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中国科学 C 辑:生命科学 2009 年 第 39 卷 第 2 期: 228 ~ 236
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228
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
红光下拟南芥光敏素调节基因的蛋白质鉴定与
mRNA 分析
李旭† , 杨粤军† , 李妍, 王婕, 萧小鹃, 郭新红, 唐冬英, 刘选明*
湖南大学生命科学与技术研究院, 生物能源与生物材料研究中心, 长沙 410082
† 同等贡献
* 联系人, E-mail: sw_xml@hnu.cn
收稿日期: 2007-12-23; 接受日期: 2008-06-12
国家“985 工程” (批准号: 200501)、湖南省自然科学基金(批准号: 06FJ3152)、湖南省科技计划(批准号: 06FJ3152)、湖南省教育厅科研基
金(批准号: 08B049)和国家自然科学基金(批准号: 30600368, 30770200 和 30871325)资助项目
摘要 光敏素是植物体内一种重要的光受体家族, 它们可介导植物对外界红光
和远红光的应答, 在植物的生理发育过程中发挥重要作用. 基因芯片分析结果表
明, PHYA 和 PHYB在转导红光信号至光应答基因的过程中起关键作用. 为了获得
与 PHYA, PHYB 相关的光应答基因, 本研究采用双向电泳技术比较分析了在持续
红光下生长 7 天的拟南芥光敏素双突变体 phyAphyB 和野生型 col-4 幼苗的全蛋白
图谱. 采用基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)进行肽质谱指
纹图谱分析, 成功鉴定到了 32个差异蛋白点. 选取其中的 10 个蛋白点, 对应于 10
个不同的基因, 进行了 RT-PCR 分析, 并用 Q-PCR 对其中的 2 个基因表达情况进
行了验证. 结果表明, 光敏素可能从 mRNA 水平或蛋白质水平来调节基因的表达.
蛋白质组学分析为寻找光敏素依赖基因提供了新的途径.
关键词
拟南芥
光敏素双突变体 phyAphyB
蛋白质组
RT-PCR
Q-PCR
植物能够感受光从而进行生理和发育上的调整,
并控制光形态建成[1,2]. 目前在植物中已发现的光受
体主要有 3类: 感受红光/远红光的光敏素家族, 蓝光
/UVA 受体隐色素以及向光素[3]. 其中对光敏素研究得
较为充分, 先前的报道显示光敏素具有激酶活性[4~6].
模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组至少包
含 5 种功能重叠和冗余的光敏素: PHYA, PHYB,
PHYC, PHYD 和 PHYE[7~9]. PHYA 和 PHYB在介导远
红光和红光对下胚轴延伸以及根的生长抑制作用中
占主要地位[10~12]. 除了生长抑制以外, 光敏素还介导
红光和远红光调节植物生理应答和细胞活性, 例如,
促进种子萌发、子叶扩展、参与去黄化发育过程, 并
能参与生物钟的调节以及控制植物开花时间 [13~18].
先前的研究表明光敏素能够改变核质分配, 并与转
录因子 PIF3 相互作用[19]. 这就提出一种可能, 光敏
素可能通过与转录因子的相互作用从而调控基因表
达. 然而, 对于光敏素是否能通过调控基因转录后水
平或翻译后修饰改变蛋白质水平的表达, 目前还不
是很清楚. 光敏素进核的机制以及在细胞质中的作
用还有待进一步研究. 另外, PHYA 和 PHYB 可调控
很多生理过程, 但其共同信号途径所知甚少.
本研究采用比较蛋白质组学方法研究了生长在
持续红光下的拟南芥光敏素突变体 PHYAPHYB 与野
生型的蛋白表达情况. 与野生型相比, 突变体在红光
中国科学 C 辑: 生命科学 2009 年 第 39 卷 第 2 期
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下呈现出了不同的蛋白质表达谱.
