建
由于枯草芽孢杆菌Yvrk的序列的特殊性一超始
密码子后连着6个A，以及起始一段序列低的G/C含
量，直接从起始密码子处设计引物，扩增不到Yvrk，因
此改从其上游基因的3UTR和下游基因的5UTR处
设计引物，用ExTaq酶扩增出1225bp的Yvrk，回收，
T-A克隆连接到pMD18Tvector，菌液PCR挑取能扩
增出 1225bp目的条带的阳性菌落（图 1），对 PCR阳
性的菌液提取质粒，用EcoRI、HindII双酶切，能切出
目的条带的进一步说明是阳性的重组质粒（图2），命
名为pMD-Yvrk，对该重组质粒进行测序对比的结果
也表明Yvrk已连到T载体上（图3）。
将表达载体 pEGAD与 pMD-Yvrk用 EcoRI、
HindII双酶切后，回收目的片断进行T4连接，转化感
受态，菌液 PCR和双酶切验证（图略）获得重组质粒
pEGAD-Yvrk。
pEGAD-Yvrk转化农杆菌感受态，挑取菌落，PCR
验证获得Yvrk过表达载体GV3101-Yvrk（图4）。
图1菌液PCR验证pMD-Yvrk的阳性克隆
注：泳道 2、3、4、6是阳性克隆，泳道7是阳性对照，泳道8是DL
2000DNAmarker
图2重组质粒 pMD-Yvrk的EcoRI、HindIII双酶切验证
注：泳道1是重组质粒 pMD-Yvrk的双酶切结果，泳道2是 DL2000
DNAmarker
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图3重组质粒 pMD-Yvrk的测序序列与Bs168Yvrk的比对
注:Query1-1158为Yvrk的序列,Sbjct54-1211为pMD-Yvrk的测序序列。
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图4菌液PCR验证GV3101-Yvrk的阳性克隆
注：泳道2、4、5、6是阳性克隆，泳道7是阳性对照，泳道8是DL2000DNAmarker
图6转基因植株的PCR检测
注：泳道 1-11表示相应的转基因植株；泳道 1、2、3、4、5、9、10、11是阳性转基因植株，泳道 12是阴性对照，泳道13是 DL2000DNAmarker。
2.2转基因植株的获得及检测
利用双元载体的bar基因的除草剂抗性，用除草
剂Basta筛选获得15株阳性植株，对其中长势较好的
11株进行了菌核病接种试验，每株取部位相同的三片
叶进行试验，对病斑情况的统计结果（图5）表明：除6、
8号转基因植株的病斑面积大于野生型对照外（但未
达到显著水平），其余的转基因植株病斑面积都小于野
生型；其中2、3、4、5、9、11号转基因植株的病斑面积显
著小于野生型对照（5%显著水平），其病斑面积仅为对
照的27.2%~42.8%。以上结果说明转Yvrk基因的拟南
芥植株可在一定程度上缓解菌核病菌这种草酸产生菌
对植株的病害。
图5转Yvrk植株接种菌核病菌24h后的病斑情况
注：*表示病斑面积显著小于对照(5%水平)。
此外，此研究还提取了转基因植株的基因组
DNA，取双元载体 pEGAD的 EGFP序列和插入的
Yvrk序列各400bp设计引物，对转基因植株进行PCR
扩增（图 6），其中 1、2、3、4、5、9、10、11号转基因植株
能扩增到约800bp的条带。说明Yvrk确实转到拟南芥
基因组中。
2.3讨论
植物病原真菌毒素草酸可以通过氧化和脱羧两条
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途径分解。有不少研究致力于将草酸降解酶的基因转
入相应的作物以提高转基因农作物对菌核病菌等草酸
产生菌的抗性。草酸氧化酶将草酸降解为 H2O2和
CO2。H2O2是一种活性氧成分，也是一个重要的信号分
子，它在植物的许多生理过程中起着重要的作用：可调
节植物防御基因的表达、调节过敏性坏死反应、激活
MAPK级联反应[10]等。来自于大麦的草酸氧化酶基因
成功地转移到油菜中，提高了转基因作物对草酸的抗
性[11]，转大麦草酸氧化酶的花生对小菌核病菌（Sclerotinia
minor）的抗性也增强[12]；小麦的草酸氧化酶基因也被
转到杨树中，转基因植株明显表现出对壳针孢菌
（Septoriamusiva）的抗性[13]，转草酸氧化酶基因的烟草
对草酸的抗性提高[14]，转草酸氧化酶的向日葵增强了
对菌核病菌的抗性[15,16]，在加拿大，转草酸氧化酶的大
豆已进行了2年的限制性田间试验并表现出对菌核病
极高的抗性[17]。
草酸脱羧酶是一种含锰的酶，和植物中的草酸氧
化酶同属cupin蛋白家族,在结构与功能上存在许多的
相似之处，最早发现存在于白腐菌中[18]。相比于草酸氧
化酶，草酸脱羧酶的转基因研究的报道比较有限。
Kesarwani等 获 得 了 木 腐 担 子 菌 冬 菇（Colybia
velutipes.）草酸脱羧酶的全长cDNA并成功地将草酸
脱羧酶全长cDNA表达于转基因烟草及番茄的细胞
质和液泡中，转基因植株的性质可稳定遗传，并表现出
对菌核病的明显的抗性，这种抗性与草酸诱导的PR
蛋白（主要是PR-1、PR-P、PR-Q）的表达有关[4]。Dias等
通过农杆菌介导转化也获得了转草酸脱羧酶的莴苣，
转基因作物对菌核病抗性增强，两个株系接种菌核病
菌甚至无病斑，RT-PCR也证明转基因植株确有草酸
氧化酶的表达[19]。
有研究证实，在低pH的条件下，枯草芽孢杆菌可
诱导合成草酸脱羧酶[6]。笔者从枯草芽孢杆菌中克隆
了草酸脱羧酶基因并构建了植物表达载体，对拟南芥
进行转化，获得了对菌核病菌抗性增强的转基因植株。
此研究为真菌病害的防治提供了有益的借鉴。后继的
研究将筛选到纯系，对转基因植株的草酸含量或是草
酸脱羧酶进行检测，Northern或 Western检测转基因
植株中的Yvrk，对接种菌核病菌后的一些生理生化反
应做进一步的研究。
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