全 文 ：华北农学报·2014，29 ( 3 ) : 234 -238
收稿日期:2014 － 03 － 11
基金项目:国家自然科学基金项目(31201066) ;内蒙古大学高层次引进人才启动经费项目(125107)
作者简介:王 静(1984 －) ，女，内蒙古乌海人，在读博士，主要从事植物分子生物学与信号转导研究。
通讯作者:亢 燕(1982 －) ，女，山西孝义人，讲师，博士，主要从事植物分子生物学与信号转导研究。
拟南芥茉莉酸途径调节植物对根结线虫的防御反应
王 静1，邬晓红2，其乐木格1，特日格乐1，祁 智1，亢 燕1
(1．内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021;2．包头市园林科技研究所，内蒙古 包头 014000)
摘要:对拟南芥根中的茉莉酸(Jasmonic acid，JA)生物合成和信号转导途径及 JA 对根结线虫发病机制所起的作
用进行了研究。研究发现根结线虫的侵染显著诱导拟南芥根中 JA 和 JA-异亮氨酸共轭物(JA-Ile)的合成，分别为
AOS1、OPＲ3 和 JAＲ1 基因调控。根结线虫在 JA缺失突变体和 JA-Ile缺失突变体(aos1、opr3、jar1)根中的生殖活性明
显低于野生型，但是在缺失 JA信号转导核心基因的突变体 coi1 和 jin1 的根中同野生型没有显著区别。使用外源 JA-
Ile可以使根结线虫在 jar1 根中的生殖能力恢复到在野生型根中的水平。这些结果证明，拟南芥根中 JA 的合成途径
为根结线虫侵染所必需。
关键词:拟南芥;茉莉酸;信号通路;根结线虫;突变体;先天免疫
中图分类号:Q945 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2014)03 － 0234 － 04
JA Mediated Signaling Pathway Ｒegulate Plant Defense
Ｒesponses of Ｒoot Knot Nematode
WANG Jing1，WU Xiao-hong2，Qilemuge1，Terigele1，QI Zhi1，KANG Yan1
(1． College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China;
2． Baotou Landscape Science and Technology Institute，Baotou 014000)
Abstract:Nematode parasites achieve chronic infection by overcoming the innate immunity system of the
hosts． In plants，the role of JA to innate immunity is well established in the leaves． The role of JA in defending a-
gainst parasitic root knot nematode is largely unknown． Here，we showed the root knot nematode Meloidogyne incog-
nita infection induced Allene Oxide Synthase1(AOS1)and OPＲ3 (12-oxo-Phytodienoic Acid Ｒeductase 3)depend-
ent JA and Jasmonate Ｒesistant1(JAＲ1)dependent JA-Ile biosynthesis． The nematode reproduction ability was sig-
nificantly lower on the JA-Ile deficient roots(aos1，opr3，jar1)than those of wild types． Two JA signal transduction
mutants，the coronatine insensitive1(coi1)and the JA insensitive1(jin1)，showed wile type susceptibility to the nem-
atode infection． The decreasing nematode reproduction ability on the roots of jar1，specifically missing JA-Ile，could
be rescued by exogenous application of JA-Ile． JA synthesis pathway is important in prouss of the nematode infect
Arabidopsis root．
Key words:Arabidopsis thaliana;Jasmonic acid;Signaling pathway;Ｒoot knot nematode;Mutant;Innate immunity
茉莉酸(Jasmonic acid，JA)是植物先天免疫系
