全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2013年 9月, 35(9): 1106―1116
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告
收稿日期: 20130405; 修回日期: 20130503
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：91017014; 30921003)资助
作者简介: 张海瑞, 硕士, 专业方向：植物分子生物学。E-mail: zhanghairui.111@163.com
徐冉, 博士, 研究方向：遗传学。E-mail: xuran@genetics.ac.cn
张海瑞和徐冉同为第一作者。
通讯作者: 郜刚, 博士, 副教授, 研究方向：分子生物学。E-mail: gaogang20002000@126.com;
李云海, 博士, 研究员, 研究方向：植物分子和发育生物学。E-mail: yhli@genetics.ac.cn
网络出版时间: 2013-5-22 10:11:17
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20130522.1011.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.01106
拟南芥 YUAN1基因调控器官形状和大小
张海瑞 1, 徐冉 2, 高玉梅 2, 金维环 2, 郜刚 1, 李云海 2
1. 山西师范大学生命科学学院, 临汾 041004;
2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京 100101
摘要: 器官形状和大小的控制是一个基本的发育生物学过程, 受细胞分裂和细胞扩展的影响。到目前为止, 人
们对植物器官形状和大小的调控机制知之甚少。本实验室前期研究发现了一个种子和器官大小的调控基因DA1,
其编码一个泛素受体。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, DA1通过抑制细胞的分裂来限制种子和器官的大小。
本研究通过激活标签的方法在 da1-1 突变体背景下筛选到一个叶子形状发生改变的半显性突变体(yuan1-1D)。
yuan1-1D形成短而圆的叶片和短的叶柄, 细胞学分析显示, 叶片和叶柄变短的主要原因是细胞的长向扩展降低
导致的。YUAN1编码一个含有 PHD锌指结构域的蛋白。GFP-YUAN1融合蛋白定位在细胞核内。过量表达 YUAN1
基因导致叶片和叶柄变短。遗传学分析显示, YUAN1 和 DA1、ROT3以及 ROT4 在控制叶片形状和大小方面作
用于不同的遗传途径中。因此, 本研究鉴定了一个新的控制器官形状和大小的基因 YUAN1, 为阐明植物器官形
状和大小调控的分子机制提供了重要线索。
关键词: YUAN1; PHD锌指结构域; 器官形状和大小; 细胞伸长
Control of organ shape and size by YUAN1 in Arabidopsis thaliana
ZHANG Hai-Rui1, XU Ran2, GAO Yu-Mei2, JIN Wei-Huan2, GAO Gang1, LI Yun-Hai2
1. School of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China;
2. State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy
of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: Control of organ shape and size by cell proliferationandcell expansion is a fundamental process in plant de-
velopment. However, little is known about the molecular mechanisms that set the shape and size of determinate organs in
plants. We have previously demonstrated that the Arabidopsis gene DA1 controls the final size of organs by restricting cell
proliferation. Through an activation tagging screen for modifiers of da1-1, we have identified a semi-dominant mutant
(yuan1-1D) with altered leaf shape and size. The yuan1-1D mutation results in reduced plant height, short and round leaves
and short petioles due to defects in cell elongation. YUAN1 encodes a PHD zinc finger domain-containing protein. The
第 9期 张海瑞等: 拟南芥 YUAN1基因调控器官形状和大小 1107
GFP-YUAN1 fusion protein is localized to the nucleus. Overexpression of YUAN1 leads to round leaves and short petioles.
Genetic analyses show that YUAN1 acts independently of DA1, ROTUNDIFOLIA 3 (ROT3) and ROTUNDIFOLIA4 (ROT4)
to influence leaf shape and size. Collectively, our findings show that Arabidopsis YUAN1, a PHD zinc finger do-
main-containing protein, controls organ shape and size by restricting cell elongation, and give insight into how plants con-
trol their organ shape and size.
