全 文 ：农业生物技术学报 !#$%&’()(*+$,-#’.#$&’(/,.0-1%’+2((((34435647(839:((((6;;<6;=((
>基金项目：国家高技术研究发展计划（?@A计划）资助项目（3446BB3633A6）。
马 宏：女，6C=D 年生5博士研究生。
>> 联系作者。E%%0-.0$F7GHI&,’:〈2&%+12JK#%F,IF&-F-%〉F
77777收稿日期：3446H4;H6@
·研究论文·
拟南芥花药特异启动子启动的 /&$%&K0基因在烟草中的表达 >
马 宏 王寰宇 刘玉乐 杨怀义 >>
L中国科学院微生物研究所，北京 6444?49
摘要:为探明植物基因工程雄性不育温度敏感性的影响因子，以拟南芥8B$&M,NOK,K .1&’,&%&79QR生态型基因组 STB 为模
板，UEV 扩增后分别得到 4F=?7WM 的 B@ 和 4FA7WM 的 BC 基因 DX 旁侧区 STB 片段。将其分别与核糖核酸酶/&$%&K07基因融合，
导入含有抗溴苯腈8/Y%9基因的植物双元表达载体构建成 OQUB@T 和 OQUBCT，并经根癌农杆菌（B+$M&-.$,#I .#I0)&-,0%K）
Z/B;;4; 介导获得转基因植株。生物学观察表明，转基因植株表现出了明显的雄性不育性状，如花丝变短、花药瘦小等，说明
B@、BC 两 D!启动子片段都在烟草（T,-.,&%& .&M&-#I）花药中定位启动了 /&$%&K0 的表达，另经高温敏感性测试均可见育性恢
复现象，这初步表明雄性不育植株的高温不稳定性由启动子造成的可能性较小。
关键词! 拟南芥；花药特异启动子；雄性不育
GYO$0KK,%+7)7/&$%&K077[0%07,%7\&M&--7#%N0$7.107E%.$’7)7B$&M,NOK,K7
B%.10$HKO0-,),-7U$I.0$K7
]&7^%+PPPPQ&%+P^#&%2#PPPPZ,#P_#’0PPPP_&%+P^#&,2,>>P
L‘%K.,.#.0P)P],-$M,’+2，E1,%0K0PB-&N0I2P)PR-,0%-0K，/0,a,%+P6444?45PE1,%&9
\10P D! Hb\VP )P &%.10$HKO0-,),-P B@P &%NP BCP +0%0KP c0$0P M.&,%0NP )$IP +0%I,-P STBP ) B$&M,NOK,K .1&’,&%&PQRP
0-.2O0P M2P UEVF\10P K0d#0%-0P &%&’2K,KP ,%N,-&.0NP .1&.P .10P )$I0$P c&KP 4F=?P WMP &%NP .10P ’&..0$P c&KP 4FAP WMF\10P B@H/&$%&K0P &%NP
BCH/&$%&K0P -1,I0$,-P +0%0KP c0$0P -%K.$#-.0NP &%NP .$&%K)$I0NP ,%.P .10P +0%I0KP )P .M&--P LT,-.,&%& .&M&-#I 9“TE?C”&%NP
“eA3@”O’&%.KPf,&PB+$M&-.$,#I .#I0)&-,0%KPK.$&,%PZ/B;;4;FP \10P.$&%K+0%,-PO’&%.KPc0$0P&%&’2g0NPc,.1PO’2I0$&K0P-1&,%P$0&-.,%5P
R#.10$%PM’..,%+P&%NPM$IY2%,’P$0K,K.&%-0P0YO0$,I0%.FP \10P$0K#’.KPK1c0NP/&$%&K0P+0%0P’,%W0NPc,.1PB@P$PBCPO$I.0$P1&NPM00%P
,%.0+$&.0NP ,%.P O’&%.P +0%I0KFP \4P +0%0$&.,%P )P .10P .$&%K+0%,-P O’&%.KP .0K.0NP #%N0$P ),0’NP -%N,.,%KP K1c0NP Mf,#KP I&’0HK.0$,’0P
-1&$&-.0$,K.,-KFP \1,KPK#++0K.0NP .1&.P .10P )$&+I0%.P)P .10PB@P$PBCPO$I.0$PK1c0NP&%.10$HKO0-,),-PO$I.0$P&-.,f,.2P ,%P .$&%K+0%,-P
.M&--P&%.10$FP^c0f0$5P.10P.0IO0$&.#$0PK0%K,.,f,.2Pc&KPK.,’’PMK0$f0NPMf,#K’2P,%P\6P.$&%K+0%,-PI&’0HK.0$,’0PO’&%.KF
PB$&M,NOK,K .1&’,&%&；&%.10$HKO0-,),-PO$I.0$；I&’0HK.0$,’0