统的基本元件。JA 生物合成和信号转导途径在模
式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片中研究最
为广泛和深入［1］。JA 在植物叶中生物合成如图 1
所示，起始于质膜上的不饱和亚麻油酸(18:2)［2］，
亚麻油酸在脂肪酸去饱和酶(Fadtty Acid Desatu-
rase，FAD3 /FAD7 /FAD8)、磷脂酶 (Phospholipase
A)［3］、脂肪氧合酶(13-Lipoxygenases，13-LOX)、丙
二烯氧化物合酶(Allene Oxide Synthase1，AOS1)和
丙二烯氧化环化酶(Allene Oxide Cyclases，AOC1 to
4)的催化作用下发生一系列反应，合成稳定的中间
产物 12-氧-植物二烯酸(12-oxo-Phytodienoic Acid，
OPDA)［4］。OPDA在 OPDA 还原酶(12-oxo-Phytodi-
enoic Acid Ｒeductase3，OPＲ3)［5］、OPC 辅酶 A 连接
酶(OPC-8:0 CoA ligase1，OPCL1)［6］和乙酰辅酶 A
氧化酶(Acyl-CoA Oxidases，ACX1-5)［7］作用下合成
3 期 王 静等: 拟南芥茉莉酸途径调节植物对根结线虫的防御反应 235
JA。拟南芥中 JA介导信号转导的部分途径是通过
由 JAＲ1 催化合成的 JA-Ile来实现［8］。JA作为一种
重要的内源信号分子参与植物对病原菌的防御［9］。
寄生线虫侵染人、动物和几乎所有重要的经济
作物［10］。线虫病害每年造成农作物损失约 770 亿
美元，其中根结线虫可以侵染 2 000 多种植物，造成
经济损失约占线虫病害的 50%［11］。线虫进入植物
根部后，会在根部取食部位的细胞进行多重有丝分
裂并与胞质分裂解偶联，形成多个多核巨型细胞，最
终形成根结并形成上百个卵，影响植物地上部分生
长及产量，甚至会造成植物提早死亡［12］。目前对寄
生线虫与寄主先天免疫系统互作的分子机制的认识
还十分有限［10］。根结线虫(Meloidogyne incognita)
和胞囊线虫是绝大多数重要经济植物的寄生线虫，
主要侵染植物根部［13］。据此本研究以拟南芥根中
的 JA生物合成和信号转导途径及 JA对根结线虫发
病机制所起的作用进行探讨。
图 1 拟南芥 JA和 JA-Ile生物合成途径
Fig． 1 Simplified JA and JA-Ile biosynthesis
pathway in Arabidopsis
1 材料和方法
1． 1 拟南芥材料
拟南芥野生型种子 Col-0 和 WS，突变体 jar1-1
为内蒙古大学牧草与特色作物生物技术实验室保
存，aos1(dde2-2)［14］来源于瑞士苏黎世大学 Dr．
Beat Keller;opr3［15］来源于美国华盛顿州立大学 Dr．
John Browse馈赠;coi1-16［16］来源于英国东安格利
亚大学 Dr． John Turner;jin1-1［17］来源于西班牙马德
里自治大学 Dr． Ｒoberto Solano。
aos1 和 opr3 为 JA 缺失突变体，显示花粉败育
表型。为获得它们的种子，在花期用 100 μmol /L JA
进行喷雾。coi1-16 通过 14 ℃短日照的培养箱培养
以实现种子繁殖。
1． 2 方法
1． 2． 1 根结线虫卵的繁殖和幼虫的准备 在拟南
芥 Col-0 根上培养根结线虫。分离线虫新鲜的卵用
于接种，在无菌条件下收集根上的卵块并在含 5%
漂白剂溶液震荡下释放卵。将溶液过滤后以
700 r /min 离心 5 min后收集卵，将收集的卵用无菌
水洗 4 次。为使线虫卵孵化，将含有新鲜卵的无菌
水滴到孔径 25 μm无菌金属网，金属网悬浮在无菌
培养皿的一层水中，并保持 26 ℃。数天后，孵化的
二龄幼虫(J2)移动到金属网下。7 d 后收集水中的
线虫 J2。
1． 2． 2 根结线虫侵染 Col-0、WS、JA 和 JA-Ile 缺失
突变体根后 JA 和 JA-Ile 的定量分析 为研究根结
线虫侵染是否诱导根中 JA 和 JA-Ile 合成，用 1 000
只根结线虫 J2 侵染植物 Col-0、WS、aos1(Col-0 背
景)、opr3(WS背景)、jar1-1(Col-0 背景)根，设水处
理根为对照。于 7 d和 21 d分别测定 5 种植物材料
处理根中 JA和 JA-Ile含量。
分别取水处理或接种线虫 J2 的拟南芥根组织
50 ～ 100 mg，在液氮中速冻并研磨成粉;用 500 μL
的丙醇 /H2O /HCl(2∶ 1∶ 0． 002，V /V /V)溶解 10 ng 氘
标记 JA(H2-JA)(美国，Sigmal 公司) ，再溶解 5 mg
根组织粉末，4 ℃搅拌 1 h;再加入 1 mL 二氯甲烷，
4 ℃搅拌 1 h;4 ℃，12 000 r /min离心 10 min。离心
后形成两相，组织碎片停留在两相之间，取 200 μL
下层液体放入 1． 5 mL 有聚四氟乙烯为衬里螺旋帽
的玻璃瓶中，随后用反相柱进行 HPLC 分析(C18