1 材料与方法
1.1 植物生长条件和光源
实验材料拟南芥光敏素突变体 phyAphyB 和
col-4(WT)均为哥伦比亚生态型. 种子为美国加州大
学洛杉矶分校林辰涛教授惠赠.
将种子播种在固体培养基上, 于黑暗下 4℃春化
4 天, 然后转移到人工气候培养箱持续红光下生长 7
天, 生长温度为23~25℃(波长660 nm, 半幅宽20 nm).
红光光照强度用 Li-250 量子光度计测量 (Li-Cor,
Lincoln, NE).
1.2 拟南芥幼苗总蛋白的提取
取生长在红光光强(80±2) µmol·m−2·s−1下 7 天的
拟南芥光敏素突变体 phyAphyB 和 col-4(WT)幼苗,
在液氮中研磨成粉末, 然后将粉末悬浮在含有 10%
三氯乙酸(TCA)和 0.3% DTT 的预冷丙酮溶液中, 在
−20℃冰箱沉淀过夜. 然后在 4℃条件下 34900×g 离
心 1 h. 弃上清, 重悬沉淀于含 0.07% β-巯基乙醇的
预冷丙酮溶液中, 4℃条件下 34900×g 离心 30 min, 弃
上清, 重复一次, 最终得到的沉淀冷冻干燥后置−80℃
下保存备用. 蛋白粉末先溶于裂解液(8 mol/L 尿素,
4% CHAPS, 40 mmol /L Tris 和 2 mmol/L PMSF)中,
振荡混匀, 30 min 后加入 2 倍量的样品溶解液(8
mol/L 尿素, 4% CHAPS, 2% pharmalyte 3~10, 1%
DTT)混匀, 充分溶解, 18900×g 离心 10 min, 取上清
液. 蛋白浓度通过 Bradford 试剂检测.
1.3 双向凝胶电泳
双向凝胶电泳参照文献[20]方法进行. 在 450 µg
蛋白样品中加入水化液(6 mol/L 尿素, 2 mol/L 硫尿,
2% CHAPS, 3 mg/mL DTT, 0.5% IPG 缓冲液(pH
3~10), 痕量溴酚蓝)充分混合至总体积为 450 µL, 将
IPG 干胶条(pH 3~10, 24 cm)放入胶条槽, 在 IPGphor
电泳仪上水化和等电聚焦. 在 20℃条件下自动进行,
总电压时间为 69890 Vh, 其中水化在 30 V 低电压进
行 13 h, 然后 500 V 下进行 1 h, 1000 V 下进行 1 h,
最后稳定在 8000 V 下进行. 等电聚焦结束后取出胶
条, 加入平衡液 A(50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.8, 6
mol/L 尿素, 30%甘油, 2%SDS, 1%DTT, 痕量溴酚蓝)
室温平衡 15 min, 然后于平衡液 B 中(50 mmol/L
Tris-HCl, pH 8.8, 6 mol/L 尿素、30%甘油、2%SDS、
2.5%碘乙酰胺、痕量溴酚蓝)平衡 15 min. 将平衡后
的 IPG 干胶条移至第二向 10%分离胶上端, 并在酸性
端加低分子质量 SDS 标准蛋白质, 排净气泡, 用
0.5%的琼脂糖凝胶封固胶条. 先用2.5 W/胶恒功率电
泳, 30 min 后换用 15 W/胶恒功率电泳.
1.4 蛋白质染色与图像分析
按照文献[21]方法对凝胶进行银染, 银染后的凝
胶通过 UTA-1100 扫描仪适配器获取图像 , 用
PDQuest7.1 通过分析软件对图像进行背景消减、斑点
检测、匹配和获取斑点位置坐标等. 数字化信号相对
于总信号进行均一化. 统计学分析证实了实验的高
度重复性.
