全 文 ：收稿日期:2007-05-16
基金项目:河南省教育厅自然科学基金(2008A180015;2008B180007);河南师范大学青年基金项目(2007034)
作者简介:段红英(1977-),女 ,河南平舆人 ,副教授 ,博士 ,主要从事分子生物学研究。
拟南芥 DREB2A 基因的克隆及植物
荧光表达载体的构建
段红英 ,丁笑生
(河南师范大学 生命科学学院 ,河南新乡　453007)
　　摘要:以拟南芥幼苗总 RNA为模板 , 采用 RT-PCR技术扩增到 DREB2A 基因 , 并将其克隆到植物表达载体 pCAM-
BIA1304 中 CaMV 35 S 启动子与 poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明 , 成功构建了植物表达载体
pCAMBIA1304-DREB2A 。另外 ,获得了携带 DREB2A 基因的根瘤农杆菌菌株 , 为以后转基因植物工作奠定了基础。
关键词:拟南芥;DREB2A;RT-PCR;植物表达载体;根瘤农杆菌
中图分类号:Q78　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2008)03-0020-03
Cloning of Arabidopsis thaliana DREB2A Gene and Its Construction
of Its Plant Fluorescent Expression Vector
DUAN Hong-ying ,DING Xiao-sheng
(The College of Life Science ,Henan Normal University ,Xinxiang　453007 ,China)
Abstract:In the paper , total RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and was used as template to
amplify the DREB2A gene by RT-PCR.The gene fragment was subsequently cloned into plant expression vector pCAMBI-
A1304 , located between CaMV35S promoter and poly(A)terminator.Restriction enzyme analysis and DNA sequencing
confirmed that the plant expression vector pCAMBIA1304-DREB2A was successfully construed.In addition , the strain of
Agrobacterium tumefaciens carrying DREB2A gene were obtained ,providing the foundation for transgenic study of plants.
Key words:Arabidopsis thaliana;DREB2A;RT-PCR;Plant expression vector;Agrobacterium tumefaciens
　　干旱 、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育的
主要因素[ 1] ,随着一些抗逆基因的分离 、鉴定及对植
物抗性机理的深入研究 ,直接导入外源基因的基因
工程在提高植物抗逆方面具有更加广泛的前景。但
是 ,植物的抗逆性由一系列相关基因形成一个复杂
的调控网络 。因此 ,仅靠转移单个基因以提高植物
的抗逆性比较困难。而一个转录因子可以调控多个
相关基因的表达 ,所以 ,增强转录因子的调控能力以
提高植物的抗逆性是更为有效的方法和途径 。
DREB转录因子 ,如 DREB1A-C 、DREB2A-B 等 ,
能够特异地识别 、结合 DRE 或类 DRE元件 ,其功能
非常广泛 ,能够参与调控植物的干旱 、低温和高盐等
信号途径[ 2-5] 。另外 , DREB 转录因子可以被非生
物胁迫诱导 ,且在转基因植物中过量表达时能提高
植物对胁迫的抗性能力[ 6 ,7] 。因此 ,本研究应用 RT-
PCR技术对拟南芥 DREB2A 基因进行了扩增 ,并进
一步构建了植物荧光表达载体 ,为改善和提高植物
的抗逆能力奠定了基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(哥伦比亚
