全 文 ：中国农学通报 2012,28(27):183-188
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
芥子酶(myrosinase，EC3.2.3.1)又称β-硫苷酶、β-硫
代葡萄糖苷水解酶。芥子酶广泛存在于十字花科植物
中，它能催化硫代葡萄糖苷水解成为D-葡萄糖、硫酸
基金项目：国家自然科学基金资助项目“拟南芥芥子酶‘假基因’TGG6活性等位基因的功能研究”(31070271)。
第一作者简介：吴丽娟，女，1987年出生，福建福州人，硕士，研究方向为分子遗传。通信地址：571101海南省海口市龙华区学院路4号热带生物技术
研究所B401，Tel：0898-66984866，E-mail：rita.wlj@163.com。
通讯作者：张家明，男，1966年出生，湖北公安人，研究员，博士生导师，研究方向为植物代谢和生物质能源。Tel：0898-66986190，E-mail：
zhangjiaming@itbb.org.cn。
收稿日期：2011-12-28，修回日期：2012-02-22。
拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其
与重组蛋白酶学活性比较研究
吴丽娟 1,2，马 帅 1，付莉莉 1，孙雪飘 1，张家明 1
（1中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101；
2海南大学农学院，海口 571101）
摘 要：芥子酶是一类降解硫代葡萄糖苷的酶，该基因表达具有组织特异性。研究表明，新型芥子酶
TGG4和TGG5都是在根部表达。为了研究TGG4、TGG5的功能作用，提取了生态型拟南芥Col-0根部
以及含有重组蛋白酵母的芥子酶，进行了酶活性条件测定以及对比分析。结果表明：根部芥子酶有更高
的抗坏血酸激活浓度为2 mmol/L；根部芥子酶同重组蛋白的最佳反应温度以及pH范围一致，在37℃，
体系缓冲液pH 4.5时，根部芥子酶活性测定效果最好；NaCl对根部芥子酶和重组蛋白芥子酶都有强烈
抑制作用。因此推断根部芥子酶在耐盐碱、耐高温方面没有起作用，该酶也不能帮助根部抵御病虫侵
袭，但是对根部的生长起到重要作用。
关键词：拟南芥；芥子酶；活性比较
中图分类号：Q91 文献标志码：A 论文编号：2011-3917
Determination of Myrosinase Assay Conditions in Arabidopsis thaliana Root and
Its Comparition with Recombinant Protein Activities
Wu Lijuan1,2, Ma Shuai1, Fu Lili1, Sun Xuepiao1, Zhang Jiaming1
(1Institute of Tropical Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic
Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou 571101;
2College of Agriculture, Hainan University, Haikou 571101)
Abstract: Glucosinolate-myrosinase is a kind of enzymes that degrade glycosidase, the express of this gene is
tissue-specific. Research showed that, the new myrosinase TGG4 and TGG5 are found in Arabidopsis thaliana
root. In order to find the function of TGG4 and TGG5, we extracted the myrosinase from ecological Col-0 root
and the yeast contained recombinant protein, determined the enzyme activity condition and analyzed the
different. It suggested that, the root myrosinase need higher ascorbic acid active concentration, it was about
2 mmol/L, the best reaction temperature and pH range were the same, for root myrosinase, the temperature was
37℃, and the pH was 4.5, for all myrosinase the NaCl had a strong inhibition of effect. The author believed
that, root myrosinase did not work in salinity and themostability, and the enzyme also could not help root
against disease and insect attack, but it might be play an important role in root growth.
