全 文 ：基金项目：国家自然科学基金(30871324)；山东省农业科学院博士科研启动基金“MicroRNA在植物抗逆中的作用机理研究”(2006YBS001)；山东省农
业科学院青年基金“利用油体蛋白表达系统生产成骨蛋白的研究”(2007YQN001)资助。
第一作者简介：谢传胜，男，1985年出生，硕士研究生，研究方向：植物发育生物学。通信地址：250010山东省济南市桑园路11号山东省农业科学院
高新技术研究中心106室，E-mail：xotte@163.com。
通讯作者：王兴军，男，1966年出生，博士，教授。研究方向：植物发育生物学。通信地址：250010山东省济南市桑园路11号山东省农业科学院高新
技术研究中心106室，Tel：0531-83179470，E-mail：xingjunw@hotmail.com。
收稿日期：2009-07-10，修回日期：2009-08-09。
拟南芥和烟草幼嫩种子RNA不同提取方法的比较
谢传胜 1,2，宋国琦 2，王兴军 1,2，夏 晗 2，赵传志 2，毕玉平 2
（1山东师范大学生命科学学院，济南 250014；2山东省农业科学院高新技术中心，山东省作物与畜禽品种
改良生物技术重点实验室，农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开发实验室，济南 250100）
摘 要：拟南芥和烟草在植物分子生物学研究中都占有非常重要的地位，为了后续试验的顺利进行，欲探
索适合提取拟南芥及烟草幼嫩种子总RNA的经济快捷的方法。采用4种方法分别对拟南芥和烟草幼嫩
种子的总RNA进行了提取和分析，3种方法所提取的总RNA均能满足一般的下游操作。Trizol法提取
的RNA质量低。CTAB-异丙醇法提取的总RNA产量最高，并具有提取步骤少，操作时间短，价格便宜等
优点，可用于大量样品提取；百泰克试剂盒提取时间短，可在常温下操作；CTAB-LiCl法提取的总RNA
基本无基因组DNA的污染，但是不利于小分子RNA的沉淀。经紫外分光光度计检测，3种方法提取的
总RNAOD260/OD280均在1.80~1.97，表明蛋白质及其他有机溶剂的污染很少，OD260/OD230在2.03~2.37，表
明盐类小分子的污染也较少；电泳检测 28S rRNA和 18S rRNA条带清晰，28S rRNA的亮度基本为 18S
rRNA的2倍，所提取的总RNA质量较高。将CTAB-异丙醇法提取的拟南芥总RNA用于反转录，可获得
高质量的cDNA，ds cDNA清晰的分布在100~3000 bp之间。
关键词：拟南芥；烟草；幼嫩种子；RNA提取
中图分类号：S188 文献标识码：A 论文编号：2009-1417
RNA Extraction from Arabidopsis thaliana and Nicotiana tobaccum
Immature Seeds using Different Methods
Xie Chuansheng1,2, Song Guoqi2, Wang Xingjun1,2, Xia Han2, Zhao Chuanzhi2, Bi Yuping2
(1Science College, Shandong Normal Unveristy, Jinan 250014; 2High-Tech Research Center, Shandong Academy of
Agricultural Science, Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animal and Poultry of Shandong Province,
Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai, Ministry of Agriculture, Jinan 250100)
Abstract: Total RNA was extracted from immature seed of Arabidopsis thaliana and Nicotiana tobaccum using
four different methods. Trizol reagent resulted in low quantity and poor quality of RNA. The other three meth⁃
ods could isolate RNA from immature seed with quality that match the downstream experiments. Among these
methods, CTAB-Isopropyl alcohol method could get the highest yield of total RNA, with the advantages of time
saving and low cost. Bioteke kit was also a convenient method to isolate immature seed RNA under room tem⁃
perature. CTAB-LiCl method could get higher quality total RNA without genome DNA contamination. Howev⁃
er, LiCl couldnt precipitate small molecule RNA well. The quality of total RNA isolated using the above three
methods was analyzed with UV spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. The OD260/OD280 ratio was
1.80-1.97 and OD260/OD230 ratio was 2.03-2.37. 28S rRNA and 18S rRNA were clearly detected in the RNA
electrophoresis. Total RNA isolated by these methods was reverse transcribed and high quality cDNAs were ob⁃
tained.
