全 文 ：第 3 4 卷第 1 期
2 0 0 5 年 3 月
上海师范大学学报( 自然科学版 )
Jo um目 Of S ha ng ha iN o mr 日 U n ive rs it y( N at u司 S e ie e e s n)
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3 4
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1
2 0 0 5
.
M a r
.
拟南芥雄性不育突变体
E C Z
·
1 5 7 基因的精细定位
刘慧娟 , 张在宝 , 高菊芳 , 杨仲南
(上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海 20 23 4 )
摘 要 : 通过背景纯化与遗传分析 , 从拟 南芥雄性不育突变体中筛选到一株隐性单基因控制
的雄性不育株 E CZ 一 157 . 细胞学观察表明 , 突变体的花药中不形成花粉粒 . 利用 图位克隆的方
法对不育基因 m s巧 7 进行 了定位 , 结果表明 m s巧 7 位于第四条染 色体上分子标记 C IW7 和
1T 3 1K 4 之间 28 5 kb 的区 间内 目前 尚未见到该区间雄性不 育基因的报道 , 因此 m sl 57 是一个
新的雄性不育基因 .
关键词 : 拟南芥 ;雄性不育 ;图位克隆 ;精细定位 ;花药发育
中图分类号 : 3Q 4 ` . 4 文献标识码 : A 文章编号 : 10 一 37( 20 05) 01 ( 心5 8刁6
0 引 言
花药及花粉的发育是植物功能基因研究的一个重要方向 , 花药及花粉发育异常会导致雄性不育 . 雄
性不育是生产上杂交制种的基础 , 因此对花药及花粉发育的深人研究既具有理论研究意义 , 又具有实际
应用价值 . 突变体是研究花药及花粉发育机理的一个有效方法 ,通过分离雄性不育突变体可以分离花药
和花粉发育所必需的基因 ,并对这些基因的功能进行研究 .
许多高等植物中都存在着雄性不育现象 〔` 一 4 3 ,它们与花药形态 、体细胞与生殖细胞的发育 、小抱子
发生 、 花粉发育 、花药的开裂等相关 ,但大部分雄性不育基因还没有被克隆出来 〔’ 〕 . 由于拟南芥基 因组
小 、生长周期短 、 突变体易筛选和鉴定 、容易克隆基因等优点卜 ’ ] , 目前已发表的的雄性不育基因大部分
是从拟南芥中克隆的 . 据文献报道估计有 3 50 个特异性基因参与了拟南芥花药发育过程 〔’ 」 ,其中 60 -
10 个基因为花药发育所必需 ,任何一个基因的突变都将会导致植物的雄性不育 i ’ 。〕 . 国际上 已经从拟
南芥中克隆了 20 多个雄性不育基因并对其功能进行了研究 ,按照基因功能可分为 3 类 : 第一类与茉莉
酮酸合成有关 . 第二类与转录因子有关 . 第三类与减数分裂相关 . 除这 3 类雄性不育基因外 , 还有其他一
些雄性不育基因 .
图位克隆 ( M a p 一 b a s e d e lo n i n g )又称定位克隆 ( p o s i t io n a l e lo n i n g ) 19 8 6 年首先由剑桥大学 的 A l a n
co ul so n 提出 ,其原理是通过寻找与目的基因相连锁的分子标记来进行基因定位的一种正 向遗传学的基
因克隆方法 . 由于 2 00 年拟南芥全基因组测序工作的完成以及大量分子标记的发展 , 使得图位克隆技
收稿日期 : 2X() 4刀 9一2
基金项 目: 教育部留学回国人员基金 ;教育部优秀青年教师基金 .
作者简介 : 刘慧娟 ( 19 7 一 ) , 女 , 上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生 . 杨仲南 ( 1 965 一 ) , 男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院教授 .
第 1期 刘慧娟 , 张在宝 , 高菊芳 ,等 : 拟南芥雄性不育突变体 E CZ 一15 7 基因的精细定位
术在拟南芥中的应用越来越方便 ,
筛选到一株经 E M S 诱导的拟南芥雄性不育突变体 E C Z一 157 . 该突变体的果荚短小 ,不育 . 本文对该
突变体进行背景纯化 、 遗传分析 、 细胞学观察 , 并用 图位克隆的方法对不育基因 m sl 57 进行了精细
定位 .
