全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBulletinVol.23 No.4 2007April
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随着植物转基因技术的发展，如何对转入的外源
基因的表达进行精确调控，使其能够在植物体内适
时、适量和有效地表达，成为人们关注的焦点问题[1,2]。
目前，可应用的植物基因表达调控系统主要有乙醇调
控系统、糖皮质激素调控系统、铜调控系统、IPTG调
控系统和四环素调控系统等。这些系统均利用了外源
诱导物，而维持外源基因的高水平持续表达需要不断
供给或多次施用诱导物，这在实际应用中存在难度且
受环境因素的影响较大；同时，有些诱导物如四环素
容易被光分解，铜、银离子等超过一定浓度时会对植
物造成生理伤害；另外，有些调控系统还存在物种局
限性，如乙醇诱导方式在模式植物拟南芥中没有应用
成功[3~6]。热激调控系统是利用热激启动子调控目的
基因，只受温度控制，克服了利用诱导物对植物产生
毒性的缺点，不存在药物残留，不会带来人畜伤害和
潜在的环境污染问题，经济投入少且便于在试验条件
拟南芥热激启动子 AtHSP70b 的克隆与功能分析
裴华丽,胡华刚,张兴国,苏承刚,宋孝霞
(西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆400715)
摘 要:从拟南芥 Columbia生态型 (Arabidopsis thaliana)的基因组 DNA中扩增出热激启动子 AtH-
SP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子 AtHSP70b插入到 pSAU2008的 gus基因及
NOS终止子上游,构成热激启动子控制 GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入
到 pVCT2020中得到表达载体 pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)LBA4404,并转化烟草 (W38)获得再生植株,通过 PCR检测鉴定,表明“AtH-
SP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表
明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启
动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该
启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。
关键词:热激启动子;拟南芥;gus基因;转基因烟草
中图分类号:Q344+14文献标识码:A
Cloning and Functional Analysis of the Heat-inducible Promoter AtHSP70b
Pei Huali, Hu Huagang, Zhang Xingguo, Su Chenggang, Song Xiaoxia
(College of Horticulture and Landscape, Southwest University,
Key Laboratory of Olericulture of Chongqing, Chongqing 400715)
Abstract: The promoter of a heat-inducible gene AtHSP70b was amplified from the genome DNA of
Arabidopsis thaliana cv. Columbia, which had a length of 204bp and the same sequence as published
previously. The expression vectors, pV-HSP70bGUS was constructed by inserting the promoter of
AtHSP70b. The vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 which was used to
mediate the transfection of AtHSP70b promoter fragment into the tobacco (W38). The regenerated plants
were analyzed and showed that the promoter fragment was integrated into the genome of tobacco.
Histochemical staining of GUS activity of the transgenic plants proved that the promoter of AtHSP70b
expressed unprecisely.
Key words: Heat-inducible promoter, Arabidopsis thaliana, Gus gene, Transgenic tobacco
第一作者简介:裴华丽，女，1979年出生，山东潍坊人，硕士，研究方向：细胞工程。E-mail:peihuali2@163.com。通信地址：400715重庆市北碚区西南大学园
艺园林学院622信箱。
通讯作者:张兴国，男，1963年出生，研究员，博士生导师，研究方向：基因表达与调控。Tel:023-68250974，E-mail:zhangxg@swau.cq.cn。
收稿日期:2006-12-14，修回日期：2006-12-26。
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下进行精确调控。但是热激启动子，包括目前采用较多
的拟南芥Hsp18.2和大豆Hsp17.5等，均存在表达遗
