全 文 ：华北农学报·2013，28 ( 2 ) : 38 -41
收稿日期:2013 － 01 － 21
基金项目:国家自然科学基金(30900104) ;河北省自然科学基金(C2009000271)
作者简介:胡京蕊(1983 － ) ，女，河北隆尧人，助理农艺师，硕士，主要从事植物耐盐基因克隆和功能研究。
通讯作者:葛荣朝(1974 － ) ，男，河北故城人，教授，博士，主要从事植物抗逆基因的克隆与功能研究。
拟南芥耐盐相关基因 AtSTK原核表达载体的
构建及表达
胡京蕊1，沈金宝2，李晶岚1，李晓旭1，赵宝存1，葛荣朝1
(1．河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024;2．河北师范大学 汇华学院，河北 石家庄 050024)
摘要:提取拟南芥总 RNA，反转录获得 cDNA后 PCR 扩增获得 1 212 bp 目的基因 AtSTK。将该基因片段构建到
PET-32a表达载体，转化大肠杆菌 Rosetta菌，用 IPTG 进行诱导表达。该基因表达的最佳诱导条件为 IPTG 终浓度 1
mmol /L，诱导时间为 4 h，此时融合蛋白表达量最高。该融合蛋白存在于包含体中，经包含体溶解、复性，最终纯化获
得了 AtSTK融合蛋白，为 AtSTK蛋白的理化性质研究奠定了基础。
关键词:拟南芥;丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶;原核表达;耐盐基因
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)02 － 0038 － 04
Prokaryotic Expression Vector Construction and Expression of Tolerance
Related Gene AtSTK in Arabidopsis
HU Jing-rui1，SHEN Jin-bao2，LI Jing-lan1，LI Xiao-xu1，ZHAO Bao-cun1，GE Rong-chao1
(1． College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050016，China;
2． Huihua College of Hebei Normal University，Shijiazhuang 050091，China)
Abstract:Total RNA was extracted from Arabidopsis leaves． 1 212 bp AtSTK gene was amplified by RT-PCR
and constructed into the expression vector PET-32a． Then the recombinant plasmid was transformed into E． coli
Rosetta． The optimal induction conditions for AtSTK gene expression were 1 mmol /L IPTG and 4 hours induction．
Under these conditions，the expression level of the fusion protein was highest． It was found that the form of the fusion
protein was inclusion body． So the inclusion body was treated by dissolving and renaturation． Finally，the purified At-
STK fusion protein was obtained． This work laid the foundation for the next study on the physical and chemical prop-
erties of AtSTK protein．
Key words:Arabidopsis thaliana;Serine / threonine protein kinase;Prokaryotic expression;Salt tolerance gene
随着对植物耐盐分子机制研究的不断深入和转
基因技术的不断完善，许多与耐盐相关的基因被发
现。迄今为止，已有许多与植物耐盐相关的基因被