1 材料与方法
1
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1 材料
1
.
1
.
1 植物材料
野生型拟南芥 ( A r ab i d o p s i s ht a l i a n a ) : 生态型 Co l u m b i a ( C o l ) ,生态型 肠 n s b e飞 e r e e t a ( eL r ) , 由本实
验室种植 .
拟南芥突变体 E C Z 一 157 : 由中科院上海植物生理生态研究所黄海研究员惠赠 .
1
.
1
.
2 分子标记
分子标记 F C7A ,兄 1CZ O , 1T 3 1K 4 ,卯 2K , IT O2C 1 , 1T 6 LI 是根据网上公布的拟南芥基因组多态性 ,
并利用软件 P ir m er p er m ie r 5 . 0 设计的 nI D el 分子标记 , C珊 7 分子标记来自文献报道 ,引物的序列由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成 .
1
.
2 方法
1
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2
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1 雄性不育突变体的鉴定
将拟南芥种子泡在 0 . 1% 的琼脂糖中 , 4℃春化 2 一 4 d ,种植于混合土成份为黑土 : 蛙石 : 珍珠岩
( :1 :6 0
.
2 5 )的盆中 . 放置于 2 一 25 ℃的培养室中 ,一个月后可以观察植株的表型 ,并区分野生型与突
变体 .
1
.
2
.
2 对突变体进行遗传分析
以野生型 玩 r 为父本 ,突变体 E C Z 一 1 57 为母本进行回交得到 lF 代 , 1F 代自交得到 程 代 . 种植 凡
代 ,观察 兄 代表型 ,并统计 兄 代中可育植株与不育植株的比例 .
1
,
2
.
3 花药的细胞学观察
野生型与突变体植株的花序在 FA A 固定液 ( 95 % 乙醇 : 冰醋酸 , 福尔马林 : 蒸馏水 = 10 : :1 :3
7) 中固定 12 ~ 24 h 后 ,用 50 % 乙醇洗 2 一 3 次 . 接着用正丁醇脱水 、透蜡 、包埋 、切片 . 常规石蜡切片 ,片
厚 7 一 10 林m ,脱蜡后用 0 . 5 % Sa if ’a n in T 染色 , 常规脱水 、透明 、封片后在显微镜下观察并拍照 .
1
.
2
.
4 兄 遗传群体的建立
以突变体 E C Z 一15 7 为母本 ,野生型 oC l 为父本杂交得到 1F 代 , lF 代自交得到几 代 , 收集 兄 遗传
群体中的突变体用于基因定位 .
1
.
2
.
5 雄性不育基因的初定位
( l) 选取 50 株突变体 .
( 2) 抽取植物的总 DN A : 取突变体材料于离心管中加 60 0 林L 场 51 bu fe r ( .0 Z M rT .is CI p H S· O ,
0
.
05 M E DT A p H 8
.
0
,
7 M 尿素 , 2% 十二烷基肌氨酸钠 )研磨 ,加 50 协L 酚 /氯仿 ; 12 , o o r/ m in 离心
s m i n
,取上清 ;加 6 0 0林 L 异丙醇 , l八 0 体积 3 M N a o A C ( p HS . 2 ) ; 12刀OO r/ m i n 离心 10 m i n ,弃上清 ; 7 0%
的酒精洗一次 , 37 ℃干燥 , 加人 50 卜 L 无菌水 , 一 20 ℃保存 .
( 3 )分别取 DN A Z林L ,每 10 株 DN A 混在一起制备成 5 个 DN A 池 ,用设计的分子标记为引物进行
P CR 扩增 .
( 4 ) CP R 的反应体系 : 总体系为 30 林L ,在 0 . 2 m L 的 PC R 离心管中加人下列试剂 : 无菌水 20 . 5 林L ,
10 x p C R 缓冲液 3 林L , dN TP ( Zo m M ) 2林L , 上游引物 ( l o pm o l ) 1 . 5 林L , 下游引物 ( l o p m o l ) 1 · 5林L , DN A
模板 1林L , T a q 聚合酶 0 . 5林L . 混匀 .
