全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2007年 5月, 29(5): 629―636
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2006-07-04; 修回日期: 2006-12-05
基金项目: 教育部长江学者和创新团队发展计划(编号: IRT 0453)资助[Supported by Program for Changjiang Scholars and Innovative Research
Team in University (No. IRT 0453)]
作者简介: 张珏(1976—), 女, 成都人, 博士研究生, 研究方向: 应用分子生物学。Tel: 028-81779360; E-mail: zjthebest@gmail.com
通讯作者: 吴伯骥(1946—), 男, 研究员, 研究方向: 细胞生物学。Tel: 028-85212691; E-mail: wbjmlq8888@163.com
黄玉碧(1963—), 男, 教授, 博士生导师, 研究方向: 生物化学与分子生物学。Tel: 0835-2882331; E-mail: yubihuang@sina.com
DOI: 10.1360/yc-007-0629
HrpNCSDS001基因克隆及其表达产物诱导拟南芥基因表
达谱变化的研究
张珏 1,3, 曹茂林 2, 黄玉碧 1,3, 吴伯骥 2
1. 四川农业大学玉米研究所, 雅安 625014;
2. 中国科学院成都生物研究所, 成都 610041;
3. 四川农业大学教育部作物基因资源与遗传改良重点实验室, 雅安 625014
摘要 : Erwinia carotovora subsp. carotovora CSDS001 菌株具有可直接诱导烟草过敏反应特征 , 从构建的
CSDS001菌株基因组文库, 鉴定、克隆到 hrpNCSDS001基因, GenBank登录号 AY939927; 构建的重组 hrpNCSDS001
基因工程菌株经 IPTG 诱导培养, 获得的高效表达 HarpinCSDS001 蛋白, 可诱导烟草发生过敏反应。30 µg/mL
HarpinCSDS001蛋白喷施拟南芥后, 分析第 3 h、12 h、24 h、36 h和 48 h拟南芥全基因谱表达动态变化, 结果显
示发生显著表达差异(log ratio≤−1或≥1)的基因数分别为 912、1787、2393、1833和 1755。对被诱导发生显著
表达差异的转录因子基因分析表明, 有 13个转录因子家族: ZIM、BES1、TCP、C2C2、AP2/EREBP、WRKY、
bHLH、bZIP、GARP、MYB、NAC、HB、C2H2与 HarpinCSDS001蛋白作用相关, 这些转录因子家族主要参与调
控植物抗性、光合作用、生长发育、开花等相关功能基因表达。
关键词: hrpNCSDS001; HarpinCSDS001蛋白; 克隆; 基因芯片分析
Study of hrpNCSDS001 and the gene expression profile of Arabidopsis
thaliana induced by HarpinCSDS001
ZHANG Jue1,3, CAO Mao-Lin2, HUANG Yu-Bi1,3, WU Bo-Ji2
1. Maize Research Insititute of Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China;
2. Chengdu Insititute of Biology, Chinese Academy of Science, Chengdu 610041, China;
3. Key Laboratory of Crop Genetic Rresource and Improvement, National Ministry of Education of Sichuan Agricultural University, Ya’an
625014, China
Abstract: Erwinia carotovora subsp. carotovora CSDS001 elicits hypersensitive reaction (HR) in tobacco. From the ge-
nomic libraries of Erwinia carotovora subsp. carotovora CSDS001, the hrpNCSDS001 gene (GenBank number AY939927),
was isolated. The hrpNCSDS001 fusion protein was produced in Escherichia coli, and was used to induce HR by injecting into
tobacco. We further examined the global regulation of Arabidopsis thaliana genes in response to HarpinCSDS001 at a concen-
tration of 30 µg/mL. We indicated that 912, 1787, 2393, 1833 and 1,755 genes that were regulated significantly (log ratio
≤−1 or ≥1) at 3 h, 12 h, 24 h, 36 h and 48 h respectively after the treatment. Analysis of some transcription factors (TF)
showed that 13 TF families responded to HarpinCSDS001 including ZIM, BES1, TCP, C2C2, AP2/EREBP, WRKY,
DOI:10.16288/j.yczz.2007.05.023