1.5 蛋白质的原位酶解
从双向电泳凝胶上切取 1.8 倍以上的差异蛋白质
点(经 t-test 统计分析, P<0.05)按照文献[22, 23]方法,
还原烷基化, 然后用胰蛋白酶消化. 简要过程如下:
先用双蒸水将蛋白质点洗 3 次 , 用 15 mmol/L
K3Fe(CN)6 和 50 mmol/L Na2S2O3脱色; 然后加入 50
µL 还原溶液(10 mmol/L DTT/100 mmol/L NH4HCO3),
置 37℃保温 1 h, 室温冷却后, 去掉过量的液体, 迅
速加入烷基化试剂(55 mmol/L 碘乙酰胺/100 mmol/L
NH4HCO3), 室温下暗处放置 30 min, 吸走多余的液
体, 冷冻干燥. 取少量酶解工作液(0.02 g/L胰蛋白酶,
25 mmol/L NH4HCO3, 10% ACN)于胶块中, 37℃水浴
消化过夜. 脱盐(ZipTipTM column, Millipore, Bedford,
MA, USA)后的蛋白质进行质谱分析.
1.6 MADLI-TOF-TOF 肽质指纹图分析及数据
搜索
参照文献[24]中的方法, 将酶解后的肽片段点样
于质谱点样板上, 置于空气中自然风干. 使用美国应
用生物系统公司的 STR-MALDI-TOF 质谱仪对制备
好的样品进行分析, 激光波长 337 nm. 采用反射/延
迟抽出模式, 得到肽质量指纹图 PMF 和 LIFT. 离子
源加速电压 1 为 25 kV, 加速电压 2 为 8 kV, 脉冲宽
度 3 ns, 离子延迟提取 500 ns, 真空度 0.53×10−7 kPa,
质谱信号单次扫描累加 100 次, 正离子测定, 质谱使
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用基质峰和胰蛋白酶自动降解片段离子峰做为内部标
准校正. 获得的混合物肽片段数据通过 Expasy 在中
国的镜像站点CBI(http://www.pku.edu.cn)的 Peptident
软件进行查询. 查询条件: 肽质谱指纹图中的肽片段
质量控制在 800~4000 kD, 表观 pI 的误差范围为
±0.5(pH单位), 表观Mr的误差范围为±2%, 肽片段分
子量最大容许误差控制在±0.5, 酶解片段不完全选择
为 2 个, 物种来源选择拟南芥, 离子选择[M+H]+和
AVERAGE, 半 胱氨 酸选 择为 脲 甲 基半 胱 氨 酸
(Carbamidomethyl-Cys), 被选择的片段峰信号均应较
强, 为基线宽度的 1 倍以上.
1.7 RT-PCR 分析
用植物 RNA 提取试剂盒提取光敏素突变体
PHYAPHYB 和 col-4 的总 RNA, 取 2 µg 总 RNA 逆转
录成 cDNA[25]. 选取 8 个蛋白质点对应的基因做半定
量 RT-PCR 分析, 并对其中的 2 个进行定量分析.
cDNA 稀释 10 倍, 取 1 µL 于 20 µL PCR 反应体系.