Keywords: YUAN1; PHD zinc finger domain; organ shape and size; cell elongation
器官大小是重要的产量性状, 对其调控机理的
研究是正在兴起的一个新研究领域。在不同物种间,
器官的大小和形状存在显著差异, 而在同一物种内
器官大小变异相对较小, 表明器官大小受遗传因子
调控。同时, 生物体器官生长也受到外界环境因素
的影响[1, 2]。在动物中, Hippo 通路和 TOR 通路是两
个器官生长调控的重要通路[3~5]; 在植物中, 几个
植物特有的基因被报道参与了器官形状和大小的控
制, 例如 PEAPOD 和 DA1[6, 7]。这些研究表明, 植物
可能存在特有的器官生长控制机制。然而, 植物器
官大小调控的分子机制目前尚不清楚。
器官生长是通过细胞分裂和细胞扩展来实现
的[8]。目前报道的一些通过促进细胞分裂来影响器
官生长的基因有：ARGOS, AINTEGUMENTA (ANT),
GROWTH-REGULATING FACTORS (AtGRFs), GRF-
INTERACTING FACTORS (AtGIFs) 和 KLU/
CYP78A5[9~14]。还有一些是通过抑制细胞分裂来控制
器官生长的。金鱼草(Antirrhinum majus)中的 TCP
蛋 白 CINCINNATA 及 其 在 拟 南 芥 (Arabidopsis
thaliana)中的同源蛋白就是通过抑制细胞的分裂
来实现对器官生长的调控[15, 16], 而 TCP 家族基因的
表达受到 miR319 的调控[16, 17]。PEAPOD1 和 PEAPOD2
基因抑制叶片细胞中拟分生组织细胞的增殖[6]。
PPD1 和 PPD2 功能缺失突变体会产生大的穹型叶片
[6]。拟南芥中 DA1 和 EOD1/BB(ENHANCER OF DA1
1/BIG BROTHER)是两个协同作用的器官大小抑制
基因, 它们通过抑制细胞分裂的持续时间来调节器
官的大小[7, 18]。DA1 编码了一个泛素受体蛋白, 而
EOD1/BB 编码了 E3 泛素连接酶[7, 18], 表明 DA1 和
EOD1可能通过降解细胞分裂的促进因子, 从而调控
器官大小。器官生长也受到细胞扩展的影响。
ARGOS-LIKE 过量表达导致细胞变大, 从而影响器官
大小[19]; BIGPETALp (BPEp)和 Mediator subunit 25
(MED25/EOD8)通过抑制细胞的扩展来抑制花瓣的
生长[20, 21]; 几个 26S 蛋白酶体亚基的基因突变也会
导致细胞变大, 从而形成大的叶片[22, 23]。
在器官发育过程中, 细胞的分裂和扩展具有一
定的方向性, 即极性生长。在长向和宽向上的协调
生长使器官最终形成一定的形状和大小。近年来 ,
几个特异影响器官极性生长的基因被报道。在叶片
的发育过程中, ROTUNDIFOLIA4 (ROT4)抑制细胞
在长向上的分裂[24, 25]。过表达 ROT4导致叶柄和叶片
的变短[24, 25]。细胞色素 P450家族的 ROTUNDIFOLIA3
(ROT3)促进细胞在长向上的扩展, 而 ANGUSTIFOLIA
(AN)促进细胞在宽向上的扩展[26, 27]。rot3 突变体形
成短的叶片, 而 an突变体形成窄的叶片[26, 27]。然而,
到目前为止对器官极性生长的具体机制仍然不清楚。
本实验室前期研究发现了一个种子和器官大小
的调控基因 DA1[7]。da1-1突变体由于细胞的增多而
形成大而圆的叶片[7]。为了进一步鉴定 DA1 途径的
新成员或新的器官大小和形状调控因子, 本研究通
过激活标签的方法在 da1-1 突变体背景下分离其增
强子和抑制子。其中, 一个叶片形状发生改变的半
显性突变体 yuan-1D 由于细胞长向扩展受到抑制而
形成短的叶片和叶柄。YUAN1 编码一个含有 PHD
锌指结构域的蛋白。GFP 融合实验显示 YUAN1 定