630 HEREDITAS (Beijing) 2007 第 29卷


bHLH, bZIP, GARP, MYB, NAC, HB, C2H2. These families mainly function in biological processes of plant defense, pho-
tosynthesis、development and flowering.
Keywords: hrpNCSDS001; HarpinCSDS001; clone; gene chip analysis
Harpin 蛋白由部分植物革兰氏阴性致病菌的
hrpN(hrpZ、hrpW)基因编码产生, 是病原菌对非寄
主植物的过敏诱导因子, 同时也是对寄主植物的致
病因子。因此, 研究植物病原菌的 hrp(hypersensitive
reaction and pathogenicity)基因簇及其表达产物
Harpin 蛋白对植物体的作用机制, 对解析植物病原
菌与植物体的互作关系、病原菌的致病机理以及植
物抗性机制等都具有重要意义。目前已经在
Erwinia[1] 、 Ralstonia[2] 、 Xanthamonas[3] 以 及
Pseudomonas[4]等菌属中发现Harpin蛋白, 不同病原
菌来源的 Harpin蛋白在分子量大小、氨基酸序列等
方面具有不同程度的差异, 但它们都具有一些共同
特征: 富含甘氨酸、不含半胱氨酸、无四级结构、
热稳定性以及对蛋白酶敏感, 并能诱导烟草过敏反
应。
研究发现, 将一定浓度的 Harpin 蛋白施用到植
物体后, 能诱导植物产生抗病性、抗虫性以及促进
植物生长发育[5]。对 Harpin 蛋白诱导植物抗性作用
机制的研究表明, Harpin 蛋白是通过水杨酸信号通
路和乙烯信号通路[6,7], 诱导植物产生系统获得性抗
性(systemic acquired resistance, SAR), 从而使植物
体对病原物的进一步侵染具有抵抗能力。
本实验以中国科学院成都生物研究所非载体室
分离纯化保存的 Erwinia carotovora subsp. caroto-
vora(Ecc)CSDS001菌株为试材, 研究 CSDS001菌株
的致病性和诱导过敏反应等特性; 构建 CSDS001菌
株的基因组文库为研究 CSDS001菌株奠定基础; 利
用菌落原位杂交方法从 CSDS001 基因组文库中筛
选、克隆到 hrpNCSDS001 基因; 通过构建重组大肠杆
菌基因工程菌, 获得高效表达HarpinCSDS001蛋白; 最
后通过使用拟南芥全基因芯片检测 HarpinCSDS001 蛋
白作用后拟南芥全基因表达谱变化 , 初步探讨
HarpinCSDS001诱导植物抗性、促进植物生长发育的作
用机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
Ecc CSDS001 菌株由本室分离获得; 大肠杆菌
工程菌株 JM109(DE3)(Promega,USA)。pET28a(+)质
粒购自 Novagen; pBluescript-II SK(+) (Stratagene,
USA)。野生型欧文氏菌培养基为 LB 培养基, 含抗
性标记菌株的培养基为 LB加相应抗生素, LB、基础
盐培养基参考文献[8]。
基因芯片分析实验用拟南芥为 Columbia(Col-0)
生态型, 植株莲座叶片生长到 14 片, 生长阶段为
1.14, SD为 2.6, CV为 10.2, 生长时间 25天左右。此
供试实验材料的描述根据 Douglas C Boyes 等公布
标准[9]。
ATH1基因芯片购于Affymetrix公司, 芯片介绍
及质量控制标准参见 Affymetrix 公司 ATH1 使用说
明。
荧光 real-time PCR 实验主要试剂为 TaKaRa
SYBR Premix Ex Taq (DRR041A); 使用仪器为 Rotor
Gene RG-3000 Real Time Thermal Cycler (Corbett
Research, Sydney, Austrlia); Rotor-Gene Real-Time
Analysis Software 6.0软件被用于分析 PCR过程检测
的样本 Ct(Threshold cycle)值,
1.2 CSDS001菌株致病性、胞外酶活性和过敏反应
检测
接种 CSDS001 菌株到 LB 固体培养基, 28℃培
养 24 h, 挑取菌落, 用无菌水稀释到 5×109 个/mL,
注射 0.05 mL菌悬液到大白菜, 28℃保湿培养 17 h,
观察 CSDS001对大白菜的致病性;
参考文献 [8], 使用半定量检测法 , 检测
CSDS001 分泌产生的果胶酶(pectate lyase, Pel), 多
聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase, Peh)、蛋白酶
(protease, Prt)和纤维素酶(cellulase, Cel)的活性高低,
检测点周围晕圈大小衡量酶活性的高低。
接种 CSDS001 菌株到 LB 固体培养基, 28℃培
养 24 h, 挑取菌落, 用蒸馏水稀释到 2×108 个/mL,
注射 1 mL菌悬液到烟草叶片, 20 h后观察是否诱导
烟草发生过敏反应。
1.3 hrpNCSDS001基因的克隆及序列测定
CSDS001 菌株基因组文库的构建方法参考文
献[10]。以α-32P-dATP 标记的 Ecc Ecc71 的 hrpN
DNA[8]为探针 , 采用菌落原位杂交法从构建的

