全 文 ：论 文 第 4 9卷 第 2 3期 2 0 04年 12月 科 考 之 叙
拟南芥中 A t M E K S激活导致不依赖于水杨酸
信号途径的细胞死亡
刘红霞 王 澄 周天虹 孙宇静 刘 国琴 任东涛 ’
( 植物生理生化国家重点实验室 , 中国农业大学生物学院, 北京 10 0 094 · * 联系人 , E 一m ial ren @ c au ·ed u · cn )
摘要 用 M B P 作为磷酸化底物的凝胶内激酶活性分析结果显示 , 在转基因拟南芥植株中诱导表达组成
型激活的 A tM E凡蛋 白(A Mt E此D )引起的细胞死亡和用带有 va : 助 2t 基因的病原菌 尸 . 勿 ir gn a 。 D c 3 0 0
处理转基因植株导致的超敏性细胞死亡过程中, 4 和 48 功 的 2 个 M A P K 均被激活 ; A Mt E K SD 在 Na h G
转基因烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥杂交植株 A tM E K匕D饭Na h G 中诱导表达依然引起细胞死亡 , 且杂
交植株中 A tM E K SD 表达并未引起水杨酸含量的显著变化 ; N or th er n 检测结果显示 , 病原菌处理可显著
诱导 A t M E K SD D 转基 因植株 中 p A L , 尸 R I 和 尸R S 基 因的大量转录 , 而 A tM E K S D D 的表达仅
导致 PR S 基因的大量转录 , 表明有别于超敏性细胞死亡的水杨酸依赖特性 , A Mt E凡 激活引起的细胞死
亡不依赖于水杨酸信号途径 .
关键词 拟南芥 细胞死亡 M A P K 级联 系统 A tM E凡 水杨酸信号
细胞超敏反应 (h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e , H R ) 11 ] 、
防御基因激活 2[] 和抗病植保素 3I] 的产生是植物防御病
原菌侵害的重要机制 . 遭遇病原菌侵染时 , 植物可通
过特定抗性基因与病原菌的 A 。 : 基因相互作用或通
过特定 的受体与病原菌激发子结合 , 产生 的信号传
至细胞 内 , 诱导被侵染区细胞发生 H R 细胞死亡以阻
止病原菌扩散队5] , 发生 H R 反应的细胞会产生一系
列 的信号向整个植株传递 , 使植株得到获得性 系统
抗性 ( s y s t e m i c a q u i r e d r e s i s t a n c e , S A R ) , 进而使植株
产生广谱抗病性 ￡6 J. 水杨酸 ( s a l i c y l i e a e i d , s A )及其信
号转导途径是 目前公认的病原菌引起的 H R 的重要信
号途径之一 7[] .
分裂原活化蛋白激酶 (m i to g e n 一 a c t i v a te d p r o t e i n
ik na
s e , M A P K )级联系统是真核生物细胞中高度保守
的信号系统之一 , 参与了动植物细胞的生长 、 分裂 、
分化和胁迫响应等过程降 “ ] . M A P K 系统包括可被顺
序 磷 酸 化 激 活 的 3 个组 分 , 即 M A PK K 激 酶
(M A P K K )K
、
M A P K 激酶 (M A P K K 或 M E )K 以及
M A P K
. 来 自胞外的信号可经由受体传至 M A P K 级
联系统 , M A P K K K 首先被多种机制磷酸化激活 , 之
后沿 M A P K K K , M A P K K 和 M A P K 逐级磷酸化激活 .
激活的 M A P K 则直接被运至细胞核去激活特定的转
录因子或是继续停留在细胞质中磷酸化诸如细胞骨
架相关蛋 白或其他酶类 , 使细胞产生特定的生理反
应 [` 2 ] .
用蛋 白激酶活性和磷酸酶活性特异抑制剂的研
究发现 , 几乎所有防御反应的诱导都有磷酸化和去
磷酸化信号参与 [` 3一 , 5〕 . 研究发现 , 在病原菌及其激发
子引起的细胞超敏反应过程 中 M A P K 级联系统被激
活 , 激酶抑制剂可以抑制 M A P K 活性同时也抑制了
细胞死亡的发生 , 间接证明 M A P K 信号途径参与了
细胞死亡途径的信号调节 [` “〕. 我们对拟南芥 A t几夕E K 3
基因进行定点突变的研究结果表明 , 转基因植物中
组成型激活的 A tM E K SD 蛋白的诱导表达会激活 4
和 4 8 k D 的 M A PK , 导致细胞快速死亡 , 而组成型失
活的 A tM E K SKR 蛋白的表达则不会 , 直接证明特定
M A PK 级联信号系统参与了细胞死亡的信号调节 [`7] .
但这种细胞死亡与病原菌引起的 H R反应的信号调节
途径是否相似或有无交叉 , 尚缺乏实验证据 .
本文以转 A IM E凡不同突变基因的转基因拟南芥
植株为材料 , 分析了 tA M E K : 引起的细胞死亡和病原
菌 尸 匆 ir ng ae (含 A : : 彻 2t )引起 H R 反应的细胞死亡
过程中 M A P K 的激活和 尸R 基因的转录 , 表明 2 种细
胞死亡过程的调节途径有差别 . 不同于 H R 反应的
s A 依赖特性 l[ 8 ] , IA M E K S D 蛋 白表达引起不依赖于
S A 的细胞死亡 .
1 材料和方法
( i ) 植物材料 . 烟草 (N i e o t i n a ta b a c u m c v X a n -
t h i )于 2 5 oC , 1 0 0 林E · M 一 2 · s 一 ` 光照强度及 12 h光
w WW
.
S C IC h i n a
.