Key words: Arabidopsis thaliana; myrosinase; activity comparison
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盐以及一系列不稳定的中间产物[1]，这些中间产物能
根据不同的环境状况形成一系列有毒物质，如异硫氰
酸，该化合物对食草动物表现出较高的毒性。因此，人
们称这一重要的化学防御系统为“芥子油弹”(mustard
oil bomb)[2]。到目前为止，在拟南芥中已发现了6个芥
子酶基因，分别是TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5
和 TGG6[1-6]。研究发现 TGG1、TGG2在拟南芥子叶、
茎、叶片、花和果荚中表达，而且这 2个基因的功能相
同，都能帮助叶片抵抗真菌、食草动物以及昆虫的侵
害，TGG3和TGG6是在花中表达的假基因，而TGG4、
TGG5则是在拟南芥根部特异表达，但这2个基因的功
能作用尚不明确[1,4]。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广
泛的表达系统之一，它兼有原核表达系统和真核表达
系统的优点[7]：易操作培养、生长迅速、表达量高，还能
对外源真核基因进行正确翻译以及翻译后加工、修饰，
并且能够对许多蛋白质产物进行分泌表达。伍祚
斌[1]、辛曙丽[4]等已经成功地利用毕赤酵母系统表达了
TGG4、TGG5重组蛋白，并且进行了相应的酶学活性
特性研究，但不知重组蛋白与天然芥子酶是否存在差
异。为了探明拟南芥根部芥子酶在根部的功能活性，
有必要对根部提取芥子酶测定条件进行研究，进而为
进一步揭示芥子酶防御体系的功能做铺垫。为此，笔
者为了探明根部提取芥子酶活性测定的最佳条件，并
且对比了根部芥子酶和酵母重组蛋白的酶学特性，了
解二者之间的差异，初步探讨了根部芥子酶的功能作
用。
1 材料与方法
1.1 材料
拟 南 芥 的 生 态 型 Col-0，来 自 Nottingham
Arabidopsis Stock Centre (NASC)。种子经过酒精和次
氯酸钠消毒后播种于MS培养基 [7]中，放置培养室培
养，培养室温度是 20℃，空气相对湿度为 60%，光照时
间为 16 h/d，光照强度是 200 μmol/(m2·s)。含有
TGG4、TGG5重组蛋白的毕赤酵母由农业部热带作物
生物学与遗传资源利用重点实验室保存，于BMMY培
养基中诱导表达，培养温度28℃，转速200 r/min。
1.2 实验方法
1.2.1 拟南芥根部芥子酶粗酶液的制备 取培养 14天
的拟南芥根100 g，加入预冷(4℃)的芥子酶提取缓冲液
（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mmol/L EDTA，
1 mmol/L NaCl），研磨后混匀，置冰上浸提 30 min。
4℃，12000 r/min离心 10 min，上清经过G-250葡聚糖
凝胶层析去除内源糖苷后即为提取的拟南芥根部芥子
酶酶液，立即使用或于4℃保存备用。
1.2.2 重组蛋白酶液的制备 重组酵母经甲醇诱导4天
后，用玻璃珠法破碎细胞，离心收集上清，即为TGG4、
TGG5酵母表达后的粗提液。蛋白粗提液经 0.22 μm
过滤膜过滤，收集滤液，用Ni亲和层析柱过柱纯化，进
行下一步酶活性研究。
1.2.3 酶活性测定方法 芥子酶活性定义为：以Sinigrin
为底物，在一定分析条件下，每分钟生成 1 μmol葡萄
糖所需的酶量。反应体系为10 μL的Na-citrate缓冲液
(pH 5.5)，2 μL酶液，10 mmol/L的 Sinigrin，2 μL Vc
(0.3 mmol/L)，补充双蒸水至体积为 20 μL，混匀后于
37℃恒温条件下反应，然后 95℃加热 5 min以终止反
应 [8]。向每个反应管中加入 400 μL的葡萄糖检测试
剂，于 37℃下反应 10 min，测定每个反应管在 505 nm
下的吸光值，采用BioTek公司的Epoch酶标仪进行测
定。同时用一系列不同浓度的葡萄糖标准品做一标准
曲线，以用于酶活性的计算。每个反应做3次重复，取
平均值。葡萄糖浓度的测定采用上海荣盛公司的葡萄
糖检测试剂盒。蛋白质标准曲线以及蛋白质浓度的测
定采用TIANGEN的Bradford蛋白质定量试剂盒。
1.2.4 抗坏血酸Vc浓度对酶活性的影响 按上述测定