第 5期 张珏等: Hrp NCSDS001基因克隆及其表达产物诱导拟南芥基因表达谱变化的研究 631


CSDS001 菌株基因组文库筛选 hrpNCSDS001 阳性克
隆。
将筛选到的阳性克隆质粒经多种内切酶消化 ,
通过 Southern杂交选取含有 hrpNCSDS001基因的片段,
根据 Southern 杂交结果, 将含有 hrpNCSDS001基因片
段经 0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离, 用 DNA 纯
化试剂盒纯化该 DNA 片段, 将纯化后的 DNA 片段
克隆到质粒 pBluescript-II SK(+), 供测序。根据测序
结果, 分析并确定 hrpNCSDS001基因的开放阅读框。
1.4 Northern杂交
为初步分析CSDS001菌株的 hrpNCSDS001基因的
表达水平与环境、营养因子关系, 将 CSDS001接种
到营养丰富 LB培养基, 28℃摇瓶培养至 OD600=2.0,
提取菌株 RNA; 同时将 CSDS001 分别接种到含
0.5%葡萄糖或含 0.5%蔗糖的基础盐培养基, 28℃摇
瓶培养至 OD600=2.0, 提取菌株 RNA, 以 hrpNCSDS001
为探针进行 Northern 杂交, 杂交实验方法参考文献
[10]。
1.5 重组基因工程菌的构建及 HarpinCSDS001 蛋白
的高效表达
根据测定的 hrpNCSDS001基因序列设计 PCR引物
如下:
hrpNCSDS001-1:
TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCG
GAG
hrpNCSDS001-2:
TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAAC
CC
以 hrpNCSDS001+质粒 DNA 为模板 , 参考文献
[10], 进行 PCR扩增反应。PCR扩增片段经纯化后,
BamHⅠ-HindⅢ双酶切, 连接到经过相同酶切的表
达载体 pET28a(＋)的 T7启动子后, 构建成表达质粒
pT7-hrpNCSDS001, 将 阳 性 质 粒 转 化 到 E.coli
JM109(DE3) 。 将 含 有 pT7-hrpNCSDS001 质 粒 的
JM109(DE3)接种到 LB+卡那霉素培养基中, 37℃摇
瓶培养至 OD600=0.6 时, 加入异丙基硫代-β-D 半乳
糖苷 (IPTG)继续诱导培养 3 h, IPTG 终浓度 1
mmol/L。离心收集菌体, 重溶于 1×SDS-PAGE样品
缓冲液煮沸 3 min, 12% SDS-PAGE电泳分析目标蛋
白。
1.6 HarpinCSDS001蛋白的纯化及过敏反应检测
培养含有pT7-hrpNCSDS001质粒的 JM109(DE3)250
mL, IPTG 诱导外源基因表达后, 离心(4,000 r/min,
15 min, 4℃)收集菌体,将菌体重悬于 3倍体积的蒸馏
水中。在冰浴上用超声波破碎后, 离心(15,000 r/min,
15 min, 4 ℃)收集破碎液, 沉淀重悬于 9倍体积含表
面活性剂的清洗液, 混合成均相后离心(15,000 r/min,
15 min, 4℃), 将沉淀(含HarpinCSDS001包含体)重悬于
9 倍体积含 8 mol/L 盐酸胍的缓冲液, 混合均匀后,
沸水浴中保温 10 min, 冷却后, 离心(15,000 r/min,
15 min, 4℃), 将上清液置 8~14 kDa 透析袋内, 对
100 倍体积的不含盐酸胍缓冲液透析, 4℃。收集透
析袋内容物, 离心(20,000 r/min, 20 min, 4℃), 上清
为纯化的 HarpinCSDS001蛋白。
将 200 µg/mL 纯化的 HarpinCSDS001蛋白注到在
烟草叶片; 对照为相同浓度 BSA溶液和含表达载体
质粒 pET28a(+)的 JM109(DE3)经相同培养后的细胞
破碎液, 蛋白总量浓度为 200 µg/mL, 20 h后检测是
否诱导过敏反应发生。
1.7 基因芯片分析实验设计
为检测 HarpinCSDS001 蛋白处理后引起的拟南芥
基因表达动态变化, 实验设为 6 组, 每组使用一株
拟 南 芥 , 第 1~5 组为 实 验 组 , 分 别 在 喷 施
HarpinCSDS001蛋白后第 3 h、12 h、24 h、36h和 48 h
取样, 第 6组为对照组, 不喷施 HarpinCSDS001蛋白。
将 30 µg/mL的 HarpinCSDS001蛋白试剂 3 mL均
匀喷施于实验组拟南芥, 喷施时 , 均严格与其它参
与实验的植株隔离。
每组取拟南芥地上部分, 液氮保存, 送上海生
物芯片公司, 完成总 RNA提取、芯片杂交以及数据
提取等工作。
相对定量荧光 real-time PCR实验检测样本中所
选择基因表达情况, 反应条件如下: 95℃, 2 min;接
着进行 45个循环, 95℃, 15 s; 60℃, 15 s, 72℃, 20 s。
设未处理样本为对照, 管家基因β-actin 为内参, 计
算实验组样本目的基因∆∆Ct = (样本目的基因 Ct−样
本管家基因 Ct)−(对照目的基因 Ct−对照管家基因
Ct)。
2 结果和分析
2.1 CSDS001菌株致病力、胞外酶活性及过敏反应
诱导性
实验结果显示 CSDS001 菌株对大白菜具有强
致病力、分泌较高活性植物细胞壁降解酶类, 诱导
非寄主植物烟草产生过敏反应。