RT-PCR 均重复 3 次以上, 图中给出的为具有代表性
的电泳图. SYBR green 序列检测试剂盒 (Invitrogen,
USA), Taq 聚合酶 , 正反向引物被用于 iCycler
iQ(stratagene)检测系统的定量分析 . 定量 PCR 在
Mx3000p (Stratagene)上进行, 反应程序为: 95℃, 10
min; 95℃, 30 s, 55℃, 30 s, 72℃, 30 s, 40 个循环;
ACT2 的表达水平被用作均一化的内参. 半定量和定
量的引物如下:
Act2F
(5′-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3′)
Act2R
(5′-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3′)
CAB2F
(5′-TAAGGCTACCGACCCAGAGG-3′)
CAB2R
(5′-CAGTAGCGATGGCTTGAACG-3′)
#75 (AT1G20020)F
(5′-GATAAGCAGAGAACAAGCGAAC-3′)
#75 (AT1G20020)R
(5′-AATCAAACCAGTCAATACCGTC-3′)
#52 (AT4G33010)F
(5′-GGTTTTATTGGAGCGGATGTGTG-3′)
#52 (AT4G33010)R
(5′-GTGCTGTCTTCTCGGGTTGTG-3′)
#58 (AT5G67360)F
(5′-GGAGCACCGTTACGAGCTACAC-3′)
#58 (AT5G67360)R
(5′-AACCACCGAGCCAACAGACT-3′)
#84 (AT1G19570)F
(5′-CAAGTGGGTGACTGATTCCGAC-3′)
#84 (AT1G19570)R
(5′-AGCTCAACAAGCAAGGCATGTT-3′)
#11 (AT3G08030)F
(5′-CTTGCTACTCATCTGTGGTGCT-3′)
#11 (AT3G08030)R
(5′-TGTTTTCTTCATGTCGGTTTTC-3′)
#118 (AT2G22780)F
(5′-ACCTCCTTGCTCGTTCACTCA-3′)
#118 (AT2G22780)R
(5′-GCATCACCTCGTAGACCCCTG-3′)
#73 (AT3G63140)F
(5′-CAATGGCAAGGATTTGGATACTGT-3′)
#73 (AT3G63140)R
(5′-GTGAGGAGGTTGTTCGGTGGACT-3′)
#34 (AT5G17710)F
(5′-CACTCTCTCGCCGAGCTTCTCTC-3′)
#34 (AT5G17710)R
(5′-CCTCAGCACTGGCATTTTCATTC-3′)
#28 (AT1G16880)F
(5′-TTGTTTATGACTGTGAGACGAA-3′)
#28 (AT1G16880)R
(5′-GCTTTACTTGACACTATGAATGC-3′)
#53 (AT2G26080)F
(5′-TTATCTTGCCAATCTCGTAT-3′)
#53 (AT2G26080)R
(5′-CAGCAGTGTTCTTGAATCCT-3′)
2 结果与讨论
2.1 双向电泳和凝胶图像分析
我们提取了持续红光下 7 天大小幼苗全蛋白质
组, 通过双向电泳(蛋白上样量为 450 µg)得到了蛋白
质表达图谱. 在相同实验条件下, 制备 6 块胶, 3 块野
生型, 3 块突变体. 通过严格一致的操作程序得到了
重复性很高的拟南芥光敏素突变体 phyAphyB 和野生
型 col-4 的幼苗全蛋白双向电泳图谱(图 1), 通过
PDQuest 软件对蛋白点进行匹配, 并与背景进行均一
化. 幼苗蛋白质点多数分布在偏酸性区域(pH 4~8),
分子量 20~80 kD 范围内, 在 pH 5~7, 分子量 24~70
k D 范围内尤为集中 . 通过分析发现 , 突变体
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phyAphyB和野生型 col-4共有67个差异蛋白质点, 质
谱共鉴定到 32 个蛋白点, 分别对应 30个不同的基因,
其中点 84 与 86 为同一蛋白, 点 9 和 70 为同一蛋白,
它们可能是相同基因由于不同的翻译后修饰导致的.
图 1 中给出的是具有代表性的双向电泳图, 鉴定到的
蛋白点用数字标出.
2.2 蛋白质的功能分类与亚细胞定位
鉴定到的蛋白按功能分成 7 类(图 2): 代谢相关
蛋白(34.4%), 能量相关蛋白(6.3%), 具绑定或辅助功
能的蛋白(18.8%), 抗胁迫和毒素类蛋白(15.6%), 储
存蛋白 (6.3%), 蛋白质合成、修饰、运输类蛋白
(3.1%), 和未知蛋白(15.6%). 我们也依据亚细胞定位
对这些蛋白进行了分类(图 2(B)), 超过 40%的蛋白定
位在叶绿体和线粒体中. 另外还有 21.9%的蛋白未定
位. (表 1, 图 2).
