全 文 ：一种筛选拟南芥突变体的有效方法
赵淑清
(山西大学生物工程实验室 ,太原 030006)
摘　要:经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理的拟南芥种子 ,接种于 MS 培养基上 ,垂直放置培养4 天后 , 将幼苗转移至
胁迫培养基中 ,以倒置幼苗 180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体。利用这种方法 , 成
功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。本方法同样适用于其他类型突变体的筛选。
关键词:拟南芥;突变体;筛选;根弯曲方法
中图分类号:Q319　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2001)03-0260-03
A Efficient Method for Isolation of Arabidopsis Mutants
ZHAO Shu-qing
(Laboratory of B iotech nology , Shan xi U niversity , Taiyuan 030006 , China)
Abstract:This paper introduces a root-bending assay for isolation of Arabidopsis mutants tolerant to nutritio n stress.Seeds
of wild- ty pe Arabidopsis thaliana (ecotype Landersberg erecta)w ere mutagenized with ethyl methy l sulfide(EMS), and
M2 populations were screened for mutants.Four-day-old seedlings with 1-to 1.5-cm-long roots w ere transfer red from the
vertical agar plates onto to a second agar medium that w as supplemented with determinate stress.The seedlings were ar-
ranged in rows , and the plates were oriented ver tically with the roots pointing upward.After another 4 days , the root
bending seedling s were selected for putative mutants and transferred to soil to grow to maturity.Seeds from the putative
mutants w ere screened again to determine the true mutants.By using this root-bending assay we have isolated a low-K+-
tolerant(lkt1)mutant which is caused by sing le recessiv e nuclear mutation.Fo r lkt1 mutant screening , K +concentration
of the medium was 100μmol/ L because roo t g row th of wild type seedling s was completely inhibited at o r below this con-
centration.This root-bending assay is also applicable to other type of Arabidopsis mutant isolation.
Key words:Arabidopsis;mutant;isolation;roo t-banding assay
　　拟南芥是十字花科拟南芥属植物 , 近年来拟南芥以其个
体小 、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研
究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变 , 目前已
从拟南芥中分离得到了几千种突变体 , 这些突变体的获得为
揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用[ 1] 。拟南芥突
变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提 ,而筛
选方法是突变体筛选成败的关键。本文以拟南芥耐低钾突
变体的筛选为例 ,介绍一种简单 、灵敏 、通用的拟南芥突变体
的筛选方法。
1.1　植物材料诱变
以拟南芥(Arabidopsis thaliana cv.Landsberg erecta)为
材料。诱变方法如下:称取 250mg(约 5000 粒)野生型种子
置于 50ml烧杯内并加入 25ml重蒸水 , 搅拌 30 分钟;在 4℃
下放置 12 小时后 , 把种子转移到盛有 30ml100mmol/ L 磷酸
缓冲液(pH6.5)的 100ml三角瓶中 , 加入 0.2%(v/v)的甲基
磺酸乙酯(EMS),封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡 12h。