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照条件下培养 . 烟草生长 4荀周时即可用于转化和瞬时
表达 . aN h G 转基因烟草和拟南芥由美国 S Y N G E N J A
B i o t e e h n o lo g y 公司惠赠 .
拟南芥 (A r a b id叩 5 15 th a n i a n a , 哥伦 比亚生态型 )
于 2 ℃ , 10 林E · m 一 2 · s 一 `光照强度及 1 2 h 光照条件
下培养 . 除用于杂交外 , 所有实验用拟南芥均于 4 周
后处理 , 处理样品喷 10 林m o比 D E X (D e x am e山 a s o n e )
水溶液 . 处理后 12 h 取完全伸展的叶片 , 样品用液氮
速冻后于一 80 ℃保存备用 .
A zM E K乡各类 突变体的转基 因拟南芥筛选同前
文 I`7] . 选取 T 3代纯合体转基因拟南芥作父本 (抗潮霉
素筛选标记 ) , Na h G 转基因拟南芥 (抗卡那霉素筛选
标记 )为母本进行杂交 . 种子用含 50 此 /m L 卡那霉素
和 10 林g /m L 潮霉素的 l / 2 M s , l % 蔗糖 , 0 7%琼脂的
固体培养基筛选后得到 A tM E K吕D nx Na h G , A 之M E K SKR
x
Na h G 杂交 lF 代植株 .
( i ) 烟草叶片中农杆菌介导的基因转化及瞬时
表达 . A tM E K S的克隆 、 突变及植物表达载体的构建
及向农杆菌 C 5 8 C I 的转化同文献 [17] . 将带有转化质
粒的农杆菌单菌落接种于 5 m L A B 液体培养基 中 (含
10 0 林m o l /L N 一乙酞 T 香酮 , 5 0 林g zm L 卡那霉素 , 2 5
林g /m L G e n tm y e i n ) , 2 8 oC 下 2 5 O r m/ i n 摇床培养 4 s h ,
35 0 0x g 离心收集菌体 . 将菌体悬浮于含 10 林m ol L/
N
一乙酞丁香酮的 1/ 2 M S 培养液中 , 使终浓度达态。
为 0 . 8 . 用注射器将带有不同突变体基因的农杆菌菌
液注人烟草叶片的不 同分格 . 以带有空载体的菌悬
液作空 白对照 . 48 h 之后注人 30 件m ol L/ 的 D E x 诱导
外源基因的表达 , 诱导后 12 h 取样 , 液氮速冻后于
一 SO Oe 保存备用 .
( in ) 病原菌诱导的拟南芥 H R 反应 . 将带有
a v rR z , 2t 基因的 p s u do m o n u s 分 r i n g a e D e 3 0 0 o 于 2 8 oC
在含有 一0 0 件gm/ L R i fa m p c i l i n , 5 林g /m L 卡那霉素的
固体 N Y G A 培养基上生长 Z d 后 , 再重新划板培养过
夜 . 刮取少量菌悬于 10 m m ol 几 M g cl : 中 , 调 丸。。至
.0 01 用注射器注人完全展开 的拟南芥叶片 , 用 10
mm ol/ L M gC I
: 作对照 . 不 同时间点取样 , 液氮速冻
后于一 80 ℃保存备用 .
i( v ) 蛋白质样品的抽提 . 取一定量 的材料 , 加
人 2 倍体积 (质量体积比 )的提取缓冲液 ( 10 m m ol L/
H e P e s
,
P H 7
.
5
,
5 m m o l / L E D T A
,
5 m m o l /L E G T A
,
10
m m o l /L D T T
,
10 m m o l /L N a 3 V O 4
,
10 m m o l /L N aF
,
5 0
mm o l zL p
一甘油磷酸 , 1 m m o lL/ PM s F, 5 林g /m L A n t i -
p a n
,
5 林g /m L A p r o t i n i n , 5 林g /m L L e u p e p t i n , 10%甘油 )
缓冲液中研磨提取 . 1 0 0 0 0 、 g 离心 20 m in . 上清液置
液氮 中快速冷冻 , 一 80 ℃保存备用 . 蛋 白质含量用
iB o
一
R ad 蛋 白质测定试剂盒测定 , 以牛血清白蛋 白作
标准 .
( v ) 凝胶中 M B P 依赖的 M A PK 活性分析 . 蛋
白质样品进行的 S D S 一PA G E 电泳 , 分离胶浓度 10 % ,
其中加人 0 . 1 m g/ m L M B P 电泳后的凝胶在去除 s D s
缓冲液中 (2 5 mm o l zL rT i s 一 H C I , PH 7 . 5 , 0 . 5 m m o l / L
D T T
,
0
.
1 m m o l / L N a 3V O 4
,
5 m m o lL/ N a E 0
.
1% T r i
-
t o n
一
x 10 0 (体积比 ) ) , 室温冲洗 3 次 , 每次 2 0 m i n . 再
于蛋 白质复性缓冲液 (4 0 m m o l /L H e p e s , p H 7 · 5 , 1
m m o l /L D T T
,
0
.
1 m m o l /L N a 3V o 4
,
5 m m o l /L N a F )中
使激酶在 4 ℃复性过夜 , 期间更换 3 次复性缓冲液 .
胶再放于 10 0 m L 反应缓冲液中 ( 2 5 mm o l L/ rT i s 一 H C I ,
PH 7 5
,
12 m m o l /L M g C 12
,
1 mm o lL/ D T T, 0
.