2.3 红光下 PHYAPHYB 突变影响了基因蛋白水
平的积累
在鉴定到的 32 个蛋白中, 有 15 个蛋白点(26, 14,
1, 55, 52, 53, 18, 37, 34, 73, 75, 62, 13, 28 和 33)在
phyAphyB 缺失后其积累程度下降. 17 个蛋白点(118,
102, 9, 70, 66, 63, 111, 86, 84, 81, 58, 117, 2, 115, 11,
83 和 5)表达水平在 phyAphyB 突变体中表现出更高
程度的积累(表 1).
甘氨酸脱羧酶(GDC)是植物初级代谢、光呼吸和
一碳代谢中的重要酶. 拟南芥基因组中包含 2 个
(GDC)P-蛋白基因[26], AtGLDP1(at4g33010)和 AtGLDP2
(at2g26080), 对应我们鉴定到的 52 和 53 号蛋白. 与
野生型相比, phyAphyB 突变体中这 2 个蛋白的表达
水平下降. 据报道, 这 2 个 P-蛋白基因的同时敲除会
导致植株在非光响应环境下无法存活[27]. 该蛋白在
图 1 红光下野生型与光敏素突变体蛋白质组学比较
持续红光(80 µmol·m−2·s−1)下 7 天大小的拟南芥野生型和突变体幼苗全蛋白质银染胶, 双向电泳图(A)为蛋白质分子量,
箭头指出的是在野生型和突变体之间变化的蛋白点, P <0.05
图 2 蛋白质的功能分类和亚细胞定位
(A) 功能分类; (B) 亚细胞定位
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表 1 红光下拟南芥野生型与突变体 phyAphyB 之间差异表达的蛋白 a)
分子量/等电点
蛋白点 登录号 蛋白名称
比率
phyAphyB
/WT 测量值 计算值
覆盖率
(%) 蛋白定位
能量蛋白
26 AT4G26530 果糖二磷酸醛缩酶 0.20 38555/5.65 38294/5.53 39 未知
118 AT2G22780 假定的苹果酸脱氢酶前体 9.31 37841/8.11 37466/8.06 41 过氧化 物酶体
代谢蛋白
14 AT1G70410 碳酸酐酶 0.22 28737/6.66 30836/7.11 21 未知
1 AT3G09260 Beta-葡糖苷酶 0.27 60348/6.95 59721/6.91 34 内质网
55 AT1G68560 Alpha-木糖苷酶 0.47 102961/6.31 102400/6.76 25 细胞膜和细胞壁
102 AT1G54870 短链脱氢酶类似物 6.50 37084/8.78 36765/8.75 33 叶绿体
52 AT4G33010 假定的甘氨酸脱氢酶 0.58 113822/6.51 112926/6.98 27 线粒体
9 AT2G30970 天冬氨酸转移酶 1.92 48069/8.36 47758/8.34 54 线粒体
70 AT2G30970 天冬氨酸转移酶 1.87 48069/8.36 47758/8.34 26 线粒体
66 AT5G46290 3-氧酰 l-[酰基载体蛋白] 合成酶 I 2.12 50895/6.52 50414/8.15 42 叶绿体
63 AT4G13930 甘氨酸羟甲基转移酶 1.82 52141/6.8 51718/7.25 33 细胞质
53 AT2G26080 甘氨酸脱氢酶 0.32 114672/6.18 113777/6.63 15 线粒体
18 AT2G47730 谷胱甘肽转移酶 (GST6) 0.47 29270/8.5 29232/8.93 26 叶绿体
抗胁迫和毒素蛋白
111 AT3G58450 胁迫蛋白 1.82 22584/6.09 22371/6.51 16 未知
37 AT3G11630 2-半胱氨酸脱氢酶 BAS1 0.53 29188/6.92 29092/7.56 23 未知