632 HEREDITAS (Beijing) 2007 第 29卷


将 CSDS001接种到大白菜, 17 h后出现明显的
软腐症状, 参见图 1, 证明 CSDS001具有强致病力。
半定量酶活性检测结果显示, CSDS001 菌株能分泌
较高活性 Pel、Peh、Prt和 Cel, 参见图 2。这 4类酶
属于植物细胞壁降解酶类(Plant Cell Wall-Degrading
Enzymes, PCWDEs)[11], 是 Ecc的重要致病因子, 在
病原菌侵入植物体和从中获取养分中发挥重要作
用。因此, 分泌产生高活性 PCWDEs的 Ecc菌株, 通
常具有较高的致病力。
HR 测试结果显示 CSDS001 菌株能够直接诱导
烟草叶片产生典型的过敏反应, 参见图 3, 该特征与
报道的野生型软腐欧文氏菌不能诱导 HR 反应产生
不同[8]。Cui[12,13]等指出, RsmA/rsmB双因子控制系统
调控 Ecc的胞外酶、N-(3-Oxohexanoyl)-L-Homoserine
Lactone(OHL)的合成和 hrp基因的表达。Ecc71菌株
的负向调控因子 RsmA 突变体能诱导产生过敏反
应[8], 由此 Asita Mukherjee等[14]1997年首次报道了
Ecc71 含有 hrp 基因簇, 证实其中的 hrpN 基因编码
产生 Harpin蛋白能在非寄主植物如烟草上引起过敏
反应。CSDS001菌株能够直接诱导烟草叶片产生典
型的过敏反应, 表明可能 CSDS001菌株表达 Harpin
能力大于 Ecc71, 两者分泌调控系统具有差异。
2.2 hrpNCSDS001基因的克隆
通过构建 CSDS001菌株基因组文库的方法, 实
现 hrpNCSDS001基因克隆。CSDS001菌株基因组文库
含有 1,000个菌落, 每个菌落含大小约 30 kb菌株染
色体 DNA。以 Ecc71 菌株的 hrpN DNA为探针, 通
过菌落原位杂交筛选到一个含 hrpNCSDS001基因的阳
性克隆。
将含 hrpNCSDS001基因的阳性克隆质粒经不同内
切酶消化, Southern杂交显示 1.5 kb EcoR⎯片段含有
CSDS001 的 hrpNCSDS001基因, 参见图 2, 将该 DNA
片段克隆到质粒 pBluescript-IΙ SK(+), 供片段的核
苷酸序列测试。
2.3 Northern杂交结果分析
Northern 杂交结果显示在营养丰富培养基中
hrpNCSDS001 基因表达受抑制, 而在以葡萄糖或蔗糖
为碳源的基础盐培养基 (类似植物细胞基质 )中 ,
hrpNCSDS001 基因表达被激活 , 参见图 3, 证实
CSDS001 菌株的 hrpNCSDS001基因是被诱导表达, 受
外界环境如碳源、氮源、pH值因素调控。
2.4 hrpNCSDS001基因及蛋白序列分析
hrpNCSDS001基因测序委托大连宝生物公司完成,