用于转基因研究中。其中参与胁迫信号传导的基
因，尤其是一些蛋白激酶基因受到了密切的关注。
蛋白激酶广泛参与到植物对干旱、盐胁迫、ABA
诱导、光诱导等的应答反应。丝氨酸 /苏氨酸蛋白激
酶是生物酶中的一个大家族，参与环境胁迫信号的
传递是其重要功能之一［1 － 2］。Lee 等［3］研究发现，
拟南芥中的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶基因 AtDBF2，
AtDBF2 与 Dbf2 受盐、干旱、冷和热等胁迫的诱导，
而且在转基因植物中过量表达，AtDBF2 能提高其抗
盐、干旱、冷、热等胁迫的能力。1997 年 Robinson［4］
提到在盐胁迫信号传导途径中参与渗透胁迫的
MAPK级联途径中的 3 个主要成分，以及 Pardo［5］提
出的钙调蛋白磷酸酶信号通路和最近 Zhu［6 － 8］提出
的 SOS信号通路中的 SOS2 也都是一类丝氨酸 /苏
氨酸蛋白激酶。花生中的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
在寒冷和盐胁迫应答中起着重要的作用［9］。拟南
芥的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶家族已发现的 57 个成
员中被证实参与各种胁迫应答信号传导过程的有
2 期 胡京蕊等: 拟南芥耐盐相关基因 AtSTK原核表达载体的构建及表达 39
23 个［10］。
AtSTK是我们从拟南芥中鉴定获得的耐盐相关
丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶基因，含有 1 137 bp的完整
开放阅读框，编码 378 个氨基酸，蛋白分子量为
46. 28 kDa。根据生物信息学分析，AtSTK 蛋白激酶
具有 CaM结合特性，具有磷酸化与去磷酸化的活性
位点。因此，本研究拟对 AtSTK基因进行原核表达，
获得 AtSTK纯化蛋白，以期从蛋白水平深入研究其
生化特性。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
原核表达体系采用 Rosetta大肠杆菌、表达载体
pET-32a，PCR反应所用试剂、低相对分子质量标准
蛋白、限制性内切酶均购自大连 TaKaRa 生物有限
公司，DNA片段回收试剂盒购自北京鼎国生物技术
有限公司，引物合成、基因测序由上海生工生物工程
公司完成。其他试剂均为国产分析纯。
1． 2 AtSTK基因表达载体构建
从拟南芥嫩叶中提取总 RNA，反转录获得 cD-
NA。根据 TAIR 库中 AtSTK 基因序列设计 PCR 引
物:Lp:5-GGAATTCATGGGTTGGATCCCGTGTT-3，
Rp:5-GCGAGCTCCTCTCCAAGAAAGACAGCAC-3(斜
体为酶切位点) ，利用 pfu DNA 聚合酶进行 PCR 扩
增，PCR 产物加 A 后连接到 pMd18-T 载体，对其中
的 AtSTK基因进行测序鉴定。然后将 pmd18-T-At-
STK质粒与 pET-32a 质粒分别用 EcoR Ⅰ /Sac Ⅰ双
酶切，回收酶切产物，用 T4 DNA 连接酶连接，转入
Rosetta 大肠杆菌，对阳性克隆鉴定后，进行诱导
表达。
1． 3 AtSTK基因的诱导表达
对含有 pET-32a-AtSTK 质粒的 Rosetta 菌液在
LB液体培养基(Amp +)中 37 ℃振荡培养 3 ～ 4 h，
至 OD值 0． 6 左右，分别加入不同浓度的 IPTG:0，
0. 5，0． 8，1． 0 mmol /L，30 ℃培养，诱导表达 1，2，3，
4，5 h，分别取出 1 mL样品，提取蛋白。
1． 4 包含体蛋白的复性与纯化
菌液进行初步检测后，发现表达蛋白处于包含
体之中，因此在蛋白诱导表达后，收集菌体，按 1 g
(湿质量)加1 mL包含体溶解液(Tris-HCl 20 mmol /L，
NaCl 0． 3 mol /L，尿素 8 mol /L，pH 值 8． 0)重新悬
浮，25 ℃溶解过夜，12 000 r /min 离心 20 min，取上
清液放入截流分子量为 12 kDa的透析袋中，于 4 ℃
用蒸馏水透析 12 h，每隔 3 h 换水一次。处理后的
蛋白质溶液用 Ni2 + -NTA 金属螯合树脂柱进行层析
