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湖南农业大学学报(自然科学版) 2016, 42(3):247–250. DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2016.03.005
Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)
 
投稿网址：http://xb.ijournal.cn
拟南芥 sscd1–1 点突变对其表达的影响
黄弈 1，韩成云 3，支添添 1，任春梅 1,2*
(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；
3.宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000)

摘 要：为了探明拟南芥 sscd1–1 突变体中 sscd1–1突变基因表达水平的降低是由剪切效率所致还是由自身启动
子影响所致，分别构建了由外源 35S启动子驱动的 SSCD1正常基因和 sscd1–1突变基因的表达载体及由内源自身
启动子驱动的 SSCD1 正常基因和 sscd1–1 突变基因的表达载体，并将其转入到拟南芥 sscd1–1 突变体中。采用
RT–PCR分析 sscd1–1突变基因的表达。结果显示：外源 35S启动子驱动的 sscd1–1突变基因的表达与正常基因相
比没有明显差别，而内源自身启动子驱动的 sscd1–1 突变基因的表达显著降低，这表明 sscd1–1 的点突变没有影
响其剪切效率；sscd1–1突变基因表达水平的降低是由内源自身启动子影响所致。
关 键 词：拟南芥；sscd1–1；启动子；基因表达
中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2016)03−0247−04

Effects of Arabidopsis point mutation sscd1–1 on its expression
Huang Yi1, Han Chengyun3, Zhi Tiantian1, Ren Chunmei1,2*
(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Crop Gene
Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha 410128, China; 3.College of Chemistry and Biology
Engineering, Yichun University, Yichun, 336000, China)

Abstract: To investigate whether the reduction of the gene’s transcription level from mutated sscd1–1 in Arabidopsis is
induced by splicing efficiency or its own promoter regulation, expression vectors of exogenous 35S promoter and
endogenous promoter driven by normal SSCD1 gene and sscd1–1 mutated gene respectively were firstly constructed, then
it was transformed into Arabidopsis sscd1–1 mutant, the expression of the sscd1–1 mutated gene was analyzed by
RT–PCR. The results showed that its expression did not affected by 35S promoter driven by sscd1–1 mutated gene,
however, the expression level of sscd1–1 mutated gene driven by its endogenous promoter was significantly decreased.
Hence, the point mutation in sscd1–1 did not affect the splicing efficiency of the sscd1–1 gene, the reduction of sscd1–1
expression level was caused by its endogenous promoter.
Keywords: Arabidopsis; sscd1–1; promoter; gene expression


收稿日期：2015–09–29 修回日期：2016–04–14
基金项目：国家自然科学基金项目(30671121)；江西省科学技术厅青年科学基金计划项目(20151BAB214011)
作者简介：黄弈(1990—)，男，湖南株洲人，硕士研究生，主要从事植物分子遗传学研究，435399406@qq.com；*通信作者，任春梅，博士，教授，
主要从事植物分子遗传学研究，rencm66@163.com
在动物体内，酪氨酸降解途径是一条必不可少
的代谢途径[1]。酪氨酸降解途径的最后一步是延胡
索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)将延胡索酸乙酰乙酸水
解成乙酰乙酸和延胡索酸。FAH缺失会导致动物患
先天性致死病症。目前，关于植物中酪氨酸降解途
径的研究尚少。在笔者的前期研究中，通过 EMS
诱变，在拟南芥中分离出了短日照条件下发生细胞
死亡的 sscd1–1突变体，并对 SSCD1基因进行了图
位克隆，发现该基因编码 FAH[2–6]。sscd1–1突变体
的单碱基突变位点发生在该基因第 4个外显子的最
后一个碱基，由 G变成 A。由于 sscd1–1突变体的
突变位点发生在剪接识别位点，所以，推测 mRNA
的剪切很可能会受其影响。在前期研究中，笔者通
过 RT–PCR分析和 cDNA扩增测序，发现突变体的