1 mm o l /L
N a 3v O 4 )
, 室温 3 0 m i n ; 胶接着放于 30 m L 含有 2 00
n m o l zL 灯P 和 5 0 林e i 丫’ 2 一p 一灯P (3 0 0 0 e i / n m o l )的反
应液中 , 室温 60 m in . 将凝胶转人含 5 %三氯乙酸和
1%焦磷酸钠 的反应终止液中 . 没有掺人的子 , Zp一 AT P
用反应终止液洗至少 6 h , 期间更换 5次溶液 . 胶置于
W ha tm an 3M 滤纸上 , 80 ℃真空干燥 . 用柯达 x A R 一 5
X
一片显影 .
( vi ) 免疫印迹 . 蛋白质样品的 S D S一队 G E 电泳
按 L ae m m il[ ` ” ]的方法进行 . 免疫印迹按 oT w b in 等
人 20[ 〕的方法进行 . 电泳后转移至硝酸纤维素膜上 . 所
用一抗为抗 lF ag 肤的单克隆抗体 M 2( 工作浓度 :l
1 0 0 0 0
,
s ig m a)
, 二抗为辣根过氧化物酶交联的羊抗
鼠 I g G (工作浓度 l : 10 0 0 0 , s i g m a ) , N a h G 蛋 白抗体为
兔抗 N ah G 蛋白的抗血清 〔工作浓度 1 : 10 0 , SY N -
G E N
AT iB ot ec hn ol og
y 公司惠赠 ) , 二抗为辣根过氧
化物酶交联的羊抗兔 gI (G 工作浓度 1 : 10 0 0 , S ig m .a)
用 R oc h e 公司化学发光试剂盒显色 , x 片显影 .
(而 ) 游离水杨酸含量测定 . 叶片游离水杨酸的
提取及含量测定参照 aY l p an i 等人 12 〕的方法 .
( v in ) N o r th e r n 杂交 . 叶片总 R N A 用 肠 12 0 1
(GI B C O 公司产品)试剂提取 . 总 RN A 经 1 . 2 %琼脂糖 -
甲醛变性凝胶电泳分离后 , 用 10 x S S C 转移至 Z et a -
P r o b e 膜 (B i o 一 R a d ) . 用 er j iP r im e l 随机引物标记试剂
盒 (A m e r s h a m 一 P h a rm a e i a B i o t e e h 公 司 产 品 ) 和 a -
3 2P
一
d e T P ( P a r k i n
一
E lm e : 公 司产品 )分别标记拟 南芥
m 乙
, 尸尺 z , 朋 5 c D N A 作为探针 , 按 e h u r e h 等人 t2 2 ]的
方法杂交和洗膜 .
24 3 8 WWW
.
S C IC h in a
.
C O m
论 文 第4 9 卷 第 23 期 2 0 04 年 , 2 月 科 考 流 叙
2 结果
.2 1 A tM E K sn
D表达诱导的细胞死亡和 H R 细胞死
亡均激活 4 4和 4 8 k D M A p K s
我们以前的研究表 明 , 转基因拟南芥中表达组
成型激活的 AI M E K S D 蛋白可引起快速细胞死亡 (类
似于 H R 细胞死亡 ) , 下游 4 和 48 k D M A P K 被激活 ,
而表达组成型失活的 AI M E K S KR 蛋白则不会 [`71 . 为分
析 A tM E K S 引起细胞死亡的机理 , 本研究比较这 2种
细 胞 死 亡 是 因为 , 拟 南 芥 (C ol 一 0) 植 株 可抗 带 有
va 犷RP t Z基因的尸 匀 ir ng a 。 D c 3 0 0o , 即植株接种该病
原菌时会发生 H R 反应 , 症状与 A tM E K SD 诱导的快
速细胞死亡相似 . 本文试图了解 A Mt E K SD 诱导的快
速细胞死亡的调控机理是否与该病原菌引起的 H R反
应相同或有交叉 . 图 1 结果显示 , 病原菌在未诱导转
基因表达的 A IM E凡 D , A IM E K 3KR , A tM E K 3WT 植株中
均能引起 H R 反应 , 并激活 4 和 48 kD 两个 M A P K,
而对照样品的 2个 M A PK活性很低 , 揭示病原菌引起
的 H R 反应和 AI M E K SD 引起的快速细胞死亡激活了
相似的 M A PK
我们以前免疫共沉淀结果证明 , 在烟草中 A Mt E K S
激活的 4 4 山和4 5 功 M好 K 分别是 w IP K 和 s I P K [ , 7 ] .
本文利用氨基酸序列 同源性分析方法 , 将 w PJ K 和
SI PK 与拟南芥基因组中 23 个 M A P K 的氨基酸序列
进行比较发现 (图 2) , 拟南芥中 AI M A P K : 与 W IP K 相
似性最高 (达 82 . 2% ) , A tM A P K 6与 SI P K 相似性最高
(达 8 % ) . 推测拟南芥中被激活 的 4 和 48 k D
M A P K S 分 别 是 AI M A P K : 和 AI M A P K 6 , 这 与
AI M A P K
: 和 A tM A P K 6 预测的分子量也相吻合 .
2
.
2 A t M E K
S 激活所诱导的细胞死亡不依赖于水
杨酸
为观察水杨酸在 tA M E K SD 蛋白表达所引起的
细胞死亡 中的作用 , 我们将携带有 A tM E K 3各类突变
基因的农杆菌转化 Na h G 烟草叶片 . 诱导瞬时表达后
的免疫印迹结果表明 , Na h G 基因和 A t入了E K乡各类突变
基因均表达 , 但仅 AI M E K SD 蛋 白的出现导致细胞快
速死亡 (图 3) . 结果显示 , N ha G 蛋 白的表达无法阻止
AI M E K
S
D 导致的细胞死亡 .