Key words: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tobaccum, immature seed, RNA extraction
中国农学通报 2009,25(23):78-81
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
从植物组织中提取纯度高和完整性好的RNA是
进行许多分子生物学实验的重要前提[1]。Northern杂
交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立 cDNA文
库，RT-PCR及差异显示分析等分子生物学研究都需要
高质量的RNA。目前，用于植物细胞总RNA提取的
主要方法有Trizol试剂快速提取法、CTAB法[2]、热硼酸
法及改良的热硼酸法[3]、苯酚法[4]、LiCl-尿素法[5]、改良
的Gomez法[6]、CsCl超离提取法[7]及总RNA提取试剂
盒等。但是在众多的提取方法中，针对不同的植物材
料，要选择不同的提取方法，才能取得较好的提取效
果。即使是同一植物材料，不同的组织提取方法也有
差异。因此，要得到质量较高的RNA，为下一步的试
验分析打下良好基础，必须在众多的提取方法中，选择
出适合目的材料的方法。
拟南芥和烟草在植物分子生物学研究中都占有
非常重要的地位。许多针对其总RNA提取的试剂盒
已经研发出来，有些商业试剂盒的提取效果良好，但
是大量提取时成本昂贵[8]，且对不同组织器官的RNA
提取没有通用性。因此，为了寻找适合提取拟南芥及
烟草幼嫩种子总RNA经济快捷的方法，笔者以拟南
芥和烟草球形胚时期的幼嫩种子为试验材料，选用 4
种不同的方法提取幼嫩种子的总RNA，比较了其提
取结果。
1 材料与方法
1.1 试验时间与地点
试验于2009年3—4月在山东省农业科学院高新
技术研究中心进行。
1.2 材料
拟南芥在培养室中种植，烟草在普通温室中种
植。在解剖镜下取拟南芥授粉大约 7天后的幼嫩种
子，迅速投入液氮中冷冻，于-70℃冰箱保存。同样方
法取烟草授粉7天左右的幼嫩种子。
1.3 方法
1.3.1 样品处理 拟南芥及烟草种子RNA提取所用的
器具和药品均为RNase-Free，处理方法按照分子克隆
实验指南第二版进行[9]。
（1）百泰克试剂盒法：采用通用植物总RNA提取
试剂盒（离心柱型），购自北京百泰克生物技术有限公
司，具体实验步骤参照说明书。
（2）Trizol法：具体实验步骤参照说明书。
（3）CTAB-LiCl法：取0.2 g新鲜组织或-70℃保存
的样品，在液氮中充分研磨成粉末状，将磨好的粉末迅
速转移至65℃预热的含有600 µl CTAB提取液[10]的离
心管中，立即涡旋振荡30 s，使其混匀；置65℃水浴中
2~5 min，期间涡旋振荡 3~5次；稍微冷却后加入等体
积的氯仿/异戊醇涡旋振荡 1 min后，4℃，12000 r/min
离心 15 min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇涡
旋振荡1 min，4℃，12000 r/min离心15 min；将上清转
移到一新的离心管中，加入1/3体积的8 mol/L LiCl，使
其终浓度为 2 mol/L，4℃过夜沉淀；4℃，12000 r/min
离心 20 min，弃上清；分别用 70%乙醇，无水乙醇洗沉
淀，室温晾干，加30~50 µl DEPC-H2O溶解沉淀。
（4）CTAB-异丙醇法：步骤同CTAB-LiCl法，用等
体积的异丙醇沉淀。
1.3.2 总RNA浓度及其完整性检测 用紫外分光光度
计（Eppendorf BioPhotometer Plus）测定总RNA的浓度
及纯度，以 1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整
性，电泳条件为：电压6 V/cm，时间15 min。
1.3.3 mRNA的纯化及双链 cDNA的合成 以CTAB-
异丙醇法提取的拟南芥幼嫩种子总RNA为模板，纯化
其mRNA(QIAGEN试剂盒)，用Clontech的 cDNA合成