型)种子 、质粒 pCAMBIA1304 、大肠杆菌 XL1-Blue、农
杆菌 LBA4404等均为本院实验室保存 ,pGEM-T easy
载体购自 Promega 公司 , RT-PCR试剂盒 、各种限制
性内切酶及连接酶为大连宝生物公司产品 。
1.2　方法
1.2.1　拟南芥幼苗的培养　将拟南芥种子在无菌
水里浸泡30min后 ,加入 70%乙醇放置 30 s ,倒掉乙
醇 ,无菌水洗 3 次 ,加入 10%次氯酸钠振荡 5 min
后 ,用无菌水洗5 ～ 6次 。然后将拟南芥种子播种于
MS固体培养基上 ,在 22/18℃、16/8 h光周期条件下
华北农学报·2008 , 23(3):20-22
培养。14 d 后 , 将拟南芥幼苗小心拔出 , 保存于
-80℃。
1.2.2　拟南芥 DREB2A基因的克隆
1.2.2.1　拟南芥总 RNA的提取　采用 Trizol 法提
取拟南芥幼苗总 RNA。
1.2.2.2　引物设计　参考已发表的 DREB2A 基因
的 cDNA序列[ 8]设计引物 ,在上 、下游引物分别引入
Bgl Ⅱ和 Spe Ⅰ酶切位点 , 上游引物:5′-AACAA-
GATCTTATATGGCAGTTTATGATCAG-3′,下游引物:5′-
ACAAACTAGTTCCAGATCCAAGTAACTCAAG -3′。引 物
合成由上海生物工程公司完成。
1.2.2.3　RT-PCR扩增　以拟南芥幼苗总 RNA为
模板 ,利用一步法 RT-PCR试剂盒合成 DREB2A 基
因的 cDNA序列 。PCR反应程序为:第 1条 cDNA链
的合成 ,48℃45 min , 94℃2 min;第 2条 cDNA 链的
合成与 PCR扩增 ,94℃30 s 、52℃30 s 、72℃30 s ,30
个循环;72℃10 min。PCR产物经 1.0%的琼脂糖凝
胶电泳分析。
1.2.2.4　PCR产物的克隆与测序　通过液氮冷冻
法回收 PCR产物 ,并克隆到 pGEM-T easy 载体 。将
连接产物转化大肠杆菌 XL-1Blue ,利用菌落 PCR筛
选白斑 ,阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。
1.2.3　植物表达载体的构建
1.2.3.1 　植物表达载体的重组 　将扩增的
DREB2A基因 cDNA 序列和 pCAMBIA1304载体的质
粒DNA分别使用 Bgl Ⅱ/Spe Ⅰ限制性内切酶酶切 。
经1.0%琼脂糖电泳后通过冻融法回收相应的片
段 ,在 T4DNA 连接酶作用下于 16℃过夜连接 ,然后
通过热激法将连接产物转入大肠杆菌 XL1-Blue 。植
物表达载体 pCAMBIA1304-DREB2A的构建见图 1。
1.2.3.2　重组表达载体的鉴定及序列分析　提取
阳性克隆的质粒 DNA用 Bgl Ⅱ/Spe Ⅰ限制性内切
酶酶切 ,然后挑选酶切鉴定正确的阳性克隆送至上
海生工测序。
1.2.4　重组载体转入农杆菌及其鉴定　通过冻融
法将构建成功的重组质粒载体转入农杆菌
LBA4404 ,然后提取阳性克隆的质粒 DNA ,通过 PCR
鉴定重组质粒载体是否转入农杆菌 。
图 1　pCAMBIA1304-DREB2A植物表达载体的构建
Fig.1　Construction of plant expression vector
pCAMBIA1304-DREB2A
2　结果与分析
2.1　DREB2A 基因的克隆
根据发表的 DREB2A 核酸序列设计引物 ,通过
RT-PCR从拟南芥中扩增到一个 1 kb左右的片段
(图 2)。将 PCR产物与克隆载体 pGEM-T easy 连接
转化大肠杆菌 ,通过白斑筛选获重组质粒 ,并经 Bgl
Ⅱ/Spe Ⅰ酶切鉴定 ,然后挑选酶切鉴定正确的阳性
克隆进行测序 。测序结果表明 ,该基因与文献报道
的序列相比未发生改变 ,说明通过 RT-PCR已成功
克隆到 DREB2A基因。
图 2　DREB2A cDNA的 RT-PCR扩增
Fig.2　RT-PCR amplification of DREB2A cDNA
2.2　植物表达载体的构建及鉴定
利用Bgl Ⅱ/Spe Ⅰ双酶切DREB2A 基因的PCR
产物和 pCAMBIA1304表达载体 ,回收酶切后的载体
及目的片段 , 16℃连接过夜 。将连接产物转化大肠
杆菌 XL1-Blue ,涂布于 LB 固体平板(含 50 μg/mL
Kna)。提取阳性克隆的质粒 DNA ,经 Bgl Ⅱ/ Spe Ⅰ