大量研究结果表明 , 带有 va 尹lR喃 基因的 尸 匀 -
ir n ge a D c 3 0 o o 在导致拟南芥植株产生 H R 反应过程
中可诱导水杨酸的迅速增加 , 并且 H R 反应表现出水
杨酸途径的依赖性 1[ 8 ,23 ,24] . 为排除烟草瞬时表达系统
中农杆菌的影响 , 本文选用 A z五夕E K j 突变基因的 T 3
代纯合体转基因拟南芥植株作父本 , Na h G 转基因拟
南芥作母本进行杂交 , 得到既可诱导表达 A tM E K : 突
变蛋白质 , 又可表达 N ha G 蛋白质的杂合体植株 , 测
定杂交植株中水杨酸含量 . 结果显示 , 喷施 D E x 后
图 1 病原菌处理引起 A 动夕l云K S转基因拟南芥植株中 H R 反应的发生及 4 和 48 k D M A P K 的激活
(a) 转基因植株叶片接种病原菌 24 h 后的照片 . 1示病原菌处理 , M 示 10 m m ol/ L M g 1C 2 对照 ) . (b) D E x 诱导转基因表达 24 h 后 的叶
片 , 其中 A tM E K乡D D 的表达导致细胞死亡 . ( c) 病原菌处理叶片 12 h 后 , 蛋白质提取液中 M A P K 的凝胶内活性分析 . (d) D E x 诱导转
基因表达 12 h 后 , 叶片蛋白质提取液中 tA M E K SD , IA M E K SKR 及 tA M E K SWT 蛋白的免疫印迹和 M A P K 的凝胶内活性分析的 . * 示 目
的蛋白
WWw
.
S C IC h in a
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科 考 近 叙 第 4 9卷 第 2 3期 2 0 0 4年 , 2 月 论 文
S IPK (瓜9 4 9 1 9 2)
A I划 A PK 6 (A t2 9 4 3 7 9 0)
A t M A卫 K 3 ( tA 3 9 4 5 6 4 0)
W I P(K D 6 l 3 77 )
AMt A PK 10 (A 3t 9 5 9 7 9 0 )
AMt
Z、 I) K 12 (A 2t 94 6 0 7 0 )
A IM A P K 4 (iA 4 9 0 13 7 0 )
AMt PA K S(iA 4g l l 3 3 0 )
A tM A PK 13 (A t l g 07 8 80 )
AMt PA K I (A
t l g l 0 2 10 )
A t M A PKZ ( A
t l g 5 9 5 80 )
A t入4 A PK 14 (tA 4 9 3 64 50 )
A tN】A PK 7 (A tZ g l s l 7 0)
A ,M A卫 K 2 2 (A 4t g l g l l o )
A IM A P K 2 3(iA 5 9 4 54 30 )
A t Nl z、 P K 2 1(A I4 9 1 30 20 )
A Mt A卫 K 1 8(A t l g 5 3 5 10 )
A tN I A PK Ig (A t3 g l 4 7 2 0)
A Mt
才、 1〕2K 0(tA 2妙 2 8 80 )
A I入I A I〕 K 1 6 ( A t5 9 19 0 1 0)
A tM A PK 1 7 (A 2t 90 14 5 0)
A t卜4 A PK g (A t 39 5 9 7 9 0 )
AMt A PK S (A t l g l s l 5 0 )
AMt A PK 15 (iA l g 7 3 6 7 0 )
A IM z、 PK l l (A t l g 0 15 6 0 )
图 2 拟南芥中 M A P K 与烟草 sI P K 和 w IP K 的氨基酸序列相似性比较的系统树
图 3 aN h G 转基因烟草中瞬时表达 AMt E K SD 蛋白可激活 4 和 48 k D 的 M A P K 并诱导细胞死亡
a() D E x 诱导 tA M E凡 D 蛋白表达 24 h 后诱导细胞死亡 . (b) 烟草叶片蛋白质提取液中 N ha G 蛋白, IA M EK SD , IA M E K S KR
和 A tM E K SW T 蛋白的免疫印迹及凝胶内 M A P K 活性分析
A t几夕五凡D x N ha G 杂合体植株仍快速死亡 , 而作为对
照的 A tM E K乡l{K x Na h G 植株则正常生长 (图 《 a) ) . 进
一步用免疫印迹和凝胶内激酶活性分析的结果表明 ,
杂交植株中 N ha G 蛋 白能正常表达 , tA M E K SD 和
A tM E K : K “ 蛋白诱导表达量也与未杂交植株无差别 ,
但仅 A tM E K SD 的诱导表达激活了 4 4 和 48 k D
M A P K S (图 4( b) ) . 游离水杨酸含量的测定结果表明 ,
在 A zM E K乡D O x Na h G , A t脚五K乡脚 x Na h G 杂交植株中
的 N a h G 蛋 白的表达均有效降低 了水杨酸含量 (图
《 c) , 表明该 M A P K 信号途径 的激活致死可能与水
2 4 4 0 Ww W
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图 4 Na h G转基因拟南芥中诱导表达 AI M E K SD蛋白可激活 4和 48 k D的 M A P K并诱导细胞死亡
a() Na h` 欠 A动留 EK s D D杂交植株诱导表达 A tM E K、 D蛋白导致细胞死亡 ; (b)杂交植株蛋白质提取液中 N ah G蛋白 , IA M E K S D 和
tA M E K
SKR 免疫印迹及凝胶内 M A P K 活性分析 ; ( c) A tM I三大几D。 , A 乙树石火 s KR 转基因植株及 Na h ` 又 A t八4 E K SD , Na h G x A m星石凡KR 植
株中 tA M E K : 蛋白诱导表达 12 h 后水杨酸含量测定
杨酸不相关或是处于水杨酸信号途径的下游 , 与在
烟草中瞬时表达的结果一致 (图 3) .