纯化，获得 AtSTK 蛋白，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳
检测。
2 结果与分析
2． 1 AtSTK基因的扩增及载体构建
经 PCR扩增获得 1 137 bp的目的基因片段(图
1-A) ，对目的片段回收后连接到 pMD18-T克隆载体
并转化到大肠杆菌 DH5α中，经测序检测，该序列与
拟南芥 TAIR 库中 at5g02800． 1 基因序列一致。然
后从大肠杆菌 DH5α中提取质粒并进行酶切(图 1-
B) ，对目的基因片段回收后连接到表达载体 PET-
32a中，转化 Rosetta 大肠杆菌，并对重组表达载体
进行酶切鉴定(图 1-C)。
M． DNA标准分子量;A． PCR产物;B． pMd18-T-AtSTK EcoRⅠ /Sac Ⅰ
酶切产物;C． PET-32a-AtSTK EcoR Ⅰ /Sac Ⅰ酶切产物。
M． DNA Marker;A． PCR product;B． pMd18-T-AtSTK digested with
EcoR Ⅰ /SacⅠ;C． PET-32a-AtSTK digested with EcoR Ⅰ /Sac Ⅰ．
图 1 原核表达载体的构建及鉴定
Fig． 1 Construction and identification of
prokaryotic expression vector
2． 2 AtSTK基因的诱导表达
对含有 PET-32a-AtSTK 质粒的 Rosetta 菌在不
同诱导条件下进行蛋白表达，首先，设置诱导温度为
30 ℃，IPTG浓度设为 1 mmol /L，时间分别为 1，2，3，
4，5 h，诱导后电泳检测发现，随诱导时间增长，蛋白
表达量逐渐增多。诱导 4 h后，AtSTK表达量达到最
高(图 2)。
M．蛋白质分子量标准;A． AtSTK-PET-32a诱导后的全蛋白;
B． AtSTK-PET-32a 未经 IPTG诱导的全蛋白;C． PET-32a的全蛋白。
M． Protein molecular weight Marker;A． Total protein of induced
AtSTK-PET-32a;B． Total protein from transforming AtSTK-PET-32a
without being inducted by IPTG;C． Total protein from
transforming PET-32a empty vector．
图 2 不同诱导时间与 AtSTK融合蛋白表达量的关系
Fig． 2 Relation between expression quantity of AtSTK
fusion protein and induction time
40 华 北 农 学 报 28 卷
另外，将诱导温度设为 30 ℃，诱导时间为 4 h，
选择不同的 IPTG 浓度:0，0． 5，0． 8，1． 0 mmol /L，进
行诱导表达。结果表明，当不加 IPTG 时，无法诱导
出目的蛋白，当 IPTG 浓度为 0． 5，0． 8，1． 0 mmol /L
时，蛋白表达量逐渐增多，当 IPTG 浓度为 1． 0
mmol /L时，蛋白表达量达到最大(图 3)。
A．未诱导;B． 0． 5 mmol /L IPTG诱导;C． 0． 8 mmol /L IPTG诱导;
D． 1． 0 mmol /L IPTG诱导;M．蛋白质分子量标准。
A． Without induced;B． Induced by 0． 5 mmol /L IPTG;C． Induced
by 0． 8 mmol /L IPTG;D． Induced by 1． 0 mmol /L IPTG;M． Protein
molecular weight Marker．
图 3 不同 IPTG浓度与融合蛋白表达量的关系
Fig． 3 Relation between expression quantity of fusion
protein and concentration of IPTG
M．蛋白质分子量标准;A．细菌破碎后的上清液;
B．细菌破碎后离心获得的沉淀。
M． Protein molecular weight Marker;A． Total protein in the
supernatant of induced bacteria by splitting;B． Total protein
in the sediment of induced bacteria by splitting．