86 AT1G19570 脱氢抗坏血酸还原酶 2.29 23740/5.56 23641/5.79 38 线粒体
84 AT1G19570 脱氢抗坏血酸还原酶 2.76 23740/5.56 23641/5.79 39 线粒体
81 AT1G07890 L-抗坏血酸过氧化氢酶 1 (APX1) 2.33 27788/5.85 27561/6.03 55 细胞质
蛋白质合成、修饰、运输蛋白
58 AT5G67360.1 枯草杆菌蛋白酶类似前体 r 1.93 80050/5.91 79416/6.30 18 细胞外区
绑定或辅助功能蛋白
34 AT5G17710
EMB1241, Co-伴侣 grpE 家族蛋白
类似物 0.31 35756/4.57 35721/4.25 24
叶绿体
73 AT3G63140 mRNA 绑定蛋白 0.28 44074/8.54 43930/8.73 36 质体
75 AT1G20020 铁氧化还原蛋白 0.40 41484/8.51 41168/8.50 18 叶绿体
2 AT1g56070 延伸因子 EF-2 4.10 95098/5.89 93892/6.16 23 未知
62 AT4G16155 二氢硫辛酰胺脱氢酶 2 0.45 60564/7.29 60146/7.66 28 叶绿体, 细胞质
117 AT1G18080 鸟嘌呤核苷酸绑定蛋白亚基 beta-42 12.02 36124/7.62 35748/7.80 25 异源三聚 G-蛋白复合体
储存蛋白
13 AT1G03880 12S 种子贮存蛋白 CRB 前体 0.09 50869/6.62 50559/6.99 20 内膜系统
115 AT5G44120 12S 种子贮存蛋白(CRA1) 2.40 41178/6.62 52596/7.88 16 内膜系统
未分类蛋白
28 AT1G16880 尿苷酰转移酶相关蛋白 0.00 31446/4.98 31295/4.74 34 Ch 叶绿体
33 AT3G27590 表达蛋白 0.46 10324/11.87 10330/12.37 29 线粒体
11 AT3G08030 表达蛋白 1.80 34907/7.18 39066/7.63 29 内膜系统
83 AT3G16430 Jacalin 血凝集蛋白家族 3.30 32213/5.86 32234/6.24 25 未知
5 AT5G47380 假定蛋白 At5g47380 5.21 77350/9.53 70151/10.02 22 未知
a) 32 个蛋白点的积累水平在野生型和突变体之间呈现出显著的差异, 相对蛋白丰度由突变体中表达量与野生型表达量的比值表示
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光呼吸中的重要作用、以及在 phyAphyB 敲除后其积
累水平下降, 暗示它们有可能参与了光敏素介导的
红光信号传导.
谷胱甘肽-S-转移酶 6(GST6, 蛋白点, 18)是植物
GST基因家族 53个成员中的一个, 参与了一些植物应
激反应. 最新研究显示, FIP1, GST 家族中的另一成员,
参与了 PHYA 介导的远红光下信号传导途径[28]. 这一
发现表明, GST成员有可能参与光信号传导. GST6 的
表达在红光下 phyAphyB 突变中下降. 我们推测光敏
色素或其他光信号元件调节GST6的表达. 可惜的是,
迄今为止, 没有任何关于 GST 成员参与红光信号传
导途径分子水平的报道.
铁氧蛋白还原酶-NADP(+)还原酶(FNR2, 蛋白
点, 75)参与电子转移, 具备 NADPH 脱氢酶活性.
FNR2 蛋白水平在 phyAphyB 突变体中降低了 2.5 倍.
这与先前所报道的光通过光受体调控NADPH脱氢酶
转录影响呼吸电子转移链一致[29,30].
2 种参与氨基酸代谢的蛋白(蛋白点, 63, 70/9),
在野生型和突变体中也表现出了不同程度的变化.