方法，设置反应体系中Vc浓度为：0、0.3、0.6、1、2、3、4、
6 mmol/L，同时保持体系酶液、Na-citrate缓冲液和
Sinigrin的量不变，研究Vc对酶活性的影响，并确定酶
最适反应Vc浓度。
1.2.5 温度对酶活性的影响 将酶液、缓冲液、底物混
合后，在最适反应Vc浓度的条件下，分别在 17、27、
37、47、57、67、77℃下反应，观察并确定最适的反应温
度。
1.2.6 pH对酶活性的影响 在最适Vc浓度和最适温度
的条件下，将反应体系置于 pH分别为 2.5、3.5、4.5、
5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的Na-citrate缓冲液中进行反应，
按上述方法进行测定并且确定酶最适的反应pH。
1.2.7 底物浓度以及米氏方程 在上述测得的最适反应
条件下，置反应体系分别于底物Sinigrin的浓度分别为
1、2.5、5、10、15、20 mmol/L反应，分别以1/[v]和1/[s]为
纵坐标、横坐标作图。
1.2.8 NaCl浓度对酶活性的影响 在反应体系中分别
加入400、200、100、80、60、0 mmol/L的NaCl，并且在上
述测得的反应最佳条件下进行反应，以观察NaCl对反
应的影响。
1.3 数据分析
根据上述不同条件下测得数据，进行Excel作图
以及相关分析。
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吴丽娟等：拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其与重组蛋白酶学活性比较研究
2 结果与分析
2.1 蛋白质以及葡萄糖标准曲线
结果如图 1、图 2所示，以标准牛血清蛋白及其在
595 nm处的吸光度作图，可得出标准曲线：y=0.108x
+720，R2=0.990。以标准葡萄糖及其在 505 nm处的吸
光度作图，得出的标准曲线为：y=0.014x + 0.063，
R2=0.997。2个方程的R值均在 0.99以上，表示 2个方
程均为有效方程。结合这 2个方程就可以计算相应
的蛋白量以及葡萄糖量，进而可以计算出芥子酶的活
性。
2.2 抗坏血酸Vc浓度对根部芥子酶活性的影响
抗坏血酸对根部提取芥子酶活性有着显著的影
响。当抗坏血酸的浓度为0 mmol/L时，芥子酶反应速
率较低；当Vc范围在 0.6~2 mmol/L时，拟南芥根部芥
子酶活性维持在较高的水平，当Vc浓度为 2 mmol/L
时，激活作用最强，根部芥子酶活性最高（图 3）；重组
蛋白TGG4的Vc激活范围为 0.6~3 mmol/L，当浓度为
1 mmol/L时Vc激活作用最强；重组蛋白TGG5的Vc
激活范围是 1~2 mmol/L，当Vc浓度为 1 mmol/L时酶
活性最高；随着Vc浓度的继续升高，重组蛋白和根部
芥子酶的活性也逐渐降低。因此可以推测，若继续增
加Vc浓度就能够完全抑制芥子酶的活性。
2.3 温度对根部芥子酶活性的影响
由图4可以看出，反应温度低于37℃时，各体系反
应速率极低。当温度范围在 37~47℃时，根部芥子酶
活性到最大，说明该范围是反应最适温度范围；其中在
37℃时酶活性最高，因此选用该温度为根部芥子酶反
应测定温度；当反应温度高于 47℃后，酶活性平缓降
低。重组蛋白TGG4和TGG5的酶活性都随着温度的
升高而增强，并分别在 67℃和 57℃时达到最大；而后
TGG4在 77℃时突然降到了 18.7%，TGG5在 67℃时活
性降到了32.2%。
2.4 pH对根部芥子酶活性的影响
在上述测得的反应最佳条件下，将反应体系置于
不同 pH的条件下反应并作图（图 5）。发现拟南芥根
部提取的芥子酶在pH 4.5~6.5之间，反应活性最高，而
y = 0.1083x + 0.7207R2 = 0.9906
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 2 4 6
牛血清蛋白含量/mg
A 595
图1 蛋白标准曲线
y = 0.0141x + 0.0633R2 = 0.9973
0.000.02
0.040.06
0.080.10
0.120.14
0.16
0 2 4 6
葡萄糖含量/
g
A 505
图2 葡萄糖标准曲线
图3 Vc对根部芥子酶活性的影响
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