试剂盒进行cDNA合成，具体步骤按照说明书进行。
2 结果与分析
2.1 4种方法提取的拟南芥及烟草幼嫩种子总RNA完
整性检测
将 4种方法提取的拟南芥及烟草幼嫩种子总
RNA样品进行1%普通琼脂糖凝胶电泳，结果见图1和
图 2。试剂盒、CTAB-LiCl及CTAB-异丙醇法都能成
功的提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总 RNA，只有
Trizol法没有提取成功。在Trizol法提取的RNA中，
未检测到28S rRNA和18S rRNA，只检测到5S rRNA，
说明Trizol法不适合提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总
RNA。在CTAB-LiCl及异丙醇法中，28S rRNA和 18S
rRNA条带清晰，28S rRNA的亮度基本为18S rRNA的
2倍，表明提取的总RNA很少降解。CTAB-异丙醇法
提取的5S rRNA条带较CTAB-LiCl法明显。CTAB-异
丙醇法提取的RNA电泳检测时，在点样孔下方有明显
的亮带，说明该方法提取的 RNA有较多的基因组
DNA污染；CTAB-LiCl法所提取的总RNA基本无基
因组DNA污染，但是对小分子RNA的沉淀效果不如
CTAB-异丙醇。在图 2中，用百泰克试剂盒提取的烟
草及拟南芥幼嫩种子的总 RNA中，28S rRNA、18S
rRNA和 5S rRNA带型清晰，且两条带之间无弥散现
象，说明提取的总RNA质量好、无降解现象。
2.2 4种方法提取的拟南芥及烟草幼嫩种子总RNA浓
度及纯度检测
用紫外分光光度计测定4种方法提取的拟南芥及
谢传胜等：拟南芥和烟草幼嫩种子RNA不同提取方法的比较 ·· 79
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
图1 Trizol法，CTAB-LiCl及异丙醇法提取拟南芥和烟草幼嫩种子总RNA的电泳结果
1、3、5分别为Trizol法、CTAB-LiCl法、CTAB-异丙醇法提取的拟南芥幼嫩种子的总RNA；2、4、6分别为Trizol法、CTAB-LiCl法、CTAB-异丙醇
法提取的烟草幼嫩种子的总RNA。
1 2 3 4 5 6
烟草幼嫩种子的总RNA的浓度与纯度（表1）。结果显
示，除Trizol法外，其他 3种方法提取的拟南芥及烟草
幼嫩种子总RNA的OD260/OD280均在1.80~1.97，表明所
提取的总RNA中蛋白质及其他有机溶剂的污染很少；
OD260/OD230在 2.03~2.37，表明盐类小分子的污染也较
少。由Trizol法提取的拟南芥幼嫩种子的总RNA的
OD260/OD280为 1.58，表明所提取的RNA中蛋白质及其
他有机溶剂的污染较重，而Trizol法提取的拟南芥及
烟草幼嫩种子的 5S rRNA OD260/OD230在 0.32~0.51，说
明所提取的RNA盐类小分子的污染严重。CTAB-异
丙醇法提取的拟南芥幼嫩种子总RNA量达到431 µg/
g，烟草幼嫩种子的总RNA量为306 µg/g，而CTAB-Li-
Cl法提取的拟南芥幼嫩种子总RNA量为298 µg/g，烟
草幼嫩种子的总RNA量为191 µg/g，产量不同的原因
可能是CTAB-LiCl法提取总RNA时，不能成功沉淀一
些小片段RNA。
图2 百泰克Kit，CTAB-LiCl及异丙醇法提取拟南芥和烟草幼嫩种子总RNA的电泳结果
1~3为百泰克Kit提取的烟草幼嫩种子的总RNA；4~6为百泰克Kit提取的拟南芥幼嫩种子的总RNA；7~9为CTAB-异丙醇法提取的拟南芥幼
嫩种子的总RNA；10~11为CTAB-LiCl法提取的拟南芥幼嫩种子的总RNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
表1 不同方法提取拟南芥及烟草幼嫩种子总RNA的产量与纯度比较
方法
Trizol法
百泰克试剂盒法
CTAB-LiCl法
CTAB-异丙醇法
组织
拟南芥幼嫩种子
烟草幼嫩种子
拟南芥幼嫩种子
烟草幼嫩种子
拟南芥幼嫩种子
烟草幼嫩种子
拟南芥幼嫩种子