结果显示 hrpNCSDS001基因的编码区为 1, 071 bp, 根
据核苷酸序列推测其编码蛋白含有 356 个氨基酸残
基 , 理论分子量 35.55 kDa, 理论等电点 5.5。
hrpNCSDS001基因的 GenBank登录号为 AY939927。
使用 Blast 和 Cluster X, 将 CSDS001 的
HarpinCSDS001 蛋白与 Ecc 菌株 Ecc71、SCC1 以及
E.c.subsp. atroseptica 菌株 SCRI1043 和 E. chry-
santhemi 菌株 EC16的 Harpin蛋白氨基酸进行比对
分析, 参见图 4。结果显示 HarpinCSDS001与这几个菌
株来源的 Harpin蛋白 C末端高度保守, 推测 C末端
应该是 Harpin蛋白功能区域。
HarpinCSDS001蛋白与 Ecc71 和 SCC1 菌株来源的
Harpin 蛋白高度同源 ,但是与 E.c.subsp. atroseptica
SCRI1043和 E. chrysanthemi EC16的氨基酸序列差异
较大, 说明相同菌属来源的 Harpin蛋白具有多样性。
HarpinCSDS001与 Ecc71 的 Harpin 蛋白有 6 个氨基酸
差异, 分别是 70 S-G、113 G-S、115 A-V、249 G-A、
317 R-A和 352 K-Q。值得注意的是在 C末端 Ecc71
的 Harpin 蛋白含有 RGD 三肽残基, D’Souza 等[15],
曾报道 RGD 三肽在蛋白与受体识别方面具有重要
作用而 HarpinCSDS001在相应位点为 AGD, 这与第一
个被发现的 HarpinEa蛋白相同。
2.5 HarpinCSDS001蛋白的高效表达、分离纯化及生
物学活性
12%SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示含 pT7-
hrpNCSDS001质粒的 JM109(DE3)菌经 IPTG 诱导产生
的高效表达蛋白与理论预期 HarpinCSDS001 蛋白分子
量相同, 不加 IPTG 诱导则在相应位点产生微弱的
蛋白条带, 含空载质粒 pET28a(+)的 JM109(DE3)经
IPTG 诱导无该蛋白条带, 参见图 5, 证明构建的重
组基因工程菌是成功的, 经过 ITPG诱导后, 产生高
效表达 HarpinCSDS001蛋白。
12%SDS-PAGE 凝胶电泳结果显示 , 将含
HarpinCSDS001 蛋白的包含体反复清洗后 , 溶解于盐
酸胍, 再通过透析, 能大量获得纯度达 95%以上的
HarpinCSDS001蛋白, 参见图 6。
将经过纯化的 HarpinCSDS001 蛋白注射到烟草叶
片后, 20 h 左右检测到过敏反应, 相同浓度的 BSA
和含空载质粒 pET28a(+)的 JM109(DE3)细胞破碎液
不能诱导过敏反应产生, 参见图 7。证明纯化后的