位在细胞核内。蛋白序列分析显示 YUAN1同MALE
STERILITY 1 (MS1)和MALE MEIOCYTE DEATH 1
(MMD1)同源性最近, 这 3 个蛋白都具有 PHD 结构
域。MALE STERILITY 1 (MS1)和MALE MEIOCYTE
DEATH 1 (MMD1)被报道参与了育性的控制, 但是
到目前为止它们对器官大小和形状的影响未见报
道[28~30]。遗传学分析表明 YUAN1对器官形状和大小
的调控不依赖于 DA1、ROT3 和 ROT4。总之, 本研
究结果表明 YUAN1 是一个新的植物生长调控因子,
为理解植物器官形状和大小调控的分子机理提供了
重要线索。
1108 HEREDITAS (Beijing) 2013 第 35卷
1 材料和方法
1.1 材料和生长条件
实验所用野生型材料为拟南芥 Columbia
(Col-0), 所有的突变体都是 Col-0 背景。yuan1-ko1
(SALK_079456) 、 yuan1-ko2 (SALK_099086) 和
yuan1-ko3 (SALK_147417)为 T-DNA 插入突变体 ,
均购自拟南芥突变体库 Arabidopsis Stock center
ABRC, 突变体经过 PCR 检测为纯合子后用于实验
(引物序列见表 1)。生长温度为 22℃, 光照周期为 16
h光/8 h暗。
表 1 引物序列
引物名称 序列(5′→3′)
LB GTAATCTTCAATCTCGGCATA
RB ACCCTCTTTAACCGGAACTC
OJF24 TGGCCCTTATGGTTTCTGCA
YUAN-F ATGGCGATAACCGCATACGAC
YUAN-R CTAGCGAATGCTGAGGTTGCGTTTCT
YUAN-PF CCTTTTCCACGGTGCTGAAATCAT
YUAN-PR GACTGAAAAAGGACTACGGGAAAAGAGA
YUAN-RTF AATACTACAACATCGGGCATA
YUAN-RTR TGAACACGGGAATTGATTGTC
ACTIN7-F ATCCTTCCTGATATCGAC
ACTIN7-R GAGAAGATGACTCAGATC
147417-LP TTCATGATTGGGAAGAACCTG
147417-RP ATGGTGTTGCATATGGTCGAC
079456-LP CAATGTCACGTGGTCACAAAC
079456-RP AGTCCATGATTTGGTCACCAG
099086-LP TACGGACTCAGTCCAGGAGTG
099086-RP GAGGAGAGATTGTGACATTCATG
LBa1 TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
1.2 方法
1.2.1 利用激活标签筛选突变体
利用激活标签技术在 da1-1 背景下构建拟南芥
突变体库 [31]。将增强子序列构建到激活标签载体
PJFAT260 上, 然后转化到农杆菌 GV3101 中[32], 得
到的菌株用花絮侵染法转化 da1-1 突变体的花絮。
T1 代种子在含有除草剂的抗性培养基上筛选, 得到
的阳性植株进行叶片形状观察。
1.2.2 形态和细胞分析
把花瓣(第 14 期)和叶片铺在固体培养基上, 在
体视镜下拍照并用 Image J 软件测量长度、宽度和
面积, 其中叶片数目大于 20 个, 花瓣数目大于 40
个。然后把组织材料在透明液 (8 g 的水合氯醛
(Chloral hydrate), 11 mL的水以及 1 mL甘油)中透明。
透明过的材料在相差显微镜(Differential interference
contrast optics, DIC)(LEICA DM2500)下用 CCD数码
成像系统拍照 , 后续处理使用 Powerpoint 或者
Photoshop软件, 细胞面积的测量使用 Image J软件。