然后用 50ml蒸馏水漂洗种子 4次 , 每次 15min。将漂洗好的
种子置于 4℃下春化 3天后种植。
收稿日期:2000-06-08;修回日期:2000-09-10
作者简介:赵淑清(1965-),女 ,山西兴县人 ,博士学位 ,讲师 ,专业方向:植物营养遗传。 Tel:0351-7011499 , E-mail:shuqing@sxu.edu.cn
遗　传 HEREDITAS(Beijing)23(3):260 ～ 262 , 2001　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　技术与方法
DOI :10.16288/j.yczz.2001.03.021
1　材 料 与 方 法
1.1　植物材料诱变
以拟南芥(Arabidopsis thaliana cv.Landsberg erecta)为
材料。诱变方法如下:称取 250mg(约 5000 粒)野生型种子
置于 50ml烧杯内并加入 25ml重蒸水 , 搅拌 30 分钟;在 4℃
下放置 12 小时后 ,把种子转移到盛有 30ml 100mmol/ L磷酸
缓冲液(pH6.5)的 100ml三角瓶中 , 加入 0.2%(v/ v)的甲基
磺酸乙酯(EMS),封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡 12h。
然后用 50ml蒸馏水漂洗种子 4 次 , 每次 15min。将漂洗好的
种子置于 4℃下春化 3天后种植 。
1.2　诱变植株培养
将经 EMS 诱变处理后的拟南芥种子(M 1)播种于用 1/ 4
Hoagland营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土:蛭石
=2:1 , v/ v),种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度 18
～ 22℃、光照强度 120μmol/m2s-1、光暗周期 16h/ 8h 条件下
培养 ,待种子成熟后分行采收种子(M 2代)。
1.3　突变体的筛选
1.3.1　培养基
基本培养基:MS 培养基[ 2] , 1.0 %琼脂(w/ v), pH 5.7。
选择培养基(本实验是去钾培养基):大量元素(单位 mg/ L)
NH4NO3 2350 , NH4H2PO4 144 , CaCl2·2H2O 440 , MgSO4·
7H2O 370 ,微量元素同 MS 培养基 , 去 K +琼脂 1.2%(w/v),
蔗糖 3%(w/ v), pH 5.7(T ris-HCl调节)。
1.3.2　接种方法与培养条件
　　拟南芥种子用 0.5%(v/ v)次氯酸钠加 0.1%(v/v)T ri-
ton X-100 表面消毒 10 分钟 , 再用无菌水冲洗 3 遍。接种
前种子与 0.4%(w/v)低熔点琼脂糖混和 , 然后用吸管将种
子吸出 ,成行地涂于 MS 培养基上;将培养皿置于 4℃冰箱春
化 48 小时 ,之后转入光照培养 , 培养皿垂直放置。培养箱温
度 22℃,连续光照 , 光强 30μmo l/m2s-1。
1.3.3　根弯曲试验
将经过灭菌的野生型种子接种于 MS 培养基中 , 在光照
培养箱中(条件同上)培养 4 天 ,待幼苗根长至 1～ 1.5cm 时 ,
再将幼苗转入含有系列不同 K +浓度的低钾培养基中 , 排列
成行 ,然后将培养皿倒置 , 使根尖朝上 , 继续培养。如果根能
够继续生长 ,则生长的根会由于重力作用而向下弯曲。以野
生型拟南芥幼苗完全不能生长(根不发生弯曲)的 K +浓度作
为突变体的筛选浓度。
1.3.4　突变体筛选
在确定的选择压力下 , 利用上述根弯曲方法对 M 2代进
行筛选 ,将筛选得到的可能突变体再转入含 0.6%琼脂(w/
v)的 MS 培养基中 , 根尖朝下培养一周左右;然后转入含有
蛭石的营养土中培养 ,以收获 M 3代种子。M 3代种子再进行
上述低钾条件下的根弯曲试验。若某一株系的 M 3代幼苗仍
表现耐低钾性状 ,则将其确定为耐低钾突变体。
2　结　　果
2.1　筛选浓度的确定
将根长 1～ 1.5 cm 的野生型拟南芥幼苗转入含有系列
图 1　不同浓度 KCl对拟南芥野生型幼苗根生长的影响
Fig.1　Effects of KCl at Various Concentrations
on Root Growth of Wild-type Arabidopsis Seedlings
2613 期　　　　　　　　　　　　　　　赵淑清等:一种筛选拟南芥突变体的有效方法　　　　　　　　　　　　　　　
K +浓度的低钾培养基中 ,将培养皿转动 180°,垂直放置 , 4 天
后幼苗根生长情况见图 1。由图中可见 ,野生型拟南芥幼苗
根的生长在 K+浓度为 100μmol/ L 时已被完全抑制。在 200
μmol/ L K +时 , 根已有较明显的生长。所以本实验用于筛选
耐低钾突变体的低钾浓度被确定为 100 μmol/ L。
2.2　突变体筛选
对 7 万粒 M 2代种子在 100μmol/ L K+的选择压力下利
用根弯曲方法进行了筛选 , 共得到 60 株可能突变体。对其
M 3 代种子在同样选择压力下又进行了筛选 ,其中一株(M -
33)的 M 3 代幼苗根仍表现弯曲 , 说明该株系的后代在低钾条
件下根仍可以生长 , 且它的耐低钾性状可以稳定遗传 , 是真
正的突变体。
3　讨　　论
据理论估算 ,每 5 万株经诱变的拟南芥子代(M 2), 其基
因组中的每一个基因至少有一次发生突变的机会。对于这
样较大规模的筛选工作 ,采用组织培养方法在培养基上进行