第 5期 张珏等: Hrp NCSDS001基因克隆及其表达产物诱导拟南芥基因表达谱变化的研究 633



图 1 CSDS001致病性以及诱导过敏反应
A: CSDS001 引起大白菜软腐病; B: CSDS001 诱导烟草产生过敏反应;
C: CSDS001胞外酶活性检测。
Fig. 1 The pathogenicity and eliciting HR of CSDS001
A: CSDS001 caused Chinese cabbage maceration;B: CSDS001
elicited HR in tobacco leaves;C: CSDS001 extracellular enzymatic
activities.


图 2 Southern杂交结果
1: CSDS001 菌株染色体 DNA; 2: pLARF5 载体; 3: hrpNCSDS001及
pLARF5 载体 DNA。
Fig. 2 Results of Southern blot
1: CSDS001 chromosomal DNA; 2: Vector pLARF5; 3: hrpNCSDS001
plus Vector pLARF5.


图 3 Northern杂交结果
1: CSDS001 生长于 LB 培养基; 2: CSDS001 生长于基础盐培养基
(0.5%葡萄糖); 3: CSDS001生长于基础盐培养基(0.5%蔗糖)。
Fig. 3 Result of Northern blot
1: CSDS001 grown in LB; 2: CSDS001 grown in minimal salt plus
glucose; 3: CSDS001 grown in minimal salt plus sucrose.

HarpinCSDS001 蛋白仍然具有生物学活性 , 可以用于
基因芯片分析实验。
2.6 HarpinCSDS001蛋白诱导的拟南芥基因表达时程
动力学分析
通过分析基因芯片在 5个实验组样本中检测到的
有效基因数(Present gene)和发生显著表达差异基因数
(基因表达量与对照基因表达量相比之 log ratio≤−1或
≥1), 结果显示在 HarpinCSDS001蛋白作用后的第 3 h、
12 h、24 h、36 h以及 48 h, 检测到的有效基因数相近,
发生显著表达差异基因数分别为 912、1787、2393、
1833 和 1755, 发生显著表达差异基因/有效基因百分
数分别为 6.9%、14.0%、17.5%、14.0%和 13.2%, 参
见表 1。拟南芥发生显著表达差异基因数随着
HarpinCSDS001作用后的时间逐步上升, 到 24 h 达到最
高值, 随后逐渐缓慢下降, 但相比对照和初始检测点
(3 h)仍然维持较高水平。证明 HarpinCSDS001作用于植
物体后, 诱导的植物整体反应是一个渐进过程,在 24 h
左右达到峰值, 并且 HarpinCSDS001 蛋白的作用具有时
间上的持续性, 推测这与 Harpin 蛋白诱导植物产生系
统获得性抗性等长效反应相关。
在所有发生显著表达差异的基因中, 有 208 个
基因在 5个样本均显著表达上调, 其中 96个基因为