( 5 ) P C R 反应程序 : 将反应的 P C R 离心管置于 P C R 仪中 , 9 5℃预变性 3 m i n , 94 ℃变性 2 0 5 , 5 2℃ 退
6 0 上海师范大学学报 (自然科学版 ) 2 0 5 年
火 20 5 , 7 2℃ 延伸 2 0 5 ,循环次数为 4 5 个 ,在 7 2℃保持 IOm i n .
PC R 反应结束后 ,用 3 . 5% 的琼脂糖进行电泳 ,并利用 T an on GI S 凝胶图像处理系统拍照 .
1
.
2
.
6 雄性不育基因的精细定位
用高通量提取 DN A 的方法 毛” 〕提取突变体单株 DN A ,筛选合成新的分子标记对这些植株进行基因
型分析 ,对 目的基因进行精细定位 .
2 结果分析
2
.
1 突变体的表型观察
E c Z
一
157 突变体是经化学诱变剂 E M s 诱导拟南芥野生型 eL r 筛选得到的 . 突变体果荚生长缓慢且
短小 、萎缩 ,成熟后不含种子 (图 1 , 2 ) . 当用野生型的花粉和突变体的雌蕊杂交后突变体产生了种子 ,说
明突变体是雄性不育 .
讯 : 野生型 , m , : 突变体 E CZ 一巧 7 ,箭头为果荚
图 1 野生型和突变体植株形态比较
wt :野生型 , m s :突变体 EC Z一 1 57
图 2 野生型和突变体的果英比较
为了研究该突变体在花药发育过程中出现的异常 ,我们通过石蜡切片技术在显微镜下观察花药不
同时期的发育情况 . 结果表明 ,在花药发育的前 6 个时期 ,突变体的花药和野生型一样发育正常 ,形成了
正常的小抱子母细胞 . 而从花药发育第 7 个时期以后 , 突变体和野生型有了明显的差异 , 主要表现为 : 在
第 7 时期野生型小抱子母细胞经过减数分裂形成了四分体 ,在第 12 时期绒毡层消失形成成熟花粉粒 ,
第 13 时期开始释放出来从而完成了花药发育的全过程 . 而突变体在第 7 个时期不能形成四分体 , 同时
绒毡层细胞明显变大且有过多的空泡 , 在以后时期花药室内中空没有花粉粒 ,在第 13 时期不能释放出
花粉粒 ,不能完成正常的花粉发育 ( 图 3 ) .
2
.
2 突变体的遗传分析与背景纯化
突变体 ECZ 一 157 与 eL r 回交后 , lF 代为正常可育 ,说明该突变体是隐性基因控制的 . 兄 代中出现育
性分离 , 可育植株 17 7 株 ,不育植株 60 株 ,两者比例接近于 :3 1 ,符合孟德尔定理 ,可以判断出是单基
因控制的 ,我们将该基因命名为 M S 15 7 .
2
.
3 利用图位克隆技术进行不育基因的定位
共有 24 个分子标记用 于 M 1S 57 基因的初定位 . 其中 18 个 nI D el 分子标记由本实验室根据网上
( w
w
.
ar ab 记叩51 5 . or g )公布的拟南芥全基因组 DN A 多态性数据库筛选得到 , 另外 6 个 S LP 分子标记
根据文献报道设计 , 利用这些分子标记对 M S 15 7 基 因定位 ,结果表明该基因位于拟南芥第四条染色体
上 , 与分子标记 7F KZ 紧密连锁 (图 4 ) .