选取叶片的栅栏组织细胞和花瓣最宽处的上表皮细
胞进行测量, 至少统计 200个细胞的长和宽。
1.2.3 YUAN1基因的克隆
运用 TAIL-PCR分离 T-DNA插入位点旁边的序
列[33]。利用 3个包含 pJFAT260载体的 T-DNA插入
位点的特定的引物(OJF22、OJF23 和 OJF24)和一个
短的兼并引物(AD1)进行 TAIL-PCR。产物用 OJF24
引物测序。引物序列见表 1。
1.2.4 载体构建和转化
从 Col-0花絮中, 通过 PCR扩增得到 YUAN1基
因的 cDNA, 引物为 YUAN1-F和 YUAN1-R(引物序
列见表 1)。PCR产物连接 TOPO 载体(Invitrogen)后
测序 , 测序正确后 , 亚克隆到含有 35S 启动子的
pMDC32 上和含有 35S 启动子和 GFP 基因的
pMDC43上, 得到 35S::YUAN1和 35S::GFP-YUAN1。
从 Col-0的 DNA中 PCR扩增得到 YUAN1基因的启
动子序列, 引物为YUAN1-PF和YUAN1-PR(引物序
列见表 1)。PCR产物连接 TOPO 载体(Invitrogen)后
测序 , 测序正确后 , 亚克隆到含有 GUS 基因的
pMDC164 载体上, 得到 pYUAN1::GUS。进一步将
pYUAN1::GUS 质粒通过花絮侵染法, 转化到 Col-0
中, 在含有潮霉素抗性的培养基上筛选转化植株。
1.2.5 荧光显微镜观察
将 35S::GFP-YUAN1转基因植株的叶片在DAPI
(1 μg/mL)溶液中染色, 室温孵育 1 h, 然后使用双光
子荧光共聚焦显微镜(ZEISS)观察 GFP和 DAPI信号。
1.2.6 RT-PCR分析
拟南芥总 RNA用 RNA提取试剂盒(TIANGEN)
第 9期 张海瑞等: 拟南芥 YUAN1基因调控器官形状和大小 1109
提取。RNA 用反转录试剂盒(INVITROGEN)进行反
转录得到 cDNA, 以 ACTIN7 为内参基因 , 进行
RT-PCR分析。RT-PCR引物见表 1。
2 结果与分析
2.1 yuan1-1D da1-1的分离和鉴定
与野生型相比, da1-1 突变体具有大而圆的叶
子[7]。DA1编码一个预测的泛素受体蛋白, 主要通过抑
制细胞分裂来控制器官的生长[7]。为了鉴定 DA1 途
径中的其他成员或者其他控制器官形状和大小的因
子, 本研究用 T-DNA 激活标签的方法分离了 da1-1
的增强子和抑制子。在该筛选中, 鉴定出一个半显
性突变体 yuan1-1D da1-1。与 da1-1相比, yuan1-1D
da1-1 形成短的叶片和叶柄(图 1), 长宽比明显减小
(图 1D)。
图 1 yuan1-1D da1-1突变体的分离和鉴定
A~C：Col-0、da1-1和 yuan1-1D da1-1生长 21 d的植株(标尺：1
cm); D：Col-0、da1-1 和 yuan1-1D da1-1 第 5 片叶子的长宽比
(LL/LW)和叶柄长度(PL)。**代表 da1-1和 yuan1-1D da1-1之间
t检验, P≤0.001。
2.2 yuan1-1D突变体形成短的器官
为了研究 yuan1-1D 单突变体的表型 , 将
yuan1-1D da1-1双突变体同野生型(Col-0)进行杂交,
从 F2代中分离并得到了 yuan1-1D 单突变体。同野
生型(Col-0)相比, yuan1-1D 单突变体的叶片和叶
柄变短(图 2：A~D, F, G, I), 叶片的长宽比变小(图
2H), 花器官也略微变短(图 2L)。另外, yuan1-1D
的株高与野生型相比也显著降低(图 2：E 和 J)。
yuan1-1D+/-杂合植株的表型介于 yuan-1D 纯合植
株和野生型(Col-0)之间(图 2：A~C, K), 表明
yuan1-1D 突变体是一个半显性突变体, 提示 YUAN1
调控器官的形状和大小具有一定的剂量效应。
