全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 139
收稿 2009-11-18 修定 　2010-01-28
资助 高等学校博士学科点专项科研基金(20094404120008)
和广东高校优秀青年创新人才培养计划(4600-209033)。
* 通讯作者(E-mail: ghzhu@scau.edu.cn; Tel: 020-85280191)。
拟南芥ABA生物合成基因NCED6对葡萄糖诱导其种子萌发延迟的作用
朱国辉*, 徐慰盈, 吴丹, 张乾毅
华南农业大学生命科学学院, 广州510642
提要: 抑制ABA的生物合成可以缓解葡萄糖抑制拟南芥种子萌发作用, 说明ABA的生物合成参与葡萄糖诱导种子萌发的
延迟。ABA生物合成基因 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 6 (NCED6)可以被不同浓度的葡萄糖上调表达, 而 nced6突变
体的种子对葡萄糖不敏感。
关键词: 拟南芥; 葡萄糖; 脱落酸; 种子萌发; 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶
Effect of Abscisic Acid Biosynthesis Gene NCED6 in Glucose Induced Delay of
Arabidopsis thaliana Seed Germination
ZHU Guo-Hui*, XU Wei-Ying, WU Dan, ZHANG Qian-Yi
College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: Seed germination experiment showed that repression of ABA biosynthesis by fluridone alleviated the
inhibition induced by glucose in Arabidopsis thaliana, suggesting the involvement of ABA biosynthesis in glu-
cose-induced delay of seed germination. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) revealed that the transcript
profile of A. thaliana 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 6 (NCED6) gene was significantly increased by exog-
enous glucose treatment. In addition, seeds of nced6 mutant displayed reduced sensitivity to exogenous glucose
during imbibition.
Key words: Arabidopsis thaliana; glucose; abscisic acid (ABA); seed germination; 9-cis-epoxycarotenoid
dioxygenase (NCED)
植物种子萌发受许多外界因子的影响, 葡萄糖
和脱落酸(ABA)均是调节种子萌发及其幼苗生长的
生理因素。许多研究表明, 糖对种子萌发的影响与
植物激素, 尤其是与ABA的合成和信号反应密切相
关(Gibson 2004; 陈俊伟等 2005; Rolland等 2006)。
基因芯片研究结果显示, 许多基因可同时受糖和
ABA诱导, 这包括糖代谢、信号转导及代谢物转
运等基因(Price等2004)。ABA生物合成基因ABA2
和 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 3基因(9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase 3, NCED3), 可同时受
葡萄糖和 ABA诱导表达(Chen等 2006; Xing等
20 09 )。此外, 参与 A BA 信号转导的转录因子
abi3、abi4 和 abi5也参与种子萌发中由糖介导的
信号反应(Rolland等2006), 这表明了ABA代谢和信
号转导在糖信号中的地位。
尽管已知ABA在葡萄糖信号中起作用, ABA和
糖信号在种子萌发中的交互作用和其间的分子机制
仍有待进一步研究。为此, 本文定量分析了拟南芥
种子萌发过程中ABA生物合成基因在糖信号产生
这些过程中的表达变化, 并观察到ABA生物合成基
因NCED6受不同浓度葡萄糖上调表达, 而nced6突
变体的种子则对糖不敏感, 现报告如下。
材料与方法
以拟南芥(Arabidopsis thaliana) ‘Col-0’为实验
材料, 幼苗在光照强度为 200 mmol·m-2·s-1、每日
照光 16 h和温度为 22 ℃的培养箱中培养。种子
收获后置于低湿种子存储柜保存 3个月, 以解除休
眠作用。拟南芥 nced6 T-DNA插入突变体 T1代种
子(SALK_061243)由美国俄亥俄州立大学ABRC
(Arabidopsis Biological Resource Center)提供。筛
选引物为LP: 5 TGCCGTTAAAGAAAACCACAC 3;
RP: 5 TGTGTGAACCAATCAAAATCG 3; LB:
5 GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3。突变体
的筛选及纯化参考 Liu等(2009)。
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2010.02.003
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萌发在放有无菌滤纸的培养皿中进行, 根据实
验要求加入各种浓度的葡萄糖、甘露醇或者是 20
mmol·L-1氟啶酮(fluridone)。培养皿放在22 ℃和光
照强度为200 mmol·m-2·s-1的光照培养箱中, 持续照
光。以胚根露出种皮认定为种子萌发, 每次萌发实
验至少重复 3次。种子在水、1%和 3%的葡萄糖
溶液中萌发 6 h后取样, 于液氮中速冻, 用于 RNA
的提取。
RNA提取用RNA Easy Plant Mini Kit (Qiagen)
试剂盒, 提取的总RNA用DNase I处理 1次, 以去
除 RNA中的微量DNA, 然后经MMLV反转录酶
(Promega)将RNA反转录为 cDNA。用荧光染料 iQ