为了进一步对 M S 15 7 进行精细定位 ,在 7F KZ 左右分别设计分子标记 咫 I C 20 和 IT OC 21 . 利用这 3
第 l 期 刘慧娟 , 张在宝 , 高菊芳 ,等 : 拟南芥雄性不育突变体 E CZ 一巧 7 基因的精细定位
左边为野生型 ( wt ) 右边为突变体 ( m s ) ;第 7 时期 : 四分体形成 ;第 13 时期 : 花粉粒释放
E :表皮 ; E n :药室内壁 ; C : 连接细胞 ; T : 绒毡层 ; tlS 毛:裂 口 ; 1’d , : 四分体 ; v : 微管束 ; P C : 花粉粒
图 3 野生型和突变体花药发育部分时期花药的横切图
左图为分子标记卯 2K ;右图为分子标记 F13 2K 3 1 一 5 : 5 个 D N A 池分别为模板 , L : 址r 为模板 , C : oC l 为模板
图 4 MS巧 7 基因初定位的部分电泳图
个分子标记分别对约 80 株突变体进行基因型分析 ,结果表明不育基 因定位于 FZ 1C 20 和 7F KZ 之间
73 1 kb 范围内 . 在这一区间内我们又设计 nI D el 分子标记 1T 3 1K 4 和 S LP 分子标记 CI W 7 ,通过对突变
体单株的基因型分析 ,将 M 1S 57 基因定位于 IT 3 1K 4 和 CI W7 之间的 28 5k b 范围内 (图 5) .
3 讨 论
3
,
1 M s1 57 基因突变引起雄性不育的可能机理
花药发育一般分为两个过程 14 个时期 〔’ 2〕 ,第一个过程 ( l 一 7 时期 )包括组织特异性的分化 、形态
发生和减数分裂 ,其中的 5 一 7 时期小抱子母细胞进行减数分裂形成四分体 ,第二个过程 ( 8 一 14 时期 )
包括四分体形成后细胞的分化 、 花粉粒释放和花药开裂 〔` , , ’ ` ] . 分析 E c Z 一 1 57 突变体 , 发现在花药发育的
第 7 个时期不能形成四分体且绒毡层细胞发生明显的改变 . 因此推测 M S 15 7 基因可能是减数分裂过程
或绒毡层发生的一个关键基因 . 绒毡层对花粉粒的发育是必不可少的 ,它所分泌的物质为花粉粒的发育
提供了重要 的作用 ,在花粉发育过程中减数分裂是否正常也极其重要 ,大部分雄性不育突变体发生在减
数分裂阶段 〔` } ,发生在减数分裂过程的事件包括有同源染色体联会 、交叉形成 、重组 、 染色体分离和胞
质分裂 〔” 一 `9 〕 , 究竟是小抱子母细胞在减数分裂过程中的哪个事件相关基因发生了突变或影响绒毡层发
育的哪个基因发生了突变 ,还需要进一步的研究 .
3
.
2 雄性不育基因的定位
通过筛选出有单基因控制的突变体 ,然后进行初定位和精细定位 ,最初把雄性不育基因定位于分子
上海师范大学学报 (自然科学版 ) 2 0 5年
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1 0 C Z { ( l几9 8 5 k肠
f ) 6 } 飞〔 1 6 1 6 8 k 仓
t 8 6 6 2 k b
. 代表着丝粒的位置 . 代表定位基因的位置
图 5 M S巧 7 基因的定位 . M S 157 定位在第四条染色体分子标记 CI W7 和 1T 3 1K 4 之间 .
标记 2F 1 C 20 和 7F KZ 之间的 7 3 1kb 范围内 , 但在该 区间 已经有报道存在一个雄性不育基因 M s
ge n e侧 ,且影响着花药的减数分裂不含有花粉粒 . 为了确定是否与雄性不育基因是同一个基因 ,我们从
突变体 ECZ 一 157 中克隆了该基因并进行了测序 ,测序结果表明该基因仅一个核昔酸发生了改变 ,但所改
变的核昔酸未必会引起该基因的突变 , 因此所发现的雄性不育基因很可能是一个新基因 . 现在已经把该
雄性不育基因定位在 2 85 kb 范围内 ,与已经发表的拟南芥中雄性不育基因相 比较 ,在此区间还没有雄性
不育基因的报道 ,这就更一步确定了该基因是一个新基因 . 目前我们正在进一步缩小区间 、克隆基因 ,并
对基因的功能进行研究 .
参考文献 :
[ l 〕
〔2 〕
〔9 〕
班 e K e M . ce n e t ie s an d dve e lo pm e nt of in n e m己 e 一 s t e ir le t o m at o m u t a n t s〔J〕. H i lg耐 ia , 194 8 , 15 : 59 9 一 6 33 .
VA N DE R V E E N J H
,
W IRTZ P
.