Gemini 5 μm，150 mm × 2． 00 mm，Phenomenex，CA，
美国)。流动相为双相溶液体系，0． 1%甲酸水溶液
和 0． 1%甲酸甲醇溶液，流速为 0． 3 mL /min。梯度
增加甲醇含量进行洗脱。分离后通过混合型三重四
级杆质谱仪-线性离子阱串联质谱仪(ABI 4000 Q-
Trap LC /MS /MS，Applied Biosystems)在多重反应监
测模式下进行定量分析，通过监测每个化合物转化
的前体离子，即每个化合物所对应特异的碎片离子
(JA:209→59，JA-Ile:322→30)。在负离子模式下
将 MS /MS条件优化，使检测化合物产生最大信号。
H2-JA 作为 JA 和 JA-Ile 定量的内标，JA-Ile 由美国
内布拉斯加林肯大学 Dr． Paul Staswick 馈赠。
至少进行 2 次生物学试验。每个生物学试验重
复 4 ～ 7 次，每次含有 10 ～ 15 棵幼苗的根组织。试
验数据以不同重复平均值 ±标准差表示。
1． 2． 3 根结线虫在拟南芥 JA和 JA-Ile缺失突变体
及 JA信号转导突变体根上生殖能力的检测 将拟
南芥 jar1-1、aos1、opr3 与 JA 信号转导通路突变体
coi1-16、jin1-1 表面消毒后，播种于 CK 培养基(2%
蔗糖，0． 3% Gamborg 盐，0． 6% 植物凝胶，pH 值
6. 1)上，每个平板播 5 粒种子，用 Parafilm封口。与
236 华 北 农 学 报 29 卷
水平呈 45°角置于短日照培养箱(23 ℃，8 h 光照 /
16 h黑暗)。培养 21 d 后，每个平板的拟南芥幼苗
用 1 000 只无菌繁殖的根结线虫侵染［18］。侵染后
平板用微孔胶布封口，以一定角度放在干净的丙烯
酸盒子中，该盒子底部铺有湿毡，以防止培养基变干，
然后再放置到短日照培养箱。培养 56 d 后，在解剖
显微镜下对每个平板雌虫产生的卵块数进行计数。
每个基因型都进行 3 次独立重复生物学试验，
每次重复包括 40 ～ 60 棵幼苗。数据以不同重复的
平均值 ±标准差表示。
1． 2． 4 JA-Ile在根结线虫侵染 jar1-1 根过程的作用
研究 将拟南芥种子 Col-0、jar1-1 分别播种于 CK、
CK + 500 nmol /L JA-Ile 培养基上。接种根结线虫，
方法同 1． 2． 3。统计平板雌虫产生的卵块数。
每个基因型都进行 3 次独立重复生物学试验，
每次重复包括 40 ～ 60 棵幼苗。数据以不同重复的
平均值 ±标准差表示。
2 结果与分析
2． 1 根结线虫侵染诱导根中依赖 AOS1、OPＲ3 的
JA合成和依赖 JAＲ1 的 JA-Ile合成
经根结线虫 J2 和水处理 Col-0、WS、aos1(Col-0
背景)、opr3(WS背景)、jar1-1(Col-0 背景)根后，测
定处理 7 d和 21 d根中 JA(图 2-A)和 JA-Ile(图 2-
B)含量。结果表明，经根结线虫 J2 处理 7 d 后，根
中 JA 和 JA-Ile 含量明显高于用水处理的根(P ＜
0. 001)，而 21 d的根与 7 d的根无明显区别。
JA缺失突变体 aos1 和 opr3 经线虫处理后 JA
和 JA-Ile含量分别显著低于相对应野生型 Col-0 和
WS(P ＜ 0． 001);水处理对照表现相同趋势。表明
根中 JA 和 JA-Ile 生物合成过程需要基因 AOS1、
OPＲ3 和 JAＲ1，这与叶中 JA和 JA-Ile的合成相同。
a ～ f在 P ＜ 0． 001 水平具有显著性差异。
a － f were significantly difference at P ＜ 0． 001．
图 2 根结线虫对突变体和野生型根中 JA和 JA-Ile含量的影响
Fig． 2 Effect of the nematode infection on JA and JA-Ile contents in the roots of wild type and mutants
2． 2 拟南芥 JA 和 JA-Ile 生物合成相关突变体对
根结线虫的感病性减弱，而 JA 信号转导突变体无
变化
为了解 JA和 JA-Ile 生物合成途径和信号转导
途径在根结线虫的发病机制中所起的作用，我们研
究根结线虫在突变体和相对应野生型的生殖能力。
根结线虫的定量是通过对成熟雌虫在根上完成 2 次
生活史，56 d后产生卵块的计数来实现。
a，b在 P ＜ 0． 01 水平具有显著性差。图 4 同。
a，b were significantly different at P ＜ 0． 01． The same as Fig． 4．
图 3 线虫在不同拟南芥 JA突变体根上的生殖能力
Fig． 3 Nematode reproduction on roots
of JA Arabidopsis mutants
图 3 显示 JA和 JA-Ile缺失突变体 aos1、opr3 和
jar1-1 上的卵块数比野生型明显减少，jar1-8［19］也有
相同的结果(图 3)。aos1、opr3 和 jar1-1 和相对应的
野生型在主根长、侧根数和整个根的形态上没有明