SYBR Green Supermix (Bio-Rad)对各种待测的基因
进行定量 PCR分析, 所有数据经扩增拟南芥 ACT2
基因进行均一化处理, 每个基因重复 3次。实验中
所用的引物见表 1。
表 1 用于定量 PCR分析的ABA生物合成基因和ACTIN引物序列
Table 1 Sequences of primers for ACTIN and ABA biosynthesis genes used for qRT-PCR
基因 GenBank登录号 引物
ACTIN2 AT3G18780 F: 5 CTTCCCTCAGCACATTCCAG 3
R: 5 CCCAGCTTTTTAAGCCTTTG 3
NCED2 AT4G18350 F: 5 CAATGCCGATGAGTGGTGGTATT 3
R: 5 AGCGGTGGTTCTGGGTGTAAATA 3
NCED3 AT3G14440 F: 5 GGTTTCTGGGAGATGGCTTGGT 3
R: 5 ATGGCGGGAGAGTTTGATGATTG 3
NCED5 AT1G30100 F: 5 CCGGTACGCATACCTAGCCATAG 3
R: 5 CTCCTCGTCGTGAACAAACGACA 3
NCED6 AT3G24220 F: 5 CGGGTCGGATATAAATTGGGTTG 3
R: 5 CACTAAAGATCGTGTCGGGTGGG 3
NCED9 AT1G78390 F: 5 CGAAAGTATATTTACGGAGAGGGG 3
R: 5 GAAGCGTTACGGTAGCTTCAAGCT 3
ZEP AT5G67030 F: 5 TGTTGGGCTTGGTCCTCTGTCTT 3
R: 5 GGCCTTCCTTGGAGTTTTTCACTG 3
SDR AT1G52340 F: 5 TCAAAGGCTTTTGGGTAAAGTGGC 3
R: 5 GACTTTTACACACCTCACCTCCG 3
AAO3 AT2G27150 F: 5 GTGGACACAATCCCAAAACACTTC 3
R: 5 CTCAAATTCCGAATCAGACCCATC 3
结果与讨论
1 ABA的生物合成参与葡萄糖诱导的种子萌发延
迟
前人的研究表明, 在拟南芥和水稻种子萌发过
程中, 外源葡萄糖作为信号物质会延迟种子的萌发
(Dekkers等 2004; Zhu等 2009)。为了弄清楚ABA
生物合成是否参与葡萄糖诱导的抑制作用, 我们用
氟啶酮(一种ABA生物合成抑制剂)进行实验, 结果
表明, 在不同浓度的外源葡萄糖(1%和 3%)作用下,
其种子萌发率显著低于在水中的萌发率。加入 20
mmol·L-1的氟啶酮, 对水中拟南芥种子萌发无明显
影响, 而对葡萄糖处理下种子的萌发率有所提高(图
1), 说明抑制ABA的生物合成可以缓解葡萄糖的抑
制作用, ABA的生物合成参与葡萄糖诱导的种子萌
图 1 葡萄糖和氟啶酮对拟南芥种子萌发的影响
Fig.1 Effects of glucose and fluridone on
Arabidopsis seed germination
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发延迟。
2 ABA生物合成基因NCED6受葡萄糖的诱导表达
已有的研究认为, 拟南芥ABA生物合成过程中
玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase, ZEP)、短
链脱氢 /还原酶(sho r t -cha in dehydrogenase /
reductase, SDR)、ABA醛氧化酶(abscisic aldehyde
oxidase, AAO)都是单基因编码, 而NCED为NCED
基因家族编码, 包括 NCED2、NCED3、NCED5、
NCED6和 NCED9 (Nambara和Marion-Poll 2005;
Toh等 2008)。其中NCED6和NCED9是种子特异
表达基因, 对诱导种子休眠有重要作用(Lefebvre等
2006)。为了进一步了解葡萄糖对ABA生物合成影
响的机制, 我们定量分析了外源葡萄糖对ABA生物
合成过程中编码基因的表达变化。从图 2可看出,
在种子萌发 6 h后, 外源葡萄糖可诱导多个ABA生
物合成基因, 其中, NCED6显著上调表达, 表明葡
萄糖可能通过诱导NCED6基因的表达而增加种子
ABA的合成, 从而延迟种子的萌发。
图 2 葡萄糖对ABA生物合成基因转录水平的影响
Fig.2 Effect of glucose on expressions of ABA
biosynthesis genes in imbibed seeds
图3 拟南芥nced6突变体的筛选
Fig.3 Screening of Arabidopsis nced6 mutant
a. 利用引物组合筛选 nced6纯合体。1和 2: 同一样品DNA,
3和 4为另一样品; 1和 3泳道引物为 LP/RP; 2和 4泳道引物为
LB/RP。b. nced6突变体的RT-PCR分析。
响, 我们用同一批收获的野生型种子作为对照。从
图 4可见, 种子萌发 3 d后, 葡萄糖处理的 nced6突
变体种子萌发率明显高于野生型种子, 在1% 和3%
的葡萄糖作用下分别提高 27.6% 和 82.3%。表明
缺失NCED6基因减轻了葡萄糖对种子萌发的抑制
作用。
图4 葡萄糖对拟南芥nced6突变体种子萌发的影响
Fig.4 Effect of glucose on seed germination
of Arabidopsis nced6 mutant
需要指出的是, 尽管NCED6基因参与了葡萄
糖诱导的拟南芥种子萌发的延迟, 但并不是葡萄糖
所有的影响均由此基因介导。前面已经提到ABA
生物合成基因 ABA2和NCED3 均可被葡萄糖诱导
表达(Chen等 2006; Xing等 2009)。而且我们发现,
拟南芥ABA代谢关键酶基因CYP707A2也参与此
过程(数据未列出)。因此可以认为, 葡萄糖诱导种
子萌发的延迟不仅通过增加ABA的生物合成, 而且
3 nced6突变体在减轻葡萄糖抑制中的作用
用引物组合LP/RP (1和3泳道)和LB/RP (2和
4泳道)筛选突变体的结果(图 3-a)表明, 样品 1为纯
合体, 样品 2为杂合体。收获纯合体种子在MS固
体培养基上培养 7 d, 提取其整株拟南芥RNA, RT-
PCR表明NCED6基因在突变体中已无表达(图3-b),
可用于进一步的实验。
为了检测葡萄糖对nced6突变体种子萌发的影
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同时也通过抑制ABA的代谢来共同实现。
参考文献
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