17 27 37 47 57 67 77
温度/℃
相
对
酶
活
性
/%
根部芥子酶TGG4TGG5
图4 温度对根部芥子酶活性的影响
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.6 1 2 3 4 6Vc含量/(mmol/L)
相
对
酶
活
性
/%
根部芥子酶 TGG4 TGG5
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
后随着pH的升高酶的反应活性也逐渐下降；图5中可
以看出芥子酶在强酸（pH 3.5时）条件下反应活性极
低，仅为最高活性的 9.8%；当 pH 10时，根部芥子酶的
活性不到最高活性的 50%。同根部提取芥子酶一样，
重组蛋白在酸性条件下酶活性极低，TGG5在 pH 2.5
时，基本检测不到活性；但重组蛋白在碱性条件下的活
性明显都比根部提取芥子酶的活性要高，当 pH 10时
TGG4仍有82.6%的活性，而TGG5也有60.8%的活性。
2.5 底物浓度以及Linewear-Burk图
依据以上测定所得最佳条件：Vc为 2 mmol/L，
温度为 37℃，体系 pH 4.5时，将拟南芥根部提取酶液
与不同浓度的底物 Sinigrin进行反应，用葡萄糖检测
试剂盒测其活性。以浓度的倒数(1/[s])为横坐标，以
反应速度的倒数(1/[v])为纵坐标作 Linewear-Burk图
（ 图 6）。 根 据 该 图 求 出 Km=440.57 μmol/L，
Vmax=60.35 μmol/(min·mg)。
2.6 NaCl含量对根部芥子酶活性的影响
从图 7中可以看出，NaCl对拟南芥根部芥子酶有
明显的抑制作用：当NaCl浓度小于 80 mmol/L时，芥
子酶活性急剧下降，仅为最高活性的 21%；当NaCl浓
度为 200 mmol/L时，残余酶活性仅为最高活性的
14%；当NaCl的浓度大于 200 mmol/L，残余酶活性基
本维持在同一个水平。与此同时，发现NaCl对重组蛋
白也有抑制作用，但是不如对根部芥子酶的抑制作用
明显，当NaCl的浓度为400 mmol/L时，TGG4和TGG5
的活性分别是最大的37.3%和43.4%。
3 讨论
芥子酶反应的一个特点就是需要抗坏血酸的激
活，而且不同来源的芥子酶达到最大酶活性时所需要
的抗坏血酸的量不同[9]。有研究表明，低浓度Vc能促
进芥子酶活性，而在较高浓度下，Vc则会抑制芥子酶
的活性，而没有 Vc的情况下芥子酶又基本无活
性 [10-11]。同本试验一样的是 Anderson等 [12]也发现
TGG4、TGG5酶活性最高的抗坏血酸浓度范围是0.7~
1.5 mmol/L，与其他芥子酶不同的是 TGG4、TGG5在
没有抗坏血酸的激发下也具有活性。笔者在研究中发
现，抗坏血酸对根部芥子酶的最适激发浓度2 mmol/L
比重组蛋白的高，但激发浓度范围一致。由于抗坏血
酸对芥子酶反应的影响极大，可以通过了解植物组织
产生内源抗坏血酸的量来了解植物在何种情况下激发
芥子酶的活性的。Lorence等[13]的研究发现拟南芥根
部抗坏血酸的含量不到叶片中的1/7，因此自然界中拟
南芥根部芥子酶的活性极低，所以笔者推测根部芥子
酶的作用可能不像叶片中的芥子酶那样抗病虫害能力
那么明显。但是在Vc不存在的情况下，根部芥子酶仍
有不可忽视的催化效率，表明该酶在根部正常的生长
的生理过程中有重要作用。
有研究表明，拟南芥叶片芥子酶TGG1[5]和番木瓜
芥子酶 cPTGG1[14-15]的反应最适温度范围为 37~55℃；
然而，同根部芥子酶重组蛋白TGG4和TGG5最高活
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8 9.5 10pH
相
对
酶
活
性
/%
根部芥子酶TGG4TGG5
图5 pH对根部芥子酶活性的影响
图6 根部芥子酶Linewear-Burk图
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 60 80 100 200 300 400NaCl浓度/(mmol/L)
相
对
酶
活
性
/%
根部芥子酶
TGG4
TGG5
图7 NaCl对根部芥子酶活性的影响
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 0.5 1 1.51/[s]
1/[v]