.2 3 tA M E K尹D 表达导致的细胞死亡与 H R 反应诱
导的防御基因表达有差别
带有 va 厂lR j tZ 基因的 尸 即 ir ng 。 。 D c 3 0 0 在导致
拟南芥植株产生 H R 反应过程中 , 会诱导包括 尸R 了、
PR 多和 PA L 等在内的 P R 基因的转录 . 为了进一步分
析 A tM E K ; 激活导致细胞死亡的信号途径与水杨酸
信号途径的关系 , 我们以转 A t叼五K SD 拟南芥植株为
材料 , 比较了病原菌引起的 H R 反应和 AI M E K SD 导
致细胞死亡过程中 PR ] , 尸R万和 PA L 基因的诱导情况 .
N o r t h e r n b l o t 检测结果表明 (图 5 ) , 在病原菌诱导的
H R 反应 中 , PR 了, PR 万 和 PA L 基因的转录被显著诱
导 , 而 A tM EKS D 导致的细胞死亡过程中仅 尸R S 基因
的转录被明显诱导 , 表明 A Mt E K ;激活导致细胞死亡
的信号途径不依赖于水杨酸信号 , 而不是处于水杨
酸信号途径的下游 .
S D D (+ D EX) S D D (感染 )
0 6 12 2 4 0 6 12 2 4 h
随奎攀瓤熟蛛蓬魏籍卖鹅藕排麟鑫彩;毅然 }游鑫娜攀魏鑫鬓琴襄毅撰撰寡襄翔
剔助
r RN A
2 8 5
18 5
图 S A 动夕石凡 D D 转基因植株诱导转基因表达导
致的细胞死亡和病原菌引起的 H R 反应过程中
朋基因诱导的 N o r , h e r n b zo t检测
W Ww
.
S C i o h i n a
.
C O m 2 4 4 1
科 考遨 叙 第 4 9卷 第 2 3期 2 0 0 4年 1 2月 论 文
3讨论
近年来 , 从植物中已克 隆出多种 M A P K K K 、
M A PK K 及 M A P K . 目前仅模式植物拟南芥中基因组
序列中就发现 60 种 M A PK K K , 10 种 M A P K K (包括
IA M E K
S)和 23 种 M A P K[ 25] . 因此 , 逐一搞清各成员
的上下游组分及其所介人 的信号转导途径 , 才能完
整理解拟南芥 M A P K 信号的重要功能及其作用机理 .
本文通过对 A Mt E凡进行的定点 , 产生无法激活
的 A tM E K S KR 蛋 白和持续激活的 tA M E K SD 蛋白质 .
这 2类蛋 白质在细胞中表达后就相当于该 M A P K K 控
制 的特定 信号 途 径 的关闭 ( A t M E K S K “ )和 开启
( A tM E K S D D )
. 结果发现 , 该信号途径的开启可直接
导致细胞死亡 , 表明 A Mt E K S途径直接参与了细胞死
亡 的调节 . D e s ik a n 等人 〔2 6 · 2 7 ]在用病原菌激发子
(el ic ot )r 处理拟南芥细胞时发现 , 病原菌激发子可诱
导细胞死亡 , 而且死亡过程中伴随着 M A P K 信号途
径的诱导激活 , 用 M A P K 途径特异性抑制剂可抑制
细胞 中 M A P K S 的活性 , 同时抑制了病原菌激发子诱
导 的细胞死亡 , 这是病原菌及其激活子可通过激活
M A P K 信号途径而导致细胞死亡的间接证据 . A s ia
等人哪」用拟南芥原生质体转化及免疫共沉淀实验证
明 , A tM E K K I一 A tM E K 4 /A tM E K S 一A tM A P K 3 / A tM A P K 6
在 fl g2 2 激发子诱导的病原菌防御反应 中起作用 . 但
用原生质体作为材料 , 因其细胞壁的缺失使细胞始
终处于受胁迫状态 , 而 A tM A P K 3 / IA M A P K 6 已被证明
受到多种胁迫的激活 29[ 一 , ’ 」, 使得结论趋于复杂化 . 本
文用永久转基因拟南芥植株作材料就消除了多种胁
迫条件的影响 , 提供了更直接的 M A P K 信号途径激
活启动细胞死亡的佐证 , 并且利用转基因植株还可
通过与其他信号途径突变体杂交 , 为 M A P K 途径与
其他信号途径之间的交叉调节提供 了方便 . 研究中
还发现 , A Mt E K : 蛋 白的激活引起细胞死亡过程中 ,
始终伴随着 4 和 48 k D 两个 M A PK 的激活 , 暗示分
子量为 4 和 48 k D 的 M A P K 可能是 tA M E K : 的磷酸
化 M A P K 最近 , 已有证据表明 , 烟草中的 sI P (K 分
子 量 为 48 k )D 的激 活 可 以导 致 细 胞 死 亡 , 而
W lP (K 分子量为 4 k )D 可 以加速 s IP K 导致的细胞死
亡 32[ 1 . 但拟南芥中的 4 和 48 k D M A P K 的功能是否
等同于 w IP K 和 sI PK 尚需制备特异的抗体来证实 .