显区别，因此突变体的感病性减弱与可侵染根的生
物量无关。JA 信号转导突变体 coi1-16［20］和 jin1-1
对线虫响应显示野生型表型(图 3) ，即侵染根部的
卵块数与野生型没有显著性差异。
2． 3 JA-Ile回补 jar1 感病性减弱的表型
上述数据表明，阻遏 JA-Ile 的产生会使根结线
虫的生殖能力减弱(图 3 aos1、jar1-1、opr3 所示)。
这表明 JA-Ile是线虫发病发生的重要分子。
图 4 JA-Ile对含 JA-Ile生长培养基上的野生型
和 jar1-1 根结线虫生殖能力的影响
Fig． 4 Effect of including JA-Ile in the growth media on
nematode reproduction in the roots of WT and jar1-1
3 期 王 静等: 拟南芥茉莉酸途径调节植物对根结线虫的防御反应 237
JA-Ile 对 Col-0、jar1-1 的根伸长有抑制作用，生
长在含有 500 nmol /L JA-Ile培养基上的 jar1-1 和野
生型的根生物量比生长在对照培养基上幼苗约减少
30%。虽然生长在 500 nmol /L JA-Ile培养基上的幼
苗根的生物量减少，但 Col-0 上的卵块数并不比对
照少，jar1 根上的卵块数显著增多并与 Col-0 上的数
量类似(P ＜ 0． 01，图 4)。可见，JA-Ile 回补 jar1 感
病性减弱的表型。
3 讨论
通过对比突变体和野生型中 JA和 JA-Ile含量，
表明 AOS1、OPＲ3 和 JAＲ1 在叶和根中的功能较为
保守，分别负责 JA 和 JA-Ile 的合成。这些数据与
AOS1 是拟南芥基因组单拷贝基因研究结果一
致［21］。OPＲ3 是该基因家族三成员之一，是唯一能
编码蛋白并体外催化前体 OPDA 成为 JA［5］。本研
究表明，JA 和 JA-Ile 生物合成在根和叶中较为保
守，为研究它们在根中防御病原菌的功能，aos1、opr3
和 jar1 是合适的突变体。
研究中一个有趣的问题是为什么阻遏 JA 和
JA-Ile的生物合成会减弱根结线虫的生殖能力。一
种可能是阻遏 JA 和 JA-Ile 的生物合成改变其他激
素生物合成途径和脂氧化物的代谢网络。拟南芥叶
中 JA稳态与其他植物激素之间有复杂的交流，包括
水杨酸(Salicylic Acid，SA)、乙烯(Ethylene)、脱落酸
(Abscisic Acid，ABA)、生长素(Auxin)［2］和细胞分
裂素(Cytokinin)［22］，这些激素在一定程度上参与植
物寄生线虫的发病［23］。JA 生物合成途径是脂氧化
物代谢网络的一个分支［24］，该代谢网络的许多中间
化合物具有修饰根形态的功能［25］和在根与线虫互
作方面具有潜在功能。为深入研究，需拟南芥相关
单或双突变体来测试线虫响应，也需要开发出一种
同时测量多种植物激素和脂氧化物代谢网络中广泛
的中间化合物的方法。
另一种假设是 JA-Ile可能在线虫某些生理过程
至关重要。支持此假设的相关证据是线虫内含有与
脂肪酸结合的蛋白［26］;可能是线虫需要寄主根中的
JA-Ile，调控某些蛋白的功能以实现雌虫的正常发
育;也可能是寄主根中的 JA-Ile 是线虫 J2 的侵染
信号。
总之，本研究对 JA和 JA-Ile在根中生物合成及
其在线虫发病中的作用进行了分析。虽然我们并未
阐明植物寄生性线虫如何克服植物先天免疫系统以
达到长期侵染，但为研究植物 JA稳态与其他根特异
性病原菌相互作用机理奠定了基础。
参考文献:
［1］ Noir S，Bmer M，Takahashi N，et al． Jasmonate controls
leaf growth by repressing cell proliferation and the onset
of endoreduplication while maintaining a potential stand-
by mode［J］． Plant Physiology，2013，161(4):1930 －
1951．
［2］ Wasternack C． Jasmonates:An update on biosynthesis，
signal transduction and action in plant stress response，
growth and development ［J］． Annals of Botany，2007，
100(4) :681 － 697．
［3］ Yan Y，Stolz S，Chételat A，et al． A downstream mediator
in the growth repression limb of the jasmonate pathway
［J］． The Plant Cell，2007，19(8) :2470 － 2483．
［4］ Ziegler J，Stenzel I，Hause B，et al． Molecular cloning of
allene oxide cyclase-The enzyme establishing the stereo-