作物杂种优势利用是大幅度提高作物产量和改
良作物品质的一条重要途径，而三系配套育种是实
现作物杂种优势、创造杂交种的重要手段。但实践中
由于一些作物缺乏理想的天然不育系和恢复系，致
使杂种优势利用受到一定限制。自 ]&$,&%, 等h6i6CC4
年利用花药特异表达启动子表达核糖核酸酶 /&$H
%&K0 基因转化烟草获得人工创建雄性不育植株，又
于 6CC3 年获得了首例转基因雄性不育油菜及其恢
复系 h3i后，国内外一些实验室也先后在此方面进行
了研究 hA@i。随着作物育性基因工程研究的深入，
]&$.,%0 等h=i发现在实践中被广泛应用的由烟草花药
特异启动子 \B3C 和 VT&K0P\6 形成的嵌合基因在
高温下有育性恢复现象，李胜国等 h@i的研究也表明
由 \B3CH/&$%&K0 形成的嵌合基因获得的转基因烟
草也存在着类似现象。为探明植物基因工程雄性不
育温度敏感性的影响因子，本实验利用拟南芥中 3
个花药发育早期的特异启动子，缺失克隆构建了植
物雄性不育基因的表达载体，获得了转基因烟草并
初步进行了温度敏感性检测，为进一步研究不同启
动子及启动子活性对雄性不育嵌合基因温度敏感性
的影响奠定了基础。
##材料和方法
第 !!期 马 宏等：拟南芥花药特异启动子启动的 #$%#&’ 基因在烟草中的表达
#!!!!植物材料
用于启动子克隆的试材为拟南芥（($#)*+,-*&*&
/0#1*#%#）23 生态型，用于根癌农杆菌4(5$,)#6/$*7
89 /89’;#6*’%& < 介导遗传转化的烟草（=*6,/*#%#
/#)#689 <为“=>?@”。
$%&&&&’(、’) 启动子的克隆
根据 A*$+ 等 B?C，D#81 等 B@C报道的序列分别合成
了用于 D>E:扩增的 F对引物：
GH4I
GOPM
GSPR
GSPM
以 >LG 法BTUC制备的拟南芥植物总 V=G 为模
板，GH（R）、GH（M），G@（R）、G@（M）为引物，在 @W.
变性 R.9*%N.WX.退火 F.9*%N.YF.延伸 M.9*%，循
环 T 次；然后，@W变性 T.9*%.NRH.退火 T.9*%，YF.
延伸 F.9*%N循环 MU 次；最后，YF.延伸 TR.9*% 的
条件下进行了 D>E扩增。D>E产物回收后，克隆到
-KZ[.L7\’6/,$。
#* ’ (+, -./-01 和 ’ )+, -./-01 嵌合基因载体的
构建
根据 A#$/1’]BTTC报道的序列克隆到细胞毒素基
因，并构建成克隆载体 -KZ[^_7=。将 GH、G@ 两
启动子片段分别与从质粒 -KZ[^_7= 上切下的
#$%#&’基因串联，构成完整表达单元插入改造过的
含抗溴苯腈（‘%）基因的 -Eab!表达载体，得到
了分别由 GH、GS 特异启动子调控的雄性不育基因
#$%#&’ 的植物表达载体 -2DGH= 和 -2DGS=（图
T）。将两表达载体的质粒导入根癌农杆菌 cGWWUW
构成用于烟草遗传转化的工程菌。
图 Td:植物表达载体 -2DGH= 和 -2DG@= 的转化单元
e*5dTd:L0’:6,9-,&*/*,%:,;:/$#%&;,$9#/*,%:8%*/:,;:-2DG@=:
#%+:D2DGH=
$2&&&&烟草的遗传转化与再生
采用叶盘法转化烟草，剪取无菌的烟草叶片于
过夜培养继代后 aVfUdR 左右的工程菌液中侵染 R:
9*% 后，放入 =b （[3gUdF:95hc:=GGgFdU:95hc:
H7GgUdR:95hc:bL）固体培养基中在 FR#FX:条件
下暗培养 F#M:+，将外植体转移到添加 TUU:95hc:
b#%NRUU:95hc:>’; 的 =b 培养基上进行筛选培养，
以转化空载体 -Eab!的叶片外植体置于相同筛选
培养基中作对照。FU:+继代 T 次。抗性芽长至 F:69
时切下，转入生根培养基。最后将转基因烟草的组培
苗移入营养钵中，置于温室中培养。
$3&&&&转基因植物的 456 检测
据李胜国等 BHC报道的 #$%#&’ 序列设计了转基
因植物 D>E 检测引物
=PR
=PM
以 =PR<、=PM<为引物，转化植株的 V=G为模
板，进行 D>E 扩增。反应条件为 @W:变性 MU:&，RF:
退火 MU:&，^F:延伸 MU:&，循环 MU 次。
$(!!!!789:;1./!杂交
植物总 V=G经纯化后，分别用限制性内切酶 Z7
6, E酶切过夜，经 TdFi琼脂糖凝胶电泳后毛细法
转移尼龙膜上，按 E,60’公司 VjK.A*50.D$*9’.V=G.