2.3 yuan1-1D 突变抑制细胞伸长
由于器官形状和大小是由细胞分裂和细胞扩展
共同决定, 因此, 本研究对 yuan-1D 突变体进行了
细胞学分析。鉴于 yuan1-1D 突变体在叶柄和叶片上
的表型变化, 首先测量了叶柄背面的细胞。如图所
示(图 3：A~C), yuan1-1D 叶柄的背面表皮细胞比野
生型明显变短, 说明 yuan1-1D 突变抑制细胞的伸
长。另外, yuan1-1D 叶片的栅栏细胞也显著变短,
而宽度没有明显改变, 从而导致细胞长宽比的减小
(图 3D)。因此, yuan1-1D 形成短的器官是由于细胞
的长向扩展受到抑制导致的。
2.4 YUAN1 编码一个含有 PHD 锌指结构域的蛋白
为了鉴定YUAN1基因, 本研究利用TAIL-PCR来
鉴定激活标签的插入位置 [33] 。结果显示 , 在
At2g01810 基因起始密码子上游 62 bp 处有一个
T-DNA 插入(图 4：A, B)。遗传连锁分析显示, T2代
植株中有 T-DNA插入的 49株都具有叶片和叶柄变短
的表型, 而没 T-DNA 插入的 14 株都具有正常表型,
表明 T-DNA 插入与 yuan1-1D 的表型共分离。为了确
定是哪个基因造成了 yuan1-1D 的表型, 利用
RT-PCR 技术检测了 T-DNA 插入位点附近的两个基因
(At2g01810 和 At2g01800)的表达水平。结果显示,
在 da1-1 和 yuan1-D da1-1 植株中, At2g01800 的
mRNA 表达水平没有明显变化, 而 yuan1-D da1-1 中
At2g01810 基因的 mRNA 的表达水平较 da1-1 显著
升高(图 4C), 说明 At2g01810 基因是造成 yuan-1D
表型的候选基因。进而通过转基因在野生型植株中
过表达了 At2g01810 基因, 筛选出 50 株转基因苗,
大部分转基因植株都表现出与 yuan1-1D 突变体相
同的表型(图 4：F~H, M), 叶片和叶柄显著变短, 说
明 At2g01810基因就是 YUAN1基因。YUAN1基因编
码一个含有 697 个氨基酸的蛋白质, 其中包含一个
PHD锌指结构域(图 4D)。
1110 HEREDITAS (Beijing) 2013 第 35卷
图 2 yuan1-1D突变体形成短的器官
A~C：Col-0、yuan1-1D/+ (杂合) 和 yuan1-1D (纯合) 生长 21 d的植株; D：Col-0和 yuan1-1D生长 35 d的莲座叶和茎生叶(按顺序排
列); E：Col-0和 yuan1-1D生长 50 d的植株; F~I:Col-0和 yuan1-1D的叶长(LL)、叶宽(LW)、叶长宽比(LL/LW)和叶柄长(PL); J：Col-0
和 yuan1-1D生长 50 d的株高; K：Col-0, yuan1-1D/+ (杂合) 和 yuan1-1D (纯合)的第 5片叶长宽比(LL/LW)和叶柄长(PL); L：Col-0
和 yuan1-1D的花瓣长、花瓣宽和花瓣长宽比。标尺：A~D=1 cm; E=10 cm。**代表同野生型相比 t检验, P≤0.001。
第 9期 张海瑞等: 拟南芥 YUAN1基因调控器官形状和大小 1111
图 3 yuan1-1D突变体限制了细胞扩展
A、B：Col-0 和 yuan1-1D 叶柄背面表皮细胞, 红色线条表示细
胞轮廓, 标尺：1mm; C：Col-0 和 yuan1-1D 叶柄背面表皮细胞
的长度; D：Col-0和 yuan1-1D第 5片叶子中间区域栅栏细胞的
长(CL)、宽(CW)以及长宽比(CL/CW)。**代表同野生型相比 t
检验, P≤0.001。
2.5 在控制器官形状和大小方面 YUAN1 可能与其
相似蛋白功能冗余
为了进一步研究 YUAN1 的功能, 本文分离了
YUAN1 基因的 3 个 T-DNA 插入突变体。yuan1-ko1