延伸因子 EF-2 (蛋白点, 2)蛋白水平上调. 以往的研
究表明, 在 EF-2 功能缺失突变体中新的蛋白质合成
受到阻碍, 特别是在冷胁迫中[31]. 增加的延伸因子能
够促进蛋白质的合成. 腺嘌呤-核苷酸转换因子(蛋白
点, 34), 类似于合作伴侣 grpE 家族蛋白, 这类蛋白能
参与蛋白质的正确折叠或稳定. 它能避免变性蛋白
的聚集, 并与其他因子相互作用促进蛋白质重新折
叠[32,33]. PHYAPHYB 的突变导致该蛋白表达水平的
减少. 这些结果揭示了光信号传导途径中蛋白质的
合成、修饰或降解的关键作用, 光敏素可能通过与这
些因子的相互作用从而在转录后调控以及翻译后修
饰中调节基因的表达.
异源三聚G-蛋白包含 3个亚基: α, β和 γ, 先前的
研究表明该蛋白在光敏素 A 和光敏素 B 的下游行使
其功能[34~36]. 最近的研究证实 Gα 过表达能够加强对
红光的应答, 抑制了下胚轴的生长, 但这些表型依赖
于 PHYA 和 PHYB 的功能[37]. 本实验鉴定到了 Gβ 亚
基(蛋白点, 117), 由 At1g18080 编码, 它的蛋白积累
水平在光敏素突变的情况下增加了 12.02 倍. Gβ缺失
突变体的部分去黄化幼苗呈现出短的下胚轴 [38~40],
与红光下的 phyAphyB 突变体相反, 这说明光敏素与
G-蛋白在对下胚轴延伸的调控中有可能呈现对抗效
应. 结果表明光敏素可能通过抑制 Gβ 亚基的表达从
而调节下胚轴的延伸. 最近的一些报道也揭示了光
敏素与 G-蛋白之间的联系, 如光敏素的缺失导致茉
莉酸的过量生成[41], G-蛋白参与了茉莉酸信号调节,
是植物中茉莉酸途径直接或间接的增强子[42]. G-蛋白
表达量在光敏素缺失时增加的这一现象, 将光敏素、
G-蛋白和茉莉酸信号联系起来了, 当然, 这一假设还
需要更进一步的研究. 定位在纤维素和细胞壁的 α-
木糖苷酶(蛋白点, 55)参与细胞壁的扩张和建成. 野
生型中该酶蛋白质水平是突变体的 2 倍. 我们知道,
光刺激生长部分是由于细胞的扩张 [43], 暗示细胞壁
的生物合成是下胚轴延伸的决定因子之一. 光敏素
可能通过调控细胞壁成分的合成从而控制植物生长.
另外, 细胞壁的生物合成也依赖于细胞内的碳源[44],
一些与碳源代谢相关的蛋白如: 葡糖苷酶(蛋白点, 1),
碳酸酐酶(蛋白点, 14), 果糖二磷酸醛缩酶(蛋白点,
26), 假定的苹果酸脱氢酶(蛋白点, 118)以及葡萄糖
和核糖醇脱氢酶同源蛋白 1(蛋白点, 102)在野生型与
光敏素突变体中呈现出了不同程度的改变. 这些蛋
白表达水平的改变支持了红光下突变体与野生型下
胚轴的差异.
2.4 红光下 PhyA 与 PhyB 影响基因 mRNA 水平
的表达
为了研究这些光敏素相关基因蛋白水平的变化
是否由转录水平的改变导致, 我们选取了 8 个基因进
行半定量分析(蛋白点, 11, 28, 34, 52, 53, 58, 73, 75,
84 和 118). 采用已被广泛研究的叶绿素 a/b 绑定蛋白
2(CAB2)作为对照 , 本研究的结果显示 CAB2 的
mRNA表达水平在phyAphyB突变体中明显下降, 这与
先前的报告一致: 光敏素促进 CAB2 的转录[45]. 挑选
的 8个基因蛋白质与mRNA的表达情况显示在图 3中.