c#)’1*%5.#%+.V’/’6/*,%.3/#$/’$.b*/!的详细说明，以
VjK标记的 #$%#&’基因片段为探针进行杂交。
$配制溴苯腈浓度分别为 TU7F.、TU7M.、TU7W 和 TU7R.
9,1hc 的乳浊液，用棉球涂抹在经分子鉴定阳性的
转化株和转化空载体的对照烟草叶片上，观察施用
后的效果。
$=!!!!育性检测
取花药刚裂开时的花朵，解剖剥离观察花器结
构和花药散粉量，并在显微镜下观察转基因植株的
花粉萌发情况，花粉萌发培养条件为：培养基含 M.
99,1hc.AMaM、TUk.蔗糖和 UdYk琼脂，-A 值为 RdX，
培养时间 W#R.0，培养温度 FW#FR.。
$)!!!!温度敏感性实验
取温室培养进入蕾期的 LT代转基因植株，将其
转入光照培养箱中，培养温度为 FX#MY.，光周期
为 TF.0，Y#TU.+ 后将苗取出，对经高温处理培养后
的花器官进行育性检测；温室条件下继续培养 R#Y.
+，再观察新形成的花器官的育性情况。
%!...结果和分析
%$!!!!’( >’) 启动子的克隆及序列分析
以 GHPR
农 业 生 物 技 术 学 报 !! 年
南芥基因组 #$% 中扩增到了 &’()*+ 和 &,)*+ 截
短的启动子片段，经序列分析表明这两段启动子片
段分别位于 %- .(/、%0 .0/ 目的基因转译起始点上游
!1!2!(()+3 和!0,2!,0,)+3 处，均包含完整的
4%5)6789、:%:%)+;<和 =%:%)+;<，其同源性与发表
序列分别为 00&0>和 00&’>（图 !）。
图 !&))%-、%0 启动子序列分析
?7@&!&)%ABCD676);E)8F9)69GH9AI9);E)%-)BAJ)%0)3K;L;89K
斜体阴影部分为差异碱基，其中 %-启动子的差异为 I,’!8,0M)%0
启动子的差异为 @!N!I!N。 :F9)78BC7I)BAJ)6FBJ;O)+B696)BK9)8F9)
J7EE9K9AI9)EK;L)8F9)K93;K89J)69GH9AI9)&:F9D)BK9)I,0!8,0)7A)%-)
3K;L;89K)BAJ)@!N!I!N)7A)%0))3K;L;89K&
!!####转基因烟草的获得
转化后的 $4(0 叶片外植体筛选培养 !)J 即
分化出再生芽，而对照组在同样筛选条件下表现为
叶体变黄、叶边缘褐化、没有芽的分化，继续培养半
月后逐渐白化死亡。将转化再生芽转入生根培养基
后得到生长良好的转基因植株。经对获得的 3PQ
5%-$ 和 3P5%0$ 的转化再生株进行 RBKAB69)基因
的 54S 及 T;H8F9KA 检测U杂交片段约 1)*+ 大小VM共
获得了转 3P5%-$ 的烟草 1! 株，转 3P5%0$ 的烟
草 1W 株，其转化率分别达 ’!>和 -(>U图 ,M