是比较经济有效的。对于突变体筛选的成败 ,筛选方法是非
常关键的。越是专一的筛选条件 ,就越有机会直接获得所期
望的突变体。最好的例子是正选择法 , 即设计一定的培养基
或一定的培养条件 ,使得只有所期望的突变体能够成活或正
常生长。 Koo rnneef 等巧妙地利用这种方法筛选出 ABA 缺
陷型突变体[ 3] , Parks 等筛选出 phyA 缺陷型突变体[ 4] 。运用
这种方法的两个关键环节是选择压力和筛选指标。
对于耐营养胁迫突变体的筛选 , 适当的选择压力应当是
既能使突变体的优势得到发挥 ,又能使野生型受到足够的压
力而不能表现。换句话说 ,就是筛选浓度既不至于过高而使
一些本来没有突变的个体被认为是突变体;也不至于过低而
使真正的突变体被淘汰掉。那么 , 在筛选突变体之前 , 首先
要设计一系列的筛选浓度 ,以野生型完全不能生长的浓度确
定为筛选浓度。
筛选指标是突变体筛选的又一关键。常规的植物育种
主要根据相对产量(生物量)和外观征状等综合指标来进行 ,
并认为植物对营养胁迫的抗性也会同时遗传保持下去。 这
虽然有其正确的一面 , 但因缺乏特异抗性指标的指导 , 不仅
使得选择周期加长 ,而且针对性不强。进行遗传工程育种缺
乏特异性抗性指标时 ,常常会由于无特异性状标记而难以进
行有关基因的定位 ,有时甚至会产生错误的结果。另外 , 植
物形态和生理生化指标也是植物营养性状基因型差异选择
的常用指标 ,但这些指标的确立首先取决于植物营养性状的
形态和生理生化基础研究的进展。即使找到与某一营养性
状密切相关的形态和生理生化指标 , 也由于测定指标常会损
坏植株并且较为麻烦 , 所以 , 实用性也不强。因此 ,选择合适
的特异性筛选指标对于筛选的顺利进行是至关重要的。
勿庸置疑 ,使植物生长良好是植物营养性状改良的最终
目标 。所以 , 我们以植物生长状况作为指标进行筛选 , 并且
采用形象 、直观的根弯曲作为标志 , 使筛选过程简单化 、快速
化。
根弯曲方法的原理是:在一定的选择压力下 , 突变体由
于具有忍受胁迫的能力可以正常生长 , 非突变体则由于受到
胁迫而停止生长 ,但这种生长对于大量的选择来说并非一目
了然 ,所以选择起来比较困难。如果将拟南芥幼苗转至选择
培养基后 ,把根倒过来培养 , 非突变体的根由于不长也就只
能停在原来的位置 ,而突变体可以在这种选择条件下正常生
长 ,并因重力作用向下形成弯钩。将根发生弯曲的个体挑选
出来 ,即为可能的突变体。采用这种方法最大的优点是直
观 、灵敏 , 而且还可以淘汰一些重力突变体。该方法在镉 、
钠 、钾等拟南芥突变体的筛选中已得到成功应用[ 5 , 6 , 7] , 是
一种具有广泛应用性的拟南芥突变体筛选方法。
参 考 文 献(References):
[ 1] 　Meinke D W , Cherry J M , Dean C , et al.Arabidopsis thaliana:A mod-
el plant for genome analysis[ J] .Science , 1998 , 282:662～ 682.
[ 2] 　Murashige T , Skoog F.A revised medium for rapid grow th and
bioassays w ith tobacco t issue culture[ J] .Physiol Plant , 1962 , 15:
473～ 497.
[ 3] 　Koornneef M , Jorna M L , Brinkhorst-van der Swan D L C , et al.
The isolat ion of abscisic acid(ABA)deficient mutants by selection
of induced revertan ts in nongerminat ing gibberellin sensitive lines
of Arabidopsis thaliana(L.)Heynh [ J ] .Theor Appl Genet ,
1982 , 61:385.
[ 4] 　Parks B M , Quail P H.Hy8 , a new class of Arabidopsis long
hypocotyl mu tants def icient in funct ional phytoch rome A[ J] .Plant
Cell , 1993 , 5:39.
[ 5] 　How den R , Cobbet t C S.Cadmium-sensit ive mutants of Arabidop-
si s tha liana[ J] .Plant Physiol , 1992 , 99:100～ 107.
[ 6] 　Wu S J , Ding L ,Zhu J K.SOS1 , a genetic locus essent ial for salt toler-
ance and potassium acquisition[ J] .Plant Cell, 1996, 8:617～ 627.
[ 7] 　Zhao S hu-Qing ,Wu Wei-Hua.Isolation and genet ic analysis of low
K +-tolereant(LKT)Arabidopsis mutants[ C] .The American So-
ciety of Plan t Physiologists , 1999 , 452.
262　　　　　　　　　　　　　　　　　　　遗　传 HEREDITAS(Beijing)2001　　　　　　　　　　　　　　　23卷