AI M E K
S所导致细胞死亡表型与病原菌引起的 H R 反
应较为相像 3[, 3 ,34 」, 但其调控机制是否类似于 H R 反
应 ? 如果类似 , 则应是具有共同的信号调节途径和
24 4 2
下游激活基因 (包括 P R 基因在内 ) 、 水杨酸已被证明
在 H R 反应和随后引起的 S A R 中起关键作用 ,在植物
中转人水杨酸降解酶 N ha G 后 , 由于 N ha G 酶的出现 ,
使转基因植株中水杨酸含量 明显降低 , 以致病原菌
不能引起 H R 反应和产生 s A R I` 8 , , 5 ] . A tM E K , D D 在
aN h G 的转基因烟草中的瞬时表达和在 A动左E对 D x
aN h G 杂交拟南芥植株中的表达同样可诱导细胞死亡
的结果表明 , AI M E K S 激活导致细胞死亡的信号调节
可能不依赖于水杨酸途径或是处于水杨酸信号途径
的下游 . 以 L 是水杨酸合成途径中的关键酶 , PA L 基
因的转录受病原菌刺激快速诱导 , 与水杨酸的累积
相关 23[ , 36J . RP I 基因的转录依赖于水杨酸途径 I ’ 8 ,24 ,37] ,
尸R S 基因转录的可受水杨酸的诱导但不依赖于水杨
酸途径 l[ 8 ,24 ,38 科 0] . 研究 IA M E K S激活导致细胞死亡过
程中 PR 基因的转录时发现 , PA L 和 尸R l 基因的转录
水平未受诱导 , PR , 基因的转录明显被诱导 (图 5) , 证
明 A tME K S并非处于水杨酸途径的下游 . 但 H R 反应
和 A tM E K : 导致的细胞死亡过程中的 4 和 48 k D
M A P K 的激活表明两种细胞死亡过程的调控机理又
可能存在某些交叉点 .
在本研究中使用了可诱导 的表达系统 , 避免 了
在研究某些致死基因时 , 因使用组成型表达系统而
无法得到转基因植株的缺陷 . 立足于 A之脚E K , 的一系
列突变基因转基因植株 , 利用分子生物学和蛋 白质
组学方法阐明该途径所涉及的上下游组分 , 将有助
于理解细胞死亡的信号调节机制 .
致谢 Na h G 转基因植物和抗 N ha G 多克隆抗体由美国
S Y N G EN AT B i
o te c h 公司馈赠 : p私 7 0 0 2 由 e h u a N . H .博士
馈 赠 . 本 工作为 国家重 点基 础研 究发展规 划 (批 准号 :
Zo o 3 e B x一4 30 4 ) 、 国家自然科学基金 (批准号 : 3 03 7 0 2 4 0 和
30 27 0 6 4)
、 霍英东青年教师基金 (批准号 : 9 10 22) 及教育部
优秀青年教师资助计划资助项 目 .
参 考 文 献
H e a th M C
.
A P o P t o s i s
,
P r o g r a m m e d c e l l d e a t h a n d ht e h y P e r s e n s i
-
ti v e r e s Po n s e
.
E u r J P l a n t P a t h o l
,
19 9 8
,
10 4 : 1 17 ~ 12 4
M a r t i n G B
.
F u n e t i o n a l a n a l y s i s o f Pl a n t d i s e a s e r e s i s t a n e e g e n e s
a n d t he i r d o w n s tr e a m e ft e e t o r s
.
C u竹 O P i n i n P l a n t B i o l , 19 9 9 , 2 :
27 3 ~ 2 7 9
D i x o n R A
,
H a r r i s o n M
,
L a m b C J
.
E a r ly e v e n t s i n t h e a e t i v a t i o n
o f P l a n t de fe n s e r e s P o n s e s
.
A n n u R e v P h y t o P a t h o l
,
19 94
,
3 2 :
47 9 ~ 5 0 1
Jo n e s J D G A ki n a s e w i th k e e n e y e s
.
N a t u r e
,
19 9 7
,
3 85 : 3 97 一
39 8
.
WWW
.
S C IC h in a
.
C 0 m
论 文 第4 9卷 第 23 期 20 04 年 , 2 月 科 考 遨 报
5 B a k e r B
,
Z a m b r y s k i 只 S t a s k a w i e z B , e t a l . S ig n a l i n g in
P l a n t
一
m i e r o b e i n t e r a e t i o n s
.
S e i e n e e
,
1 9 97
,
27 6: 7 2 6刀 33
6 R y a l s J A
,
N e u e n s e h w a n d e r U H
,
WI l l i t
s M G, e t a l
.
Sy s t e m至e a e -
q u i r e d r e s i s t a n e e
.
Pl a n t C e l l
,
1 9 9 6
,
8 : 18 0 9、 1 8 1 9
7 M a l a m y J
,
C a r J 只 K l e s s i g D 只 e t al s a l i e y l i c a e i d a l ik e l y e n -
d o g e n o u s s ig n a l i n t h e r e s i s t a n e e r e s P o n s e o f t o b a e c o t o v i r a l in
-
fe e t i o n
.
S c i e n e e
,
19 9 0
,
2 5 0 : 10 0 2、 10 04
8 J o n a k C
,
O kr s 6 z L
,
B 6 g r e L
,
e t a l
.
C o m P l e x i t y, e r o s s t a l k a n d i n
-
t e g r a ti o n o f Pl a n t M A P ki n a s e s i g n a l i n g
.
C u r r O Pi n i n P l a n t B i o l
,
2 0 0 2
,
5 : 4 15礴 24
9 C h a n g L
,
K a r i n M
.
M a m m a 1i a n M A P ik n a s e s ig n a l i n g c a s e a d e s
.
N a t u r e
,
2 0 0 1
,
4 10 : 37科0
10 D a v i s R
.
S ig n a l tr a n s du e t i o n b y J N K g r o u P M A P k i
n a s e s
.
C e l l
,
2 0 0 0
,
10 3 : 2 39 ~ 2 52
1 1 W i dm a n n C
,
G b s o n S
,
J a r P e M B
.
M i t o g e n
一
a e t i v a t e d Pr o t e in
k i n a s e : C o n s e r v a t i o n o f a t h r e e
一
k i n a s e m o du l e fr o m y e a s t t o h u
-
m a n
.