chemistry of octadecanoids and jasmonates［J］． The Jour-
nal of Biological Chemistry，2000，275(25) :19132 －
19138．
［5］ Schaller F，Biesgen C，Müssig C，et al． 12-oxophytodieno-
ate reductase 3(OPＲ3)is the isoenzyme involved in jas-
monate biosynthesis［J］． Planta，2000，210(6) :979 －
984．
［6］ Koo A J，Chung H S，Kobayashi Y，et al． Identification of
a peroxisomal acyl-activating enzyme involved in the bio-
synthesis of jasmonic acid in Arabidopsis［J］． The Journal
of Biological Chemistry，2006，281(44) :33511 － 33520．
［7］ Schilmiller A L，Koo A J，Howe G A． Functional diversifi-
cation of acyl-coenzyme A oxidases in jasmonic acid bio-
synthesis and action ［J］． Plant Physiology，2007，143
(2) :812 － 824．
［8］ Staswick P E，Tiryaki I． The oxylipin signal jasmonic acid
is activated by an enzyme that conjugates it to isoleucine
in Arabidopsis［J］． The Plant Cell，2004，16(8) :2117 －
2127．
［9］ McConn M，Creelman Ｒ A，Bell E，et al． Jasmonate is es-
sential for insect defense in Arabidopsis［J］． Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States
of America，1997，94(10) :5473 － 5477．
［10］ Jasmer D P，Goverse A，Smart G． Parasitic nematode in-
teractions with mammals and plants［J］． Annual Ｒeview
of Phytopathology，2003，41:245 － 270．
［11］ Sasser J N，Freckman D W． A world perspective on nem-
atology-the role of the society［J］． Journal of Nematolo-
gy，1986，18(4) :596．
［12］ Kyndt T，Vieira P，Gheysen G，et al． Nematode feeding
sites:unique organs in plant roots ［J］． Planta，2013，
238(5) :807 － 818．
［13］ Davis E L，Hussey Ｒ S，Baum T J． Getting to the roots of
parasitism by nematodes ［J］． Trends in Parasitology，
2004，20(3) :134 － 141．
238 华 北 农 学 报 29 卷
［14］ von Malek B，van der Graaff E，Schneitz K，et al． The Ar-
abidopsis male-sterile mutant dde2 － 2 is defective in the
ALLENE OXIDE SYNTHASE gene encoding one of the
key enzymes of the jasmonic acid biosynthesis pathway
［J］． Planta，2002，216(1):187 － 192．
［15］ Stintzi A，Browse J． The Arabidopsis male-sterile mutant，
opr3，lacks the 12-oxophytodienoic acid reductase re-
quired for jasmonate synthesis ［J］． Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of A-
merica，2000，97(19) :10625 － 10630．
［16］ Ellis C，Karafyllidis I，Wasternack C，et al． The Arabi-
dopsis mutant cev1 links cell wall signaling to jasmonate