EM S
一
i n d
u e e d ge
n
i
e m al e
一 s t e ir l ity i
n A abr ido p
s i s th碰an a : a mo d e l s e le e t io n e x P e ir m e n t
[ J〕, E u phy it e a , 1 96 8 , x7 : 37 1 一 37 7 .
A印E R铭 E N M C , p H I川PS R L . D e v e l o p m e n t al c yt o fo g y 。 f 1 3 g en e it e m ale set ir l e OCI i i n m ia ez 〔J〕. C an J G e n e t C y -
t ol
,
198 1
,
2 3 : 195 一 2 08
.
KA U L M L H
.
M 已e s t e ` il t y i n H ig he r p la n t ( M o no 歹叩ha on t heor 6
e al an d 印 lP i e d g e n e t i e s , v ol 10 ) 仁M ] . S p ir n g e r V e r -
l铭 B e lr in , 1988 .
AA RAT M G M
,
D IRK S E W G
,
ST I EK EM A M J
,
P ERE IR A A
.
T
r
an
s p o s o n t a g g i n g Of
a m 吐e s t e ir l iyt 罗 n e i n Aabr i d o p -
5
1
5
[ J j
.
N at u er
,
199 3
,
36 3 : 7 15 一 7 17
.
兀DL M AN N K A . T一 DN A in s e rt ion m m a g e n e s is in A r ab id o p s is : M u t iat o n成 s p e e tur m 〔J ] , lP a n t J , 1 99 1 , 1 : 7 1 一 82 ,
C H AN D H U RY A M
.
N
u e
l
e a r g e n e s e o n t ro 山 n g m al e fe rt ili ty [ J ] . P lan t s C e l , 19 93 , 5 : 127 7 一 12 83 .
FO R ST H O EFE L N R
,
W U Y
,
S CH U LZ B
,
BEN N E T T M J
,
FE L DM A NN K A
.
T
一
D N A i n s e rt io n m u t a g e n e s i s in A rab i
-
d
o p s i s : p or
s p e e t s an d P
e sr p e e t iv e s〔J〕. A u s t J p lan t p h y s i o l . 19 92 , 1 9 : 3 53 一 366 .
s A N DE R s P M
,
B tj x A Q
,
e o L n B E R e R B
.
A
n th e r d e v e lo p m e n t al d e fe e t s in Aabr id
o p s is th山 an a m al e 一 s t e ir le m u tan t s
[ J ] S
e x lP a n t R e p ur
,
19 99
,
1 1
:
297 一 32
.
勺.J,1工
r
l门j
4
ùtúresL一esL`
, l.l Jes,J
U`7口ù
第 1期 刘慧娟 , 张在宝 , 高菊芳 , 等 : 拟南芥雄性不育突变体 E CZ一巧 7 基因的精细定位 6 3
[ 10 ] WI LS O N Z A
,
M O R RO L L S M
,
IT G H E p J
.
hT
e A r a b id
o P s i s M A比 SET RI L IT Y I ( M S I ) 郎 ne 15 a t r an s e it p t io n al er 列 a -
t o r Of m al e g a m e t o g e n e s i s
,
iw t h h o m ol goy
t o th e p H D
一
if n g e r af m ily of t
r a n s e ir p t io n acf
t o sr [ J〕. lP an t J , 2X() 1 , 2 8 ( 1 ) :
2 7 一 39
.
[川 X I N Z G , vE L 陀N J p , o l v E R M J , B U RK E J J . H ig h 一 thr o u g hp u t D N A ext ar e t i o n m e thod s u it ab le fo r p C R仁J」. B i o -
t e e h in q u e s
,
2 0 03
,
34
:
l 一 6
.
[ 12 〕 C H AN D H U RY A M . N u cl e ar g e n e s e o n t拍压 n g m al e fe rt i liyt [ J ] . p lant s C el , 1 993 , ( 5 ) : 127 7 一 12 83 .