双酶切后产生 2个条带 ,其大小分别约为 1 kb和 13
kb(图 3),表明载体中已经带有 DREB2A 基因的目
的片断。另外 ,测序结果也表明重组质粒的外源插
入片段的序列正确 。上述结果证实 , DREB2A 基因
已经成功构建到植物表达载体 pCAMBIA1304 ,并将
该载体命名为 pCAMBIA1304-DREB2A。
图 3　pCAMBIA1304-DREB2A表达载体质粒 DNA的 BglⅡ
和 SpeⅠ酶切鉴定
Fig.3　Restriction enzyme analysis of pCAMBIA
1304-DREB2A plasmid DNA with BglⅡ and Spe Ⅰ
2.3　根瘤农杆菌的转化及鉴定
提取载体 pCAMBIA1304-DREB2A 的质粒 DNA ,
通过冻融法转入农杆菌 LBA4404 ,在 YEB固体培养
基(含 50 μg/mL Rif , 50 μg/mL Kna)上筛选转化子。
3期 段红英等:拟南芥 DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建 21　
提取阳性单克隆的质粒 DNA ,以其为模板进行 PCR
检测 ,结果显示 ,PCR扩增产物约为 1 kb ,与预期相
符 ,表明已经将重组的植物表达载体 pCAMBIA1304-
DREB2A转入农杆菌 LBA4404(图 4)。
图 4　pCAMBIA1304-DREB2A表达载体转化农杆
菌 LBA4404的部分阳性克隆的 PCR鉴定
Fig.4　PCR identification of some Agrobacterium
tumefaciensLBA4404 transformed with
pCAMBIA1304-DREB2A
3　讨论
近年来 ,利用基因工程提高植物抗逆的研究已
经取得很大进展 。尽管抗性基因的超表达能够提高
植物对胁迫的抵抗能力 ,而一个转录因子的超表达
能够激活多个相关基因的表达。因此 ,利用转录因
子改良植物的抗逆性非常有前景。很多研究表明 ,
DREB转录因子和 DRE 元件在干旱 、高盐及低温胁
迫信号传递中起重要作用 ,其可以调控多个与干旱 、
高盐及低温耐性有关的功能基因的表达 。因此 ,利
用DREB转录因子改良植物的抗逆性能获得较为理
想的综合效果[ 8] 。本研究从拟南芥中克隆了编码转
录因子的 DREB2A 基因 ,并构建了相应的植物表达
载体 ,为通过 DREB2A 表达量的增加改善植物的抗
逆性提供了一种可能的途径。
本研究以拟南芥幼苗总 RNA为模板 ,利用一步
法 RT-PCR克隆了 DREB2A基因的 cDNA ,将其正向
插入载体 pCAMBIA1304中构建了植物荧光表达载
体pCAMBIA1304-DREB2A。一步法 RT-PCR避免了
两步法中分管操作可能带来的污染 ,提高了 cDNA
的扩增效率 。本研究选用植物表达载体 pCAMBI-
A1304 ,并将 DREB2A 基因构建到 CAMV35S启动子
下游 ,使得 DREB2A 基因进行组成型表达 ,从而提高
下游目的基因的表达 ,增强植物的抗逆性。另外 ,植
物表达载体 pCAMBIA1304携带有 gfp 报告基因 ,可
以间接观察 DREB2A在植物体内的表达情况 。绿色
荧光蛋白(Green fluoresent protein ,GFP)是从一种多
管水母属(Aequorea victoria)中分离出来的一种天然
发光蛋白质 ,在 gfp 基因被分离出来后 ,应用它作为
报告基因所涉及的研究领域越来越广泛 。与其他报
告基因相比 ,GFP 蛋白具有以下优点:①灵敏度高 、
易检测 ,且无细胞毒性;②在活体内的表达无种属特
异性;③只需用光激发即可观察 ,不需要任何底物 ,
操作简便快捷;④GFP 蛋白比较稳定 ,在植物体中能
够稳定存在;⑤便于早期筛选转基因材料[ 9 , 10] 。自
从 Chalfie等[ 11]首次报道 GFP 在大肠杆菌中成功表
达后 ,迄今为止 , gfp 已被用作拟南芥 、水稻 、玉米 、
烟草 、棉花 、和小麦等植物转基因研究的报告基
因[ 12-16] 。总之 ,本研究已成功构建植物荧光表达
载体 pCAMBIA1304-DREB2A ,为下一步研究提供了
简便的判断手段。但是构建的植物荧光表达载体能
否在植物中成功地表达 DREB 转录因子 ,仍有待进
一步研究 。
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