and ethylene responses［J］． The Plant Cell，2002，14
(7) :1557 － 1566．
［17］ Lorenzo O，Chico J M，Sánchez-Serrano J J，et al． Jas-
monate-insensitive1 encodes a MYC transcription factor
essential to discriminate between different jasmonate-
regulated defense responses in Arabidopsis［J］． The
plant Cell，2004，16(7) :1938 － 1950．
［18］ Hammes U Z，Schachtman D P，Berg Ｒ H，et al． Nema-
tode-induced changes of transporter gene expression in
Arabidopsis roots［J］． Molecular Plant-Microbe Interac-
tions，2005，18(12) :1247 － 1257．
［19］ Staswick P E，Tiryaki I，Ｒowe M L． Jasmonate response
locus JAＲ1 and several related Arabidopsis genes encode
enzymes of the firefly luciferase superfamily that show
activity on jasmonic，salicylic，and indole-3-acetic acids
in an assay for adenylation［J］． The Plant Cell，2002，14
(6) :1405 － 1415．
［20］ Ellis C，Turner J G． A conditionally fertile coi1 allele in-
dicates cross-talk between plant hormone signalling path-
ways in Arabidopsis thaliana seeds and young seedlings
［J］． Planta，2002，215(4) :549 － 556．
［21］ Laudert D，Weiler E W． Allene oxide synthase:a major
control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signal-
ling［J］． The Plant Journal，1998，15(5) :675 － 684．
［22］ Sarkar D，Pandey S K，Sharma S． Cytokinins antagonize
the jasmonates action on the regulation of potato(Sola-
num tuberosum)tuber formation in vitro［J］． Plant Cell
Tissue and Organ Culture，2006，87(3) :285 － 295．
［23］ Curtis Ｒ H． Do phytohormones influence nematode inva-
sion and feeding site establishment ［J］． Nematology，
2007，9(2) :155 － 160．
［24］ Shah J． Lipases lipases and lipid-modifying enzymes in
plant disease resistance［J］． Annual Ｒeview of Phytopa-
thology，2005，43:229 － 260．
［25］ Vellosillo T，Martínez M，López M A，et al． Oxylipins
produced by the 9-lipoxygenase pathway in Arabidopsis
regulate lateral root development and defense responses
through a specific signaling cascade ［J］． The Plant
Cell，2007，19(3) :831 － 846．
［26］ Prior A，Jones J T，Blok V C，et al． A surface-associated
retinol-and fatty acid-binding protein(Gp-FAＲ-1)from
the potato cyst nematode Globodera pallida:lipid binding
activities，structural analysis and expression pattern［J］．
The Biochemical Journal，2001，356Pt2:387 － 394．