图 4 表达获得的 AtSTK蛋白凝胶电泳检测
Fig．4 Expression of AtSTK protein analyzed with SDS-PAGE
M．蛋白质分子量标准;A．包含体破碎产物电泳;
B． AtSTK蛋白复性后的电泳;C．纯化后的 AtSTK蛋白电泳。
M． Protein molecular weight Marker;A． SDS-PAGE of
dissolving inclusion body;B． SDS-PAGE of renatured AtSTK
fusion protein;C． SDS-PAGE of purified AtSTK fusion protein．
图 5 纯化的 AtSTK蛋白凝胶电泳
Fig． 5 SDS-PAGE result of the purified AtSTK protein
2． 3 AtSTK融合蛋白的纯化
细胞破碎后取上清与沉淀分别进行 SDS-
PAGE，结果表明，目的蛋白主要存在于沉淀中(图
4) ，即 AtSTK蛋白主要是以包含体的形式存在细胞
质中。因此，对细胞提取液利用包含体溶解液将包
含体进行裂解，然后对裂解产物利用 Ni2 + -NTA 金
属螯合树脂柱进行层析纯化、浓缩，经 SDS-PAGE 检
测，获得较为单一的目的蛋白(图 5)。
3 讨论
目的基因的原核表达受到众多因素的影响，其
中最为重要的两方面为原核表达的宿主菌系统和表
达载体。原核表达的宿主菌类型主要包括大肠杆菌
表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝
藻表达系统等。其中，大肠杆菌是目前应用最广泛
的基因表达系统，大肠杆菌 BL21 表达系统、大肠杆
菌 Xa90 表达系统、大肠杆菌 Rosetta 表达系统等则
更为常用。原核表达载体，表达载体在原核表达过
程中起着十分重要的作用，它直接关系到能否将目
的基因转入宿主菌中。原核表达常用的载体有 PET
系列、PGEX-KG系列［11］，其中应用更多的为 PET系
列表达载体。
原核表达还受到培养条件的重要影响，为了得
到最理想的靶蛋白，需要选用不同的温度和诱导物。
一般诱导蛋白表达的温度都控制在 20 ～37 ℃［12 － 14］。
选对合适的温度，可以获得最多的目的蛋白。对原核
表达的诱导可以用温度诱导和药物诱导，一般利用药
物(如 IPTG)诱导较多。
本试验选取不同的原核表达系统及表达载体，
通过反复试验，获得了 AtSTK基因表达的最佳体系。
试验结果表明，大肠杆菌 Rosetta 菌和 PET-32a 可以
更好地表达出目的蛋白。IPTG(异丙基硫代 β-D-半
乳糖苷)作为一种强诱导剂，不被细菌代谢，且性质
稳定，在具有 lac 或 tac 等启动子的表达载体中，运
用合适的浓度，可以诱导目的蛋白的表达。因此，本
试验也选用了 IPTG 作为基因表达诱导物。试验中
通过对原核表达条件进行优化，结果表明，在 0． 5 ～
1． 0 mmol /L IPTG 的浓度范围内，细菌表达的蛋白
量逐渐增多，当 IPTG 浓度为 1． 0 mmol /L 时，AtSTK
蛋白的表达量达到最高，再进一步提高 IPTG 浓度，
其表达反而受到抑制。胡晓梅等［15］在其文章中也
提到 IPTG浓度过高，会抑制细菌生长，降低目标蛋
白的表达率。当诱导时间达到 4 h，其表达量最高，
诱导 5 h的表达量和诱导 4 h基本一致，表明诱导时
间也并非越长越好。
大肠杆菌在进行高效表达外源重组蛋白时，大
量表达的目的蛋白往往在细胞内凝集形成不溶的、
无活性的包含体固体颗粒。包含体利用变性剂如尿
素、盐酸胍等处理后，其内含的目的蛋白才能被释放
出来。但变性溶解获得的包含体蛋白必须经过复性
处理才能使目的蛋白恢复生物活性。复性操作可以
2 期 胡京蕊等: 拟南芥耐盐相关基因 AtSTK原核表达载体的构建及表达 41
采用逐步稀释法、透析复性法、超滤复性法和层析柱
复性等［16 － 20］，主要是促使目标蛋白从变性的完全伸
展状态恢复到具有生物活性的立体构象。复性处理
是一个非常复杂的生化反应过程，只有选择合理的
方法，控制适宜的条件，才能提高蛋白的复性效率。
本研究采用的是透析复性法，将变性溶解的包含体
蛋白溶液置于透析袋内，逐渐降低外透液的浓度，使
蛋白缓慢地恢复生物活性，经检测目的蛋白获得了
较好的复性。
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