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cDNA序列除 1个碱基发生了突变外，其他都没有
变化，说明突变体没有发生剪接位点的改变[6]，但
RT–PCR结果显示突变体mRNA的表达水平明显下
降，所以，据此可推测 sscd1–1 突变体转录水平的
下降可能是由剪切效率降低所致或者是由内源自
身启动子调控所致。本研究中以拟南芥 Col–0野生
型和 sscd1–1突变体为材料，分别构建了由外源 35S
启动子驱动的 SSCD1正常基因和 sscd1–1突变基因
的表达载体，及由内源自身启动子驱动的 SSCD1
正常基因和 sscd1–1 突变基因的表达载体，并将其
转入到拟南芥中，检测 SSCD1基因 mRNA的表达。
现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col–0和突
变体 sscd1–1[6]以及载体 pMyc2[7–8]和 pFLAG[8]由作
物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题
组保存。
1.2 植物的培养
将拟南芥种子用消毒液浸泡 10 min，无菌水清
洗 3 次，播种于含 1%蔗糖的 MS 固体培养基上，
避光 4 ℃春化 3 d后，转入人工气候箱生长，培养
温度为(22±2) ℃。长日照光周期为 16 h光照/8 h黑
暗，短日照光周期为 8 h光照/16 h黑暗。待拟南芥
种子生长 7 d后，移栽到盛有浸透营养液的人工土
壤(东北黑土与蛭石的体积比为 1∶1)中，盖透明塑
料薄盖生长 1~2 d后再置于光照培养室生长。
1.3 表达载体的构建
1.3.1 引物设计及 SSCD1 全基因和含内源启动子
SSCD1 的克隆
根据 TAIR网站上公布的拟南芥 SSCD1基因序
列，用软件 Primer Premier 5 设计 2 对引物
pMS–F/pMS–R、pFS–F/pFS–R。以 Col–0野生型和
sscd1–1 突变体基因组 DNA 为模板，分别扩增
SSCD1 基因和含内源启动子的 SSCD1 基因。根据
载体 pMyc2和 pFLAG 带有的限制性酶切位点，在
正、反引物的 5′端分别加上 SmaⅠ和 SacⅠ位点，
序列为 pMS–F(5′–CCCGGGATGGCGTTGCTGAA
GTCTTT–3′)、pMS–R(5′–GAGCTCACTTATTGTTA
ATGGGTTGG–3′)；pFS–F(5′–GAGCTCCCCTCCAC
CACCATCGCCAG–3′)和 pFS–R(5′–CCCGGGAGG
CGGTGAAGGAACAATTT–3′)，序列下划线部分
“CCCGGG”为 SmaⅠ位点，“GAGCTC”为 SacⅠ位
点。引物 pMS–F/pMS–R和 pFS–F/pFS–R的退火温
度分别为 55 ℃和 66 ℃。将扩增后的 PCR产物经
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶，回收，纯化。
1.3.2 载体连接和基因测序及农杆菌转化
用 SmaⅠ和 SacⅠ限制性内切酶分别对上述
PCR产物和 pMyc2及 pFLAG载体进行双酶切，经
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收目的片段和
目的载体。用 T4 连接酶将 SSCD1 正常基因和
sscd1–1 突变基因分别连接至 pMyc2 载体的相应位
点；将含内源启动子的 SSCD1正常基因和 sscd1–1
突变基因分别连接至 pFLAG 载体的相应位点，分
别构建 pMyc2–35S::SSCD1、pMyc2–35S::sscd1–1的
表达载体和 pFLAG–en::SSCD1、pMyc2–en::sscd1–1
的表达载体。采用热激法将重组载体转化至大肠杆
菌 DH5α，取阳性克隆送华大基因公司测序。采用
电击法将测序验证正确的重组载体转化到根癌农
杆菌 AGL–1中，挑取阳性克隆进行菌落 PCR鉴定。
1.3.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化以及转化子
筛选鉴定
挑取已转入重组载体的阳性农杆菌单菌落于
含有卡那霉素(50 mg/L)、羧苄青霉素(100 mg/L)的
YEB液体培养基中活化，采用浸化法[9]转化拟南芥
sscd1–1 突变体，并收获 T0代种子。在含有卡那霉
素(50 mg/L)的 MS 培养基上筛选转 pMyc2–35S::
SSCD1表达载体和转 pMyc2–35S::sscd1–1表达载体
的转基因植株，在含有潮霉素(20 mg/L)的MS培养
基上筛选转 pFLAG–en::SSCD1表达载体和转 pMyc2–
en::sscd1–1表达载体的转基因植株。将筛选到的转
基因植株 T1代抗性苗移入土中，后代单株收种。挑
选 T2代抗性符合 3∶1分离比的转基因株系，自交
纯合后用于基因表达分析试验。
1.4 基因表达分析
分别取生长 14 d的 Col–0野生型、sscd1–1突


第 42 卷第 3 期 黄弈等 拟南芥 sscd1–1 点突变对其表达的影响 249
 
变体以及转基因植株的莲座叶片，采用 Trizol法提
取总 RNA。按照 ReverTra Ace qPCR RT Kit的操作
说明，以总 RNA为模板，反转录合成第一链 cDNA
进行 RT–PCR分析，重复试验 2次。SSCD1基因的
引 物 为 5′–CCTCGTCCTGCCGTCGCTAT–3′ 和
5′–CTTGTGGATGGCCCTGACCT–3′；内参 ACT2
的引物为 5′–TTCCGCTCTTTCTTTCCAAGCTCA–
3′和 5′–AAGAGGCATCAATTCGATCACTCA–3′。
反应程序：94 ℃预变性 2 min； 94 ℃变性 30 s，
50~55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 25个循环；
72 ℃终延伸 10 min。
2 结果与分析
2.1 sscd1–1 突变体中 SSCD1 基因的表达
SSCD1基因表达水平的 RT–PCR检测结果(图 1)
显示，野生型中 SSCD1基因的表达量较高，而 sscd1–1
突变体中 SSCD1 基因的表达量与野生型相比明显降
低，而且长、短日照条件下的表达情况没有明显差别。
这表明 SSCD1基因在 sscd1–1突变体中 mRNA的表
达水平显著下降，且不受光周期的影响。