图 4 CSDS001、Ecc71、SCC1、SCRI1043、EC16菌株 Harpin氨基酸序列比对
Fig. 4 The comparison of amino acid sequences of Harpins from CSDS001、Ecc71、SCC1、SCRI1043、EC16

634 HEREDITAS (Beijing) 2007 第 29卷



图 5 12% SDS-PAGE电泳检测蛋白
1: JM109(DE3)含 pET28a(+)经 IPTG 诱导; 2: JM109(DE3)含 pT7-
hrpNCSDS001 未经 IPTG 诱导; 3: JM109(DE3)含 pT7-hrpNCSDS001 经
IPTG诱导。
Fig. 5 12% SDS-PAGE test the proteins
l: JM109(DE3) carrying pET28a(+) with IPTG; 2: JM109(DE3)
carrying pT7-hrpNCSDS001 without IPTG; 3: JM109(DE3) carrying
pT7-hrpNCSDS001 with IPTG.

图 6 经纯化的 HarpinCSDS001蛋白
Fig. 6 Purified HarpinCSDS001


图 7 HarpinCSDS001诱导烟草过敏反应
1: 注射 200 µg/mL初步纯化的 HarpinCSDS001; 2: 注射 200 µg/mL BSA;
3: 注射含 pET28a(+)的 JM109(DE3)细胞破碎液, 蛋白浓度 200 µg/mL。
Fig. 7 HarpinCSDS001 elicited HR in tobacco
1: Was infiltrated with suspension of partially purified HarpinCSDS001
at 200 µg/mL; 2: Was infiltrated with 200 µg/mL BSA; 3: Was
infiltrated with the lysate of E.coli JM109(DE3) carrying vector
pET28a(+) at a protein concentration of 200 µg/mL.
未知功能基因, 23 个基因功能与植物激素相关, 18
个基因与植物抗逆性相关, 20 个为转录因子蛋白基
因, 37个基因功能与光合作用、能量传递相关, 其他
功能基因为 15个。在与植物激素相关基因中, 生长
素相关基因 12个, 芸苔素 1个, 赤霉素 7个, 乙烯 2
个, 细胞分裂素 1个。由此推测 HarpinCSDS001可能通
过诱导生长素、芸苔素、乙烯、细胞分裂素、赤霉
素等信号通路促进植物生长发育, 提高抗逆性。
在 208 个持续表达上调的基因中, 有几个基因
值得注意:
植 物 病 程 相 关 蛋 白 PR-1(At2g14610) 和
PR-5(At1g18250), PR-1和 PR-5是水杨酸依赖途径诱
导植物产生系统获得性抗性的标志基因, 植物产生
抗病性的生化指标[16], 这两个基因的持续表达上调
证明 HarpinCSDS001诱导拟南芥产生系统获得性抗性。
另外检测到 3个 thaumatin-like蛋白基因(At1g73620、
At2g28790、At4g38660)表达显著上调, 其功能与植
物体抵抗真菌和其他病原菌相关[17]。
基因 At2g27080 功能未知, 根据其 cDNA 序列
推测属于 Harpin诱导蛋白家族(Harpin-induced fam-
ily protein)[18], HarpinCSDS001 蛋 白 作 用 后 诱 导
At2g27080 持续表达上调初步证实 At2g27080 的表
达与 Harpin 类蛋白作用相关, 但 At2g27080 是否确
实属于 Harpin诱导蛋白家族基因以及其表达产物功
能等, 还有待进一步研究证明。
使用荧光 real-time PCR(RT-PCR)技术检测基因
At2g14610、At1g18250、At2g28790以及 At2g27080
在 5个样本中的表达情况, ∆∆Ct结果参见表 2, 从检
测结果可以看出, 实验组样本中的 4条基因∆∆Ct<0,
证明 HarpinCSDS001 处理后 , 诱导 At2g14610、
At1g18250、At2g28790以及 At2g27080基因持续表
达上调, 与芯片检测结果一致。
生物信息网站 http://datf.cbi.pku.edu.cn/提供的
Database of Arabidopsis Transcription Factors DATF
将已知和预测的拟南芥 1,827个转录因子分为 56个
家族。根据每个家族中发生显著变化的基因数, 筛
选与 HarpinCSDS001 作用关系密切转录因子家族, 筛
选条件参见文献[19]。
分析表明, 在 5 个实验组样本中, 筛选到的转
录因子家族及其种类既有相同之处又具有差异。整
个实验中, 涉及 39个转录因子家族中的基因表达发
生显著变化, 3 h组涉及基因表达发生显著变化的转
录因子家族 21个, 12 h组 32个, 24 h组 26个, 36 h