(SALK_079456)、yuan1-ko2 (SALK_009086) 和 yuan1-
ko3 (SALK_147417)的 T-DNA 插入位置分别在
YUAN1基因的第 1个外显子和第 3个外显子(图 4A)。
表型分析显示, yuan1-ko 突变体的器官形状和大小
与野生型没有明显区别(图 4：I~K), 说明在器官形
状和大小控制方面 YUAN1 基因可能与其相似蛋白
功能冗余。
在拟南芥中有 8 个蛋白与 YUAN1 的氨基酸组
成相似, 其中 MS1、MMD1 和 SWI1这 3个蛋白已
经被报道过(图 4E)[28~30, 41]。进化分析显示 YUAN1、
MS1 和 MMD1 可归为一个亚族(图 4E)。MMD1 和
MS1 分别与减数分裂和花粉发育有关, 突变后会造
成雄性不育[28, 30]。然而 yuan1-ko突变体却有正常的
育性(图 4L), 提示 YUAN1、MS1和 MMD1可能在育
性调节方面有不同的功能。另外, ms1和 mmd1突变
体至今没有报道影响器官的形状和大小[28~30]。因此,
将来得到 YUAN1、MS1和 MMD1的双突变体或者三
突变体, 并调查它们的叶片形状和大小将有助于揭
示这 3个基因在器官形状和大小方面的功能。
2.6 YUAN1的亚细胞定位和表达模式
考虑到 PHD 锌指结构域在转录调节和染色质
结构方面的功能, 本文推测 YUAN1 蛋白可能定位
在细胞核内[34, 35]。为了研究 YUAN1的亚细胞定位,
构建了 35S启动子驱动的 GFP和 YUAN1的融合蛋
白, 并转化野生型拟南芥。结果显示过量表达植株
都出现了短而圆的叶子和短的叶柄(图 5A), 说明
GFP 和 YUAN1 的融合蛋白是有功能的。激光共聚
焦显微镜观察显示 GFP-YUAN1 融合蛋白的信号在
细胞核中(图 5：B~E)。这些结果显示, 同已经报道
的包含 PHD锌指结构域的蛋白的功能一样, YUAN1
蛋白在细胞核中可能通过参与转录调控和染色质结构
来调节下游基因, 从而调节器官的性状和大小[34, 35]。
为了研究 YUAN1 基因的表达模式, 将 YUAN1
基因的启动子和 GUS 进行了融合(pYUAN1::GUS),
并转化拟南芥, 得到转基因植株后, 对其 GUS 活性
进行染色分析。结果显示, 子叶和真叶中都能够检
测到 GUS 活性(图 5F), 这与 YUAN1 影响叶子形状
和大小的功能一致。
2.7 YUAN1 调节器官形状和大小不依赖于 DA1、
ROT3和 ROT4
因为 yuan1-1D突变体是在 da1-1背景下分离出
来的, 本研究首先调查了 YUAN1和 DA1遗传关系。
通过比较野生型(Col-0)、yuan1-1D单突变体、da1-1
和 yuan1-1Dda1-1 双突变体的叶长、叶长宽比和叶
柄长度, 发现 yuan1-1D 和 da1-1 之间的遗传关系是
加性的(图 6A)。说明 YUAN1 基因和 DA1 基因在不
同的遗传途径中发挥作用, 这与 YUAN1限制细胞伸
长而 DA1限制细胞分裂是一致的[7]。
rot3-1突变体在叶子和叶柄方面具有和 yuan1-1D
1112 HEREDITAS (Beijing) 2013 第 35卷
图 4 YUAN1编码一个含有 PHD锌指结构域的蛋白
A：YUAN1基因的结构。灰色方框表示外显子, 白色方框表示 UTR, 黑色线条表示内含子; 4个黑色三角表示转录激活元件; 竖箭头表
示 T-DNA插入位点; B：yuan1-1D da1-1的 T-DNA鉴定。RB和 LB是插入位点上游和下游的引物; OJF24是 T-DNA特异引物; C：在
da1-1和 yuan1-1D da1-1中 At2g01810(YUAN1)的表达水平; D：预测 YUAN1蛋白含有一个 PHD锌指结构域; E：拟南芥中 YUAN1蛋