P h y s i o工R e v , 19 99 , 7 9 : 1 4 3、 1 80
1 2 H i r t H
.
M A P k i
n a s e s i n P l a n t s ig n a l t a n s d u e t i o n
.
R e s P r o b C e l l
D i f
,
20 0 0
,
2 7 : 1刁
13 Z h a n g S
,
K e l s s i g D F
.
P a t h o g e n
一
i n d u e e d M A P k i
n a s e i n t o b a e e o
.
R e s P r o b C e l l D i ft
,
20 0 0
,
2 7 : 65 、 84
14 S o m s s i e h I E
,
H比 l b r o e k K . P a t h o g e n d e fe n e e i n P l a n t s 一 a Pa r a -
d ig m o f b i o l o g i e a l e o m P l e x i t y
.
rT e n d p l a n t S e i
,
19 9 8
,
3 : 8 6~ 9 0
15 S e h e e l D
.
R e s i s t a n e e re s P o n s e Ph y s i o l o g y a n d s全g n a l tr a n s d u e it o n .
C u r r O P i n i n P l a n t B i o l
,
19 9 8
,
l : 3 0 5月 1 0
16 L e v i n e A
,
eT
n h a k e n R
,
D i x o n R
,
e t a l
.
H Z O Z fr o m t h e o x i d a t i v e
b u r s t o r e h e s t r a t e s t h e Pl a n t h yP e r s e n s i t i v e d i s e a s e r e s i s t a n e e r e
-
s P o n s e
.
C e l l
,
1 9 94
, 7 9 : 5 8 3巧 9 3
17 R e n D T, aY
n g H P, Z h a n g 5
.
C e l l d e a t h m e d i a t e d b y M A P K 15
a s s o e i a t e d w i th h y d r o g e n Pe r o x i d e Pr o d u c t i o n i n A ar b id o P s i s
.
J
B 10 1 C h e m
,
2 0 0 2
,
2 7 7 : 5 5 9一 5 6 5
1 8 D e l a n e y T P, U k n e s S
,
Ve
r n o o ij B
,
e t a l A e e n t r a l r o l e o f s a l i e y l i e
a e i d i n P l a n t d i s e a s e r e s i s t a n e e
.
S e i e n e e
,
19 9 4
,
2 6 6
,
12 4 7~ 1 2 5 0
1 9 L a e rn m l i U K C l e a v a g e o f s t r u e t u r a l Pr o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b ly
o f t h e h e a d o f b a c t e r i o P h a g e T 4
.
N a t u r e
,
19 7 0
,
2 2 7 : 6 8 0 ~ 6 8 5
2 0 oT w b i
n H
,
S t a e h e l i n T
,
G o r d o n J
.
E l e e t r o P h o r e t i e t r a n s fe r o f P r o
-
t e i n s fr o m Po l y a C r y l a m id e g e l s t o n i t r o e e l l u l o s e sh e e t s : P r o c e d u t e
a n d s o m e a P P l i e a t i o n s
.
P ro
e N a tl A e a d S e主 U S A , 〕9 7 9 , 7 6 :
4 3 5 0
、 4 3 5 4
2 1 aY l
P a n i N
,
S i l v e r m a n P, W i l s o n T M
,
e t a l
.
S a l i c y l i c a c i d 15 a Sy s
-
t e m i e s i g n a l a n d a n i n d u e e r o f P a th o g e n e s i s
一
r e l a t e d Pr o t e i n s i n v i
-
r u s
一
i n f e e t e d t o b a e e o
.
P l a n t C e l l
,
19 9 1
,
3 : 80 9一 8 1 8
2 2 C h u r e h G, G i l b
e r t W G
e n o而 e s e q u e n e i n g . Pr o c N a t l A e a d S e i
U S A
,
1 9 84
,
8 1 : 19 9 1~ 1 9 9 5
2 3 R y a l s J A
,
N e u e n s e h w a n d e r U H
, 狱 l l i t s M G, e t a ]. S y s t e m i c
a q u i r e d r e s i s t a n e e
.
p l a n t C e l l
,
19 9 6
,
8 : 18 0 9一 18 1 9
2 4 N a w r a th C
,
M t6
r a u x J
.
S a l i e y l i e a e i d i n d u e t i o n
一
d e if e i e n t m u t a n t s
o f A ar b id叩 5 15 e x P r e s s e s P R 一 2 a n d P R 一 5 a n d a e e u m u l a t e s h i g h
l e v e l s o f e a m a l e x i n a ft e r P a t h o g e n i n o e u l a it o n
.
P l a n t C e l l
,
19 9 9
,
1 1 : 1 3 9 3~ ] 4 0 4
2 5 Ie h im u r a K
,
eT
n a q H e n r y 丫 e t a l . M i t o g e n 一 a e t i v a t e d P r o t e i n
ki n a s e e a s c a d e s i n P l a n t s : A n e w n o m e n e l a t u r e T r e n d P l a n t S e i
,
20 0 2
,
7 : 30 1~ 3 0 8
2 6 D e s i k a n R
,
C l a r k e A
,
A t h e r fo l d E e t a l
.
H a r Pi n i n du e e s m i t o
-
g e n
一
a e it v a招 d P or t e i n k i n a s e a c 巨v i t y d u ir n g d e fe n s e er s P o n s e s i n
A r a b idOP
s i s s u s P e n s i o n e u l t u r e s
.
P l a n t a
,
1 99 9
,
2 10 : 9 7一 1 0 3
2 7 D e s i k a n R
,
H a n e o e k J T
,
I e h im u r a K
,
e t a l
.
H a r P i n i n du e e s a e t i v a
-
t i o n o f A r a b idOP
s i s m i t o g e n
一
a e t i v a t e d P r o t e i n ik n a s e s A tM P K 4
a n d A tM P K 6
.