第 5期 张珏等: Hrp NCSDS001基因克隆及其表达产物诱导拟南芥基因表达谱变化的研究 635


表 1 样本有效基因数及显著表达差异基因数
Table 1 Present genes and regulated genes in the samples
时间(小时)
Time(h)
有效基因数
Present genes
(P)
显著表达差异基
因数
Regulated genes
(R)
显著差异基因
数/有效基因数
百分比
R/P(%)
3 13198 912 6.9
12 12788 1787 14.0
24 13711 2393 17.5
36 13053 1833 14.0
48 13269 1755 13.2
组 25个, 48 h组 21个。
分析表明, 有 13个转录因子家族在 5个实验组
样本中都筛选到, 分别是: ZIM、BES1、TCP、C2C2、
AP2/EREBP、WRKY、bHLH、bZIP、GARP、MYB、
NAC、HB和 C2H2家族, 这些转录因子家族主要和
以下几个方面的生理反应相关: 植物抗性相关, 如
AP2/EREBP[20]、C2H2[21]、NAC[22]、MYB[23]、bZIP[24]、
WRKY[25]家族; 植物开花相关, 如 ZIM[26]、TCP[27]、
C2H2[21]、bZIP[28]、C2C2[29]、TCP[30]家族; 植物光
合作用、生长相关, 如 BES1[31]、TCP[27]、C2C2[29]、
C2H2[21]、HB[32]、GARP[33]、bHLH[34]家族。
其他筛选到的转录因子家族所调控的基因的功
能也主要涉及植物抗性和生长发育, 但是在发生时
间和持续性上具有差异。
HarpinCSDS001 蛋白处理拟南芥后 , 处理不同的
时间所诱导发生的生理反应是有差异的, 同时可能
诱导植物体发生某些共同的生理反应, 这些生理反
应主要涉及诱导植物产生系统获得性抗性和促进植
物生长发育, 与宏观可见的 HarpinCSDS001 蛋白生物
学效应具有相关性。

表 2 RT-PCR检测样本中目的基因∆∆Ct值
Table 2 The ∆∆Ct of the 4 genes in the sample test by RT-PCR
3 h 12 h 24 h 36 h 48 h
At2g14610 −1.38 −3.88 −2.4 −4.85 −4.61
At1g18250 −2.46 −2.53 −4.88 −3.88 −3.64
At2g28790 −1.13 −1.51 −1.94 −1.46 −1.55
At2g27080 −2.46 −2.49 −2.84 −3.12 −1.2

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