白家族的进化树; F~K：21 d 的 Col-0、OE#1、OE#3、yuan1-ko1、yuan1-ko2 和 yuan1-ko3 植株, OE 代表在 Col-0 背景下过表达
YUAN1(35S::YUAN1); L：Col-0、yuan1-ko1、yuan1-ko2和 yuan1-ko3的角果; M：Col-0、OE#1和 OE#3的叶片长宽比和叶柄长。标尺：
F~K=1 cm; L=1 mm。**代表同野生型相比 t检验, P≤0.001。
相似的表型[26, 42]。ROT3基因编码细胞色素 P450家族
中的 CYCP90C1, 参与油菜素内酯的合成, 通过促进
了长向的细胞扩展来调节器官的形状和大小[26, 42, 43]。
为了分析 ROT3和 YUAN1的遗传关系, 构建了双突
变体 rot3-1 yuan1-1D, 并测量了叶长、叶长宽比及
叶柄长。结果显示同单突变 rot3-1和 yuan-1D相比,
双突变体 rot3-1 yuan1-1D显示出加性的关系(图 6B),
暗示 ROT3和 YUAN1在遗传关系上是相互独立的。
ROT4 主要是通过抑制细胞的长向分裂来调节
器官的形状和大小[24, 25]。与 yuan-1D类似, rot4-1D
也形成短的叶片和叶柄。遗传分析显示 rot4-1D
yuan1-1D双突变体同单突变体叶片和叶柄的长度更
短 , 长宽比也比两个单突变体更小(图 6C)。提示
ROT4 和 YUAN1 作用在不同的遗传途径调控器官的
形状和大小。
3 讨 论
植物器官形状和大小是重要的产量性状, 然而
其调控的分子机理目前并不十分清楚。本研究发现
了 YUAN1是一个新的器官形状和大小的调节因子。
yuan1-1D 突变体和过量表达 YUAN1 的转基因植株
表现出短而圆的叶子和短的叶柄(图 2：A~C和图 4：
F~H), 表明 YUAN1抑制了器官生长。细胞分裂和细
胞扩展共同决定器官的形状和大小; 破坏细胞分裂
第 9期 张海瑞等: 拟南芥 YUAN1基因调控器官形状和大小 1113
图 5 YUAN1定位在细胞核中
A：21 d 的 Col-0 和 35S::GFP-YUAN1 植株; B~E：分别为 GFP
荧光、明场、DAPI 荧光及三者的融合; F：pYUAN1::GUS 转基
因植株萌发后 9 d幼苗的 GUS染色。标尺：A=1 cm; B~E=10 μm。
或扩展过程将影响器官的生长和发育。细胞学分析
表明 YUAN1 是通过抑制细胞扩展(图 3), 从而调控
器官形状和大小。在器官形成和发育过程中, 细胞
的分裂和扩展具有一定的方向性。细胞分裂和扩展
的方向决定了器官的形状。细胞学观察显示 YUAN1
主要是限制长向细胞扩展, 从而影响器官长向生长
(图 3)。在拟南芥中, 几个影响器官生长方向的基因
已被报道。ROT4 抑制长向细胞分裂, 获得功能的
rot4-1D突变体和过表达 ROT4转基因植株形成短的
叶柄和叶片[24, 25]。ROT3促进长向细胞扩展, 缺失功
能的 rot3 突变体形成短的器官[26]。尽管 yuan1-1D
突变体与 rot3-1和 rot4-1D突变体有相似的短器官表
型, 但遗传分析表明 YUAN1 与 ROT3 和 ROT4 作用
在不同的遗传途径中(图 6：B, C)。另外, yuan1-1D
da1-1双突变体分析显示, YUAN1和DA1也分别作用
在独立的遗传途(图 6A)。因此, 这些研究结果表明
YUAN1 可能作用在一个新的遗传途径, 调控器官的
长向生长。
利用 TAIL-PCR方法[33], 分离了 yuan1-1D突变
体激活标签 T-DNA插入的旁侧序列。通过测序和表
达分析表明, T-DNA 插入在 At2g01810 基因起始密
码子上游 62 bp处, 导致 At2g01810基因的过量表达
(图 4：A~C)。过量表达 At2g01810基因导致 yuan1-1D
相似的表型(图 4：F~H), 表明 At2g01810是 YUAN1
基因。然而, 缺失功能的 yuan1-ko 突变体的器官形