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吴丽娟等：拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其与重组蛋白酶学活性比较研究
性温度 67℃和 57℃相比，根部提取的芥子酶活性在
57℃时活性就已经降到了 41%，说明根部提取芥子酶
与重组蛋白酶对温度敏感性有所不同，根部芥子酶对
温度更敏感，但不如重组蛋白耐高温。这可能与拟南
芥根部在自然界生长的环境温度[16]有关，根部提取芥
子酶的结构更容易受温度影响而变性甚至失活。
在较大的pH范围内，芥子酶仍然有很高的反应活
性，但不同植株或同一植株不同部位的最适 pH亦不
同[6]。TGG4和TGG5重组蛋白最适反应pH分别为6.5
和5.5，最适反应pH范围为4.0~10.0，根部芥子酶对pH
的适应范围明显没有重组蛋白的广，强酸强碱都将抑
制根部芥子酶的活性。因此笔者推测根部芥子酶不能
帮助植株的根适应强酸强碱的土壤环境。
Ute等 [17]报道毕赤酵母表达重组蛋白 TGG4、
TGG5的Km值分别为245 μmol/L和547 μmol/L，Vmax分
别为 12 μmol/(min·mg)和 48 μmol/(min·mg)。由此可
以看出，笔者所提取的拟南芥根部芥子酶是由TGG4
和TGG5所共同组成，而且TGG4和TGG5在拟南芥根
部都有表达，共同对根部的生长发育起作用的。但二
者之间的相互作用关系仍需进一步进行研究探讨。
辛曙丽等[4]报道，重组蛋白TGG5在NaCl浓度为
600 mmol/L时，残余酶活性为最大值的23.4%；并且推
测随着NaCl浓度的增加，芥子酶的活性最终可能会被
完全抑制。综上述，对比重组蛋白对盐的敏感度情况
可以看出拟南芥根部芥子酶对盐的敏感度要强于重组
蛋白。笔者认为当NaCl的浓度为 200 mmol/L时，根
部芥子酶的活性可能就已经被完全抑制，表明该酶在
根部耐盐的生理中不起作用。而后测得的活性极有可
能是其他芥子酶如PYK10[18]作用的结果，但还需要进
一步进行试验验证。
4 结论
2002年，Petersen等[19]在拟南芥的根部发现有芥子
酶底物硫代葡萄糖苷存在，这说明有一个有功能的芥
子酶系统在根部存在着，而随着TGG4[1]、TGG5[5]的发
现更是证明了这一点。基因搜索结果表明 TGG4、
TGG5同已发现的拟南芥芥子酶基因有所不同：同已
报道芥子酶含有12个外显子不同，新型芥子酶具有13
个外显子；而且TGG4还具有不一样的GC 5’供体剪
接位点。正是由于根中的芥子酶基因和其他器官的不
同，更可能有不同的特性，而其功能作用也很有可能有
很大的不同。酶活性(Enzyme activity)指的是在一定
条件下，酶催化底物反应的速度[2]。但是在实际测定
中，测定的结果与所采用的各项测定条件有关，采用不
同的测定条件，将会得出不同的结果。因此，为了选择
最适宜的拟南芥根部芥子酶活性的测定条件，提高实
验结果的准确性，有必要对芥子酶活性测定中的几个
主要影响因素进行研究。
结果表明：当Vc为2 mmol/L，温度为37℃，pH 4.5
时，拟南芥根部芥子酶活性最高；根据Linewear-Burk
图可知Km=440.57 μmol/L，Vmax=60.35 μmol/(min·mg)；
同时发现NaCl对根部芥子酶的抑制作用十分明显。
笔者发现虽然根部提取的芥子酶同其他芥子酶一样具
有典型的芥子酶的酶学特征，但是与酵母表达的重组
蛋白酶学特性仍有不同，通过对比发现：抗坏血酸对根
部芥子酶的最佳激活浓度更高；而最适温度以及pH范
围基本一致，但根部芥子酶在高温下更容易变性，对强
酸强碱的适应性也没有重组蛋白的好；同时发现NaCl
对根部芥子酶的抑制作用更明显。通过这些对比，可
以推测出拟南芥根部芥子酶的部分功能：拟南芥根部
芥子酶TGG4和TGG5是同时存在于根中，共同调节
根部的生长的生理过程；但它们不像其他芥子酶能够
抵御病虫侵袭，在根部耐盐碱、耐高温等抗逆生理过程
中也不起作用。
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更正说明
《中国农学通报》2012年第28卷第6期第219页图2，经核对发现色谱图有点问题，特予以更正，并对广大
读者致歉！
图2更正为如下：
1为敌百虫，2为噻菌灵
图2 标准品的色谱图
作者：高智席
2012.08.30
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