烟草幼嫩种子
总RNA产量(µg/g)
193
79.3
380
369
298
191
431
306
纯度 OD260/OD280
1.58
1.89
1.97
1.81
1.82
1.80
1.86
1.84
纯度 OD260/OD230
0.51
0.32
2.09
2.03
2.37
2.23
2.26
2.17
2.3 cDNA的合成及琼脂糖凝胶电泳检测
上述试验结果表明，CTAB-异丙醇法提取的拟
南芥和烟草幼嫩种子总RNA量大且完整性好，采用
此法提取的拟南芥总 RNA反转录 cDNA，取 6 µl进
行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示在 100~3000 bp
之间有清晰的 cDNA弥散带（图 3），说明此法提取的
总RNA质量很好，通过反转录方法能得到高质量的
cDNA。
3 讨论
在进行 cDNA文库建立及基因克隆研究中，高质
量RNA的获得是非常关键的一步。笔者比较了 4种
方法提取拟南芥和烟草幼嫩种子总RNA的效果。虽
然 Trizol提取法方法简便，操作简单，整个试验流程
短，在RNA提取中被广泛应用，但该方法对拟南芥及
烟草幼嫩种子的总RNA提取效果很差，无法获得完整
的总RNA；百泰克公司生产的通用植物总RNA快速
·· 80
提取试剂盒可在常温下操作，方法简便，花费时间短，
从总RNA提取量和提取质量上看，能够满足大部分下
游操作的要求，但试剂的价格相对偏高；CTAB-LiCl法
和CTAB-异丙醇法提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总
RNA效果都很好，总RNA的产量也较高。但是，选用
的沉淀剂不同，提取效果也不相同，选用异丙醇做沉淀
剂提取的总RNA可能存在基因组DNA的污染，但是
能成功的沉淀小分子RNA；选用LiCl做沉淀剂提取的
总RNA基本无基因组DNA污染，但是对小分子RNA
的沉淀效果不理想。在提取总RNA时，要根据不同的
后续试验需要，选择不同的沉淀方法。反转录是检测
RNA质量的良好方法，因为多糖等杂质的污染将抑制
RNA的反转录，同时RNA的降解也会影响mRNA反
转录的 cDNA长度，导致后续试验失败。笔者以
CTAB-异丙醇法提取的拟南芥幼嫩种子总RNA进行
反转录检测，结果表明所提取的总RNA完整性好并且
纯度较高。
烟草种子中含有较多的蛋白质、多糖、生物碱以
及有机酸、色素等物质，因此，笔者提取烟草幼嫩中的
RNA时，用了两次氯仿抽提，有效地去除了样品中的
蛋白质及其他的次生代谢物。烟草幼嫩种子匀浆时，
酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，但
Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类
物质的总量之间并无相关性[11]。试验中发现，样品研
磨后快速加入预热CTAB提取液中，能有效的减少酚
类物质的氧化对RNA质量的影响。
分离完整性好、纯度高的拟南芥及烟草幼嫩种子
总RNA的关键是无RNase的污染，提取RNA时应尽
量避免外源RNase的污染，抑制内源RNase的活性。
所有的试验器皿都应进行严格的去RNase处理，另外
还应注意：（1）用于提取 RNA的材料应是健康新鲜
的。（2）整个提取过程要迅速，研钵应提前进行液氮预
冷。在研磨过程中，样品应始终处于冷冻状态。（3）为
了防止DNA和蛋白质污染，上清液转移时，不要吸取
中间层。
参考文献
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图3 cDNA琼脂糖检测结果
M：TaKaRa Plus DL-2000 DNA marker；1、2：拟南芥幼嫩种子的
cDNA；3：对照
5000 bp
3000 bp
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3
5000bp3000bp2000bp
1000bp750bp500bp
250bp100bp
谢传胜等：拟南芥和烟草幼嫩种子RNA不同提取方法的比较 ·· 81