状和大小与野生型相似, 表明 YUAN1基因可能与其
相似的基因冗余地调控器官形状和大小。在拟南芥
中有 8 个基因与 YUAN1 基因相似, 其中 MS1 和
MMD1 与 YUAN1 归类于同一亚族(图 4E)。MMD1
和 MS1 已报道参与调控花粉发育和育性[28, 30], 而
yuan1-ko突变育性正常(图 4L), 说明 YUAN1与 MS1
和 MMD1在育性调节方面可能功能不同。尽管目前
还没有报道 MS1和MMD1影响器官形状和大小[28, 30],
由于 YUAN1、MS1 和 MMD1 序列具有相似性, 说
明它们仍然可能冗余地调控器官形状和大小。
YUAN1基因编码一个含有 697个氨基酸的蛋白
质, 其中包含一个 PHD锌指结构域(图 4D)。PHD锌
指结构域由一个保守的 Cys4-His-Cys3 锌指结构域
组成, 通常同转录调控或者染色质重塑相关, 可能
在介导蛋白与蛋白、蛋白和 DNA及蛋白和 RNA的
相互作用中起作用[34, 35]。近来的研究表明 PHD锌指
结构域特异地结合在三甲基化的组蛋白 H3 的第 4
个赖氨酸上 , 促进下游基因的转录 [ 3 6 ~ 4 0 ]。GFP-
YUAN1 融合蛋白定位在细胞核中(图 5：A~E), 与
1114 HEREDITAS (Beijing) 2013 第 35卷
PHD锌指结构域在染色质重塑和转录调控等方面的
图 6 YUAN1同 DA1, ROT3及 ROT4遗传关系
A：Col-0、yuan1-1D、da1-1和 yuan1-1D da1-1第 5片叶的长(LL)、长宽比(LL/LW)及叶柄长(PL); B：Col-0、yuan1-1D、rot3-1和 rot3-1
yuan1-1D第 5片叶的长(LL)、长宽比(LL/LW)及叶柄长(PL); C：Col-0、yuan1-1D、rot4-1D和 rot4-1D yuan1-1D第 5片叶的长(LL)、
长宽比(LL/LW)和叶柄长(PL)。**代表 yuan-1D同 Col-0相比, 双突变体与 da1-1、rot3-1、rot4-1D相比, t检验的 P值≤0.001。
功能相吻合。因此, YUAN1蛋白可能结合在组蛋白
H3上, 然后促进转录因子和核小体相关的蛋白复合
物结合到染色质上, 从而促进相关基因的表达, 进
而调控器官的形状和大小。
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综合信息
2013 年 35 卷第 9 期《遗传》封面说明
器官形状和大小的控制是一个基本的发育生物学过程, 受细胞分裂和细胞扩展的影响。到目前为止, 对器官形状和
大小调控机制的了解还很少。本研究通过激活标签的方法筛选到一个叶子形状发生改变的半显性突变体(yuan1-1D)。
yuan1-1D 形成短的叶片和叶柄。细胞学分析显示, 叶片和叶柄变短的主要原因是细胞的长向扩展改变导致的。YUAN1
编码一个含有 PHD锌指结构域的蛋白。GFP-YUAN1融合蛋白定位在细胞核内。过表达 YUAN1导致叶片和叶柄变短。
遗传学分析显示, YUAN1和 DA1、ROT3以及 ROT4在控制叶片形状方面作用于不同的遗传途径中。因此, 本研究鉴定
了一个新的控制器器官形状和大小的基因 YUAN1, 揭示了含有 PHD锌指结构的蛋白在器官大小调控中的作用, 为阐明
植物器官形状和大小调控的机制提供了重要线索。详见本期第 1106~1116 页张海瑞, 徐冉, 高玉梅, 金维环, 郜刚, 李
云海的文章“拟南芥 YUAN1 基因调控器官形状和大小”一文。封面图片展示的是萌发后 21 天野生型(左)和 yuan1-1D
突变体(右)的植株和叶柄细胞。同野生型相比, yuan1-1D由于细胞变短而形成短的叶片和叶柄。
(张海瑞, 徐冉, 高玉梅, 金维环, 郜刚, 李云海)
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