52 号蛋白点对应的基因, mRNA 丰度在突变体
中急剧下降, 与蛋白水平的改变一致. 先前的报道显
示在黑暗下生长的幼苗暴露于红光 1 h 后, AT4g33010
(蛋白点, 52)的表达量受 phyA 和 phyB 上调[46]. 我们
的实验结果显示该基因的表达在持续红光下也受到
phyA 和 phyB 的诱导. 此外, 我们选定 At4g33010 做
定量分析表明, 野生型中 mRNA 的水平是突变体的
李旭等: 红光下拟南芥光敏素调节基因的蛋白质鉴定与 mRNA 分析
234
图 3 差异蛋白 mRNA 表达水平与蛋白表达水平的比较
(A) 双向电泳中差异蛋白点 118, 52, 53, 75, 73, 34, 84 及 28 的放
大图谱; (B) 半定量分析差异蛋白 mRNA 相对表达情况. 以 CAB2
基因的表达情况作为对照; (C) 定量 PCR 分析蛋白点 52 和 118
在野生型和光敏素突变体中的表达情况
11.91 倍(图 3(C)). 还发现了一个 mRNA 绑定蛋白
(At3g63140, 蛋白点, 73). 有趣的是, 它在菠菜中的
同源体被认为是一种 RNA 核酸酶[47]. 基因微阵列研
究结果发现这个基因受红光诱导(R/D g:1.999). 如图
3 所示, 其 mRNA 表达水平急剧下降, 这与突变体中
减少的蛋白质丰度一致. 数据表明, 该基因表达受光
敏色素调控. 28 号蛋白点仅在野生型中有表达, 在
phyAphyB 突变体中几乎检测不到, 其 mRNA 水平在
突变体也下降. 此外, 蛋白点 34, 53, 58 和 75 对应的
基因 mRNA 表达水平在 phyAphyB 突变体中明显下
降 , 与蛋白质的变化情况一致 . 有趣的是 , 通过
Softberry-NSITEP 对这些基因启动子进行分析, 发现
在蛋白点 52, 28 和 34 的 5′-UTR 序列中存在 G-box
序列 CACGTG—转录因子 PIF3 目标元件的核心序
列[48]. 结果表明, 红光下光敏素有可能通过与转录因
子 PIF3 相互作用而调控这些基因 mRNA 的表达.
然而, 也有一些基因 mRNA 的表达情况与蛋白
质变化相反. 如蛋白点 11 号与 118 号, mRNA 水平在
野生型与突变体间无变 化 , 但是蛋 白水平在
phyAphyB 突变体中上调. 我们采用了定量 PCR 对
118 蛋白点对应的基因进行分析, 结果与半定量一致.
如图 3 所示, 蛋白点 84 号对应的基因启动子区也含
有 G-box, 其蛋白表达在 phyAphyB 缺失后增加了近
3 倍, 与 mRNA 变化情况相反. 这些差异可能是由于
RNA 和蛋白质不同的稳定性以及更新速度所造成的,
也可能是通过翻译后修饰如磷酸化. 蛋白质等电点
的改变等引起的变化. 这一推测支持了细胞质中光
敏素可能行使的功能.
3 结论
差异蛋白显示了光受体突变后引起的最终改变.
我们选取这些差异蛋白检测它们对应的 mRNA 水平,
证实这些改变是否发生在转录或是转录后水平. 我
们的观察暗示, 光敏素介导了红光对基因 mRNA 及
蛋白水平表达的调控. 至此, 许多假定的信号成员已
被陆续发现, 但是它们分子水平的功能还不是很清
楚. 对于光敏素是如何感受光, 将光信号转变为基因
和蛋白表达的变化, 以及这些改变是否是植物响应
外界光环境的变化而作出的生理上的修饰, 我们不
得而知. 本研究提供了 phyA 和 phyB 影响蛋白表达的
总的图谱, 促进了红光下幼苗蛋白质组学的研究.
致谢 在此特别感谢加州大学洛杉矶分校林辰涛教授对此工作的指导. 感谢湖南师范大学梁宋平教授对质
谱技术的支持.
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