漏等缺陷[7]。Sung等（ 2001）详尽研究了拟南芥Hsp70
家族基因的表达模式，发现AtHSP70b基因具有仅受
高温诱导的特点。本研究中克隆了该基因的启动子，通
过转AtHSP70b:GUS基因烟草证实，该热激启动子具
有较严谨的高温诱导特性。
1材料和方法
1.1植物材料
拟南芥(ArabidopsisthalianaEcotypeColumbia)、
烟草（ NicotianatabacumL.cv.Wisconsin38）均为本实
验室保存。
1.2菌种和质粒
大肠杆菌（ Escherichiacoli）XL1-Blue和农杆菌
（ Agrobacteriumtumefaciens）菌株 LBA4404由本实验
室保存。pSAU2006和pVCT2020等载体由本实验室
构建。
1.3酶和试剂
各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、分子量
Marker、TaqDNA聚合酶和 pfu高保真 DNA聚合酶
购自TaKaRa生物公司，PCR引物由上海生工生物技
术公司合成。
1.4AtHSP70b启动子的克隆
根据拟南芥热激蛋白基因 AtHSP70b(GenBank
acc#:AC010924)启动子序列，设计和合成PCR扩增引
物 P1：tatatcccggtcggtgaatc 和 P2：GGAAGTGAG-
GTTTTTCGATTTC。在50ul反应体系中加入1(L(约
20ng)拟南芥 gDNA、200(MdNTP、10pmol引物和 5
U的pfu高保真DNA聚合酶。经94℃变性3min后，
94℃30s，52.5℃40s，72℃50s，共27个循环；72℃延
伸10min。1%琼脂糖电泳后回收目的条带。Omega胶
纯化试剂盒纯化DNA。TaqDNA聚合酶加“ A”尾后克
图1表达载体的构建
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隆到 pMD18-T载体。菌落 PCR筛选阳性克隆
（ pMD-AtHSP70b）后委托上海生工生物有限公司测
序。
1.5植物表达载体的构建
用 EcoRⅠ和 XbaⅠ分别对 pMD-AtHSP70b和
pSAU2006质粒DNA消化，回收pMD-AtHSP70b的
2781bp大片段和 pSAU2006的 2164bp小片段，T4
DNA连接酶连接，构建含有AtHSP70b-GUS-Tnos基
因表达盒的质粒pM-HSP70bGUS。将pM-HSP70bGUS
的 HindⅢ和 EcoRⅠ小片段（ 2400bp） 插入到
pVCT2020载体的相同位点，构建植物表达载体
pV-HSP70bGUS。采用冻融法[8]将该载体转入根癌农
杆菌 LBA4404。用含有 100mg/L利福平（ Rif）、100
mg/L链霉素（ Str）和 50mg/L卡那霉素（ Km）的 YEB
培养基筛选，并进行PCR扩增和酶切检测。载体构建
流程见图1。
1.6转烟草的获得和鉴定
采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法 [9]将 AtH-
SP70b-GUS-Tnos基因导入烟草。将烟草无菌苗叶片剪
成 小 块 ， 放 入 活 化 的 农 杆 菌 LBA4404
（ pV-HSP70bGUS+LBA4404）菌液中浸泡4~5min后
取出，无菌吸水纸略为吸去表面菌液，放在共培养基
（ MS+2.5mg/LBA+0.2mg/LNAA）上28℃培养2~3
d后，转移到筛选培养基中（ MS+2.5mg/LBA+0.2
mg/LNAA+300mg/L羧苄霉素（ Cb）+150mg/L卡那
霉素（ Km））培养，每3周更换一次培养基，直至分化出
抗性芽[10]。
采用CTAB改良法从转基因烟草叶片中提取基
因组DNA，未转化植株作为阴性对照，质粒DNA为
阳性对照，用P1和位于 GUS基因中的 P3引物
（ TGCCAGTTCAGTTCGTTGTTCA）进行 PCR扩增，
筛选和鉴定转基因植株。
1.7热激启动子AtHSP70b的热激诱导特性分析
将含有AtHSP70b-GUS基因的烟草叶圆片放在筛
选培养基上，分别经 4℃、20℃、25℃、28℃、30℃、
35℃、37℃和40℃处理3h。参照Jeferson[11]的方法进
行GUS组织化学染色。OLYMPUSBH-2型显微镜观
察和记录染色结果。
2结果与分析
2.1热激启动子AtHSP70b的克隆
以拟南芥基因组 DNA为模板，PCR扩增出 204
bp片段（ 图2A、图2C），测序结果显示与已发表的序
列一致。AtHSP70b热激启动子的TATA盒上游有3
个不完善的热激元件（ Heatshockelement,简称
HSE）、1个序列为 TGTCTC的生长素反应元件
（ AuxRE）和1个ABA反应元件的核心序列（ ACGT）
（ 图2B），因此其结构比较简单。
2.2AtHSP70b:GUS基因植物表达载体的构建
用引物P1和P3对所挑取菌落的pV-HSP70bGUS
的质粒DNA进行PCR扩增，得到598bp的预期片段
（ 图3A）；经EcoRⅠ和HindⅢ酶切，得到2400bp的预
期带（ 图 3B），证明 AtHSP70b-GUS-Tnos基因表达盒
已 插 入 到 pVCT2020中 。 通 过 冻 融 法 将
pV-HSP70bGUS载体导入根癌农杆菌 LBA4404，以
pV-HSP70bGUS的质粒 DNA为阳性对照，PCR检测
表明pV-HSP70bGUS已转入根癌农杆菌中（ 图略）。
2.3转基因烟草植株的鉴定
表达载体pV-HSP70bGUS通过农杆菌LBA4404
介导转化烟草无菌苗的叶片外植体，经过分化和生根
两个阶段的筛选，获得8株Km抗性再生植株。以Km
A:AtHSP70b的 PCR产物;B:热激启动子 AtHSP70b的结构;C:热激启动子 AtHSP70b的核苷酸序列 M,pUC19DNA/Msp1分子
量标记;1,热激启动子AtHSP70b的PCR产物;○,不完善的HSE;,TATA盒;▼andUnlinedsequence,AuxRE.