P l a n t P h y s i o l
.
,
2 0 0 1
,
12 6 : ] 5 7 9 ~ 15 8 7
2 8 A s i a T, Ti n a q p l o t n i k o v a J
,
e t a l
.
M A P k i
n a s e s i g n a l l i n g e a s e a d e
i n A ra b id oP
s i s i n n a t e im m u n i t醉 N a t u r e , 20 0 2 , 4 15 : 97 7~ 9 8 3
2 9 K o v t o n Y, C h i u W
,
eT
n a q e t a l
.
F u n e t i o n a l a n a ly o i s o f o x id a t i v e
s t r e s s
一
a e t i v a t e d m i t o g e n
一
a c t i v a t e d Pr o t e i n k i n a s e e a s e a d e i n P l a n t s
rP o e N a t l A e a d S e i U S A
,
2 0 0 0
,
9 7 : 2 9 4 0犯9 4 5
3 0 N d h s e T S
,
P e e k S C
,
H i r t H
,
e t a l
.
M i
e r o b i a l e l i c i t o r i n d u c e a e t i
-
v a t i o n a n d d u a l Ph o s Ph o r y l a t i o n o f t h e A ar b id叩 5 15 t h a l i a n a
M A P K 6
.
J B i o l C h e m
,
2 00 0
,
2 7 5 : 7 5 2 1刀 5 2 6
3 1 Ie hi m u r a K
,
M i
z o g u c h i T
,
Ir i e K
,
e t a l
.
Va
r i u s a b i o r i e s t r e s s e s r a P
-
i d l y a e t i v a t e s A r a b idOP
s i s M A P k i
n a s e s A tM P K 4
a n d A t M P K 6
.
P l a n t J
,
2 0 0 0
,
2 4 : 6 5 5 ~ 66 5
3 2 L i u 丫 J i n H , aY n g K , e t a l
.
I n t e r a e t i o n b e t w e e n tw o m i t o
-
g e n
一
a e t i v a t e d P r o t e i n k i n a s e s d u r i n g t o b a e e o d e fe n s e s i g n a l i n g
.
P l a n r J
,
2 0 0 3
,
3 4 : 14 9 ~ 16 0
3 3 W h a l e n M C
,
In n e s R 砚 B e n t A , e t a l . Id e n t i if e a t i o n o f P s e u d o -
爪 o n a s s 夕r i n g a e P a t h o g e n s o f A ra b idOP s i s a n d a b a e t e r i a l l o e u s
d e t e r m i n i n g a v i r u l e n e e o n b o t h A ra b idOP
s i s a n d s o y b e a n
.
P l a n t
C e l l
,
19 9 1
,
3 : 4 9~ 5 9
3 4 K l e m e n t Z
,
H y Pe r s e n s i t i v i t y
.
I n : M o u n t M S
,
L a c y G H
,
e d s
.
P h y
-
t 0 P a t h o g e n i c P r o k a r y o t e s
.
N e w
OY
r k : A c a d e m i e P r e s s
.
14 9 、 17 7
3 5 G a fn
e y 卫 rF i e d r i e h L , Ve r n o o ij B
.
R e q u ier m e n t o f s a l i e y l i e a e i d
fo r t h e i n d u e t i o n o f s y s t e m i e a q u i r e d r e s i s t a n e e
.
S e i e n e e
,
19 9 3
,
2 6 1 : 7 5 4刃 5 6
3 6 D o n g X
,
M i
n d r i n o s M
,
D a v i S K R
.
In du e t i o n o f A r a b id叩 5 15 d e -
fe n s e g e n e s b y v i r u l e n t a n d a v i r u l e n t P s e u d o m o n a s s 夕r i n g a e
s t r a i n s a n d b y a e l o n e d a v i r u l e n c e g e n e
.
P l a n t C e l l
,
1 9 9 1
,
3 : 6 1刀 2
3 7 U k n e s S
,
M au e h
一
M
a n I B
,
M
o y e r M
,
e t a l
.
A q u i r e d r e s i s t a n e e i n
A ra b i dOP
s i s
,
P l a n t C e l l
、
19 9 2
,
4 : 64 5硒 5 6
3 8 G l a z e b r o o k J
,
R o g e r s E E
,
A u s u b e l F M
.
I s o l a t i o n o f A ra b id
口尸5 15
m u t a n t s w iht e n h a n e e d di s e a s e s u s e e P it b主l i t y b y d jre e t s e r e e n i n g
G e n e t i e s
,
19 9 6
,
14 3 : 9 7 3 ~ 9 8 2
3 9 R o g e r s E E
,
A u s u b e l F M
.
A r a b id叩 5 15 e n h a n c e d d i s e a s e s u s e e P t i -
b i l i t y m u t a n t s e x h ib i t e n h an c e d s u s e e P t i b i l i t y t o s e v e r a l b a e t e r i a l
P a t h o g e n s a n d a l t e r a t i o n s i n P R
一
1 g e n e e x Pr e s s i o n
.
P l a n t C e l l
,
19 9 7
,
9 : 3 0 5 ~ 3 16
40 Z h o u N
,
OT
o t l e T L
,
T s u i E e t a l
.
PA D 4 fu
n e t i o n s u P s t r e a m fr o m
s a l i e y li c a e id t o e o n tr 0 1 de fe n s e r e s P o n s e s i n A r a b i凉o1 〕5 15 . P l a n t
C e l l
,
1 99 8
,
10 : 1 02 1~ 1 0 30
( 2 0 04
一
0 9
一
0 5 收稿 , 2 0 0 4 一 1 1一 2 2 收修改稿 )
w WW
.
S C IC h i n a
.
C O m 2 4 4 3