A B
1，3 野生型对照；2，4 sscd1–1突变体；A 长日照；B 短
日照。
图 1 SSCD1 基因表达的 RT–PCR 检测结果
Fig.1 SSCD1 gene expression detected by RT–PCR
2.2 sscd1–1 点突变对其剪切的影响
从含有潮霉素的 MS 培养基中分别筛选出 35S
启动子驱动 SSCD1正常基因和 sscd1–1突变基因转
入 sscd1–1 突变体的纯合株系各 2 个。转基因植株
中 SSCD1基因表达水平的 RT–PCR检测结果(图 2)
显示，35S启动子驱动的 SSCD1正常基因的表达水
平与 sscd1–1 突变基因的表达水平相比没有明显差
别，而且其在长、短日照条件下的表达水平基本相
同。结合 sscd1–1 突变体没有发生剪接位点改变这
一研究结果，可以推断 sscd1–1 剪接位点的突变没
有影响其剪切效率。

A B
1，2 35S启动子驱动 SSCD1正常基因转入 sscd1–1突变体
的不同株系；3，4 35S启动子驱动 sscd1–1突变基因转入 sscd1–1
突变体的不同株系；A 长日照；B 短日照。
图 2 35S 启动子驱动 SSCD1 基因表达的 RT–PCR
检测结果
Fig.2 Gene expression from SSCD1 driven by 35S promoter
in RT–PCR detection
2.3 sscd1–1 突变体内源启动子对其表达的影响
从含有潮霉素的MS培养基中分别筛选出内源
启动子驱动 SSCD1正常基因和 sscd1–1突变基因转
入 sscd1–1 突变体的纯合株系各 2 个。转基因植株
中 SSCD1基因表达水平的 RT–PCR检测结果(图 3)
显示，内源启动子驱动 sscd1–1 突变基因的表达水
平相对于 SSCD1 正常基因的显著降低，而且其在
长、短日照条件下的表达水平基本相同。这表明
sscd1–1 突变基因表达水平的降低是由内源自身启
动子的影响所致。

A B
1，2 内源启动子驱动 SSCD1正常基因转入 sscd1–1突变体
的不同株系；3，4 内源启动子驱动 sscd1–1突变基因转入 sscd1–1
突变体的不同株系；A 长日照；B 短日照。
图 3 内源启动子驱动 SSCD1 基因表达的 RT–PCR
检测结果
Fig.3 SSCD1 gene expression driven by the endogenous promoter
in RT–PCR detection
3 结论与讨论
本试验中分别构建了由外源 35S启动子驱动的
SSCD1正常基因和 sscd1–1突变基因的表达载体，
及由内源自身启动子驱动的 SSCD1 正常基因和
sscd1–1 突变基因的表达载体，并将其转入到
sscd1–1突变体中。转基因植株中 SSCD1正常基因
和 sscd1–1突变基因表达水平的 RT–PCR检测结果
表明，sscd1–1 的点突变没有影响其剪切效率，
sscd–1–1突变基因表达水平的降低是由内源自身启
动子的影响所致。
SSCD1
ACT2
1 2 3 4 1 2 3 4
SSCD1
ACT2
1 2 3 4 1 2 3 4
SSCD1
ACT2
1 2 3 4


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在本研究中，SSCD1基因突变位点发生在一个
外显子右末端和内含子左末端的分界点，即发生在
左剪接位点(Left splicing junction)，由 G突变成 A。
在内含子两端分别有 2个非常保守的碱基，左剪接
位点为 GT，右剪接位点为 AG。从理论上讲，内含
子在剪接位点的这种特征称为 GT–AG 规则
(GT–AG role)，剪接位点 GT或 AG的突变均可以
阻止剪接出现[10]。因为 sscd1–1 突变体没有发生剪
接位点改变[6]，35S启动子驱动 sscd1–1突变基因的
表达水平相对于 SSCD1正常基因的没有明显差别，
所以，sscd1–1 剪接位点突变没有影响该基因的剪
切效率。这一现象的原因有待研究。内源自身启动
子驱动的 sscd1–1 突变基因的表达相对于正常基因
的显著降低，表明 sscd1–1 突变基因表达水平的降
低是由内源自身启动子的影响所致。
真核基因表达调控在后基因组时代的研究中占
有十分重要的地位，它将有助于进一步阐明重要的
生命现象，解释细胞行为和疾病的发生机理[11]。本
研究中拟南芥 sscd1–1 点突变对其表达影响的研究
可为植物中酪氨酸降解途径的研究提供参考。
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责任编辑：王赛群
英文编辑：王 库