图2热激启动子AtHSP70b的克隆、序列与结构
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抗性烟草植株叶片的基因组DNA为模板，P1/P3为引
物进行PCR扩增。结果显示，从8株Km抗性烟草植
株上均能扩增到598bp的特异片段，与阳性对照PCR
产物的大小一致，而未转化的植株中没有该片段的产
生，证明AtHSP70b-GUS-Tnos基因已导入烟草基因
组中（ 图4）
2.4热激启动子 AtHSP70b在转基因烟草中温度诱导
表达特性分析
对转基因烟草植株的离体叶圆片进行不同温度
处理以鉴定启动子功能。GUS染色结果显示，转基因
A,pV-HSP70bGUS的PCR鉴定;B,pV-HSP70bGUS酶切鉴定;Ma,分子量标记;1,AtHSP70b启动子的 PCR扩增产物;Mb,分子量
标记;2,pV-HSP70bGUS的PCR产物
图3表达载体pV-HSP70bGUS的鉴定
M,分子量标记;1~8:株转基因烟草不同单株的基因组 DNA扩增产物;9,pV-HSP70bGUS质粒扩增产物的阳性对照;10,未转化植株
阴性对照。
图4转AtHSP70b-GUS基因植株的PCR检测
植株在 4℃~40℃的不同温度下都有一定的 GUS活
性，其中在37℃和40℃下表达活性最高，未转基因的
烟草植株在各种温度下处理下都没有 GUS活性（ 图
5）。该结果表明，拟南芥的AtHSP70b热激启动子在烟
草植株内同样具有热诱导特性，但在非热激温度下存
在表达遗漏现象。
1~8,分别为4℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、37℃、
40℃处理的转HSP70b:GUS基因烟草叶片;CK,非转
化植株叶片(阴性对照)。
3讨论
本研究将拟南芥热激启动子 AtHSP70b控制的
GUS报告基因转入烟草。对转基因烟草进行GUS活
性分析表明，该热激启动子在37℃和40℃下表达活
性最高，但在4℃~35℃的温度范围内也存在着一定
的表达遗漏。由此可见，AtHSP70b热激启动子的确能
被高温诱导。Sung等（ 2001）研究表明，在非热激温度
下几乎检测不到AtHSP70b基因的转录本[7,12]。但本研
究与此结果不一致。在pV-HSP70bGUS载体T-DNA
中，AtHSP70b-GUS-Tnos基因的两侧分别有NPTI和
GFP基因，因此可以排除T-DNA插入位点的烟草基
因控制元件对该基因表达的影响。是否是由于AtH-
SP70b热激启动子上的其他反应元件导致它在转基因
烟草出现较高的本底表达，尚需通过一系列突变研究
来证实。
完 善 的 热 激 元 件 (nTTCnnGAAnnTTCn或
nGAAnnTTCnnGAAn)及其相间距离是确保热激启动
图5转AtHSP70b-GUS基因烟草的GUS染色
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子高水平表达的基础。AtHSP70b热激启动子上存在3
个不完善的热激元件，以及第2个热激元件所处的不
良位置，均可能影响该热激启动子的表达活性。事实
上，AtHSP70b基因在拟南芥HSP70基因家族中表达
活性处于中等（ Sung等，2001）[7,12]。因此，使AtHSP70b
热激启动子具备完善的热激元件，并剔除其他影响表
达活性的反应元件，有可能将其改造成高效和严谨表
达的热激启动子。
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（ 责任编辑：秦守亮）
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