〔1 3 1 K O L UN OW A M , 饮 UE r门刊 ER J , CXo K H , W A几R OT H M , G O LD BE R G R B . D溉二 n t tem Por al a n d s p at i al g e n e e x -
p er
s s io n p at t e nr s co
e ur d iur
n g an th
e r dve el
o p m e nt 〔J ] . lP an t C e l l , 19 90 , 2 : 12 0 1 一 12 24
[ 14 ] G O LD B E RG R B
,
B E A LS T p
,
S ANDE RS p M
.
nA
t玩 r d e v el o Pm e n t : b as ie p ir n e i lP e s a n d p r ac t ie al 叩 p il e a t i o n s [ J j . p l a n t
C e l
,
199 3
,
5
:
12 1 7 一 12 29
.
[ 15 〕 H A WLE Y R S , ABR E L T . Y e as t g e n e t i cs a n d th e 伺 1 o f th e e l as s ie al vi e w Of m e i o s is 〔J〕. C e l , 199 3 , 7 2 : 30 1 一 3 03 .
[ 16 〕 S IM CEH N G , H UG E RAT Y . W ll at d e t e mr i n e s w h e th e r C hor m o s om e s , e尹 g at e er d uc t io n al y o r e q t j a t i o n妞 y i n m e i os is
〔J ] . Bi , 5 5哪 , 19 3 , 1 5 : l 一 8 ,
仁1 7 〕 e A即E NT E R ^ T C . C h ias m a fu n e t i o n [ J〕. C e l , 19 4 , 7 7 : 95 9 一 962 .
〔18」MONE S P B . M ol e e ul ar p e即 e e t i v e s of e h or m o s o m e p ia ir n g a t m e io s i s [ J ] . B i优 5 5叮 s , 1 994 , 16 : 10 1 一 106 .
[ 19 〕 K LE CNK ER N . M e io s i s : h o w e o ul d ir wo kr 〔J ] . Por c N a d A e a d cS i U SA , 1 996 , 93 : 8 1 67 一 8 1 74 ,
「2 0 〕 G功 v E R J , e甩 L o N M , e队 l e s , D EN N I S E . C lo n i n g an d e h a acr t e ir az t i o n of MS for m A ar b id o p s i s : a 罗ne c ir t ic al
i n m al e m e i o s is [ J ]
.
lP an t J
,
1 99 8
,
15
:
345
一
35 6
.
F in e m a P P l l g
o f an A
r a b i d o P s i s t h a l i a n a m ia e s t e r i l e g e n e
L IU H u i j u an
,
Z H AN G Z a i
一
b a o
,
G AO J u
一
afn
g
,
Y A NG Zh o n g
一 n a n
( C
o
l
e 罗 of Li fe an d E n vi orn m e n t S e i e n e e s , Sh an hg a i N o二 al U n iv e sr iyt , Sh a n hg ia 2 0 02 34 , C h i n a )
A b st acr
t : A
n
rA ab i d
o p s i s th曲 a n a m al e 一 s t e ir l e m u tan t h a s b e e n i s o la t e d u s in g e n t hyl m e th an e s t il fo n a t e ( EM S ) m u t a罗n e s i s
s tar t e盯 . G e n e t i e an al ys is in id e a t e d th a t i t w a s e o n tor l e d b y a s i n砂e er e e s s iv e g e ne e al e d m s 157 . N o po l e n g r a l n s h a v e b e e n o b -
s e
vr
e d in m ut a n t an ht
e o
.
m s l 5 7 h a s b e e n m a p p e d t o a r e乡o n o f 2 8 5kb b e twe e n th e o ol e e 己ar m akr e o C IW7 an d T 13 K 14 o n
e h
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os o m e IV u s i ng
a m aP
一
b as e d e lo n in g s tr at e gy
.
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s n o m al e s t e ir l e g e n e s hva
e b e e n er p o rt e d in t h i s r e ig
o n , w e b e l ive
e m s l 57
e o ul d b e a n e w m al e s t e ir l e 罗 n e . hT e fu rt h e r m ol e e 以a r e lo n in g an d fo n e it o n al an 习y s i s of th i s ge n e s h o ul d fa e iil tat e o ur u n d e r -
s t an id
n g Of rA ab id叩5 15 th山 an a a n th e r d e v el o p m e n t ·
K e y w o dr
s : Aabr i d
o p s is th ial
a n a ; m al e s t e ir le ; m a p
一
bas e d e l o n in g ; if n e M即 p in g ; a n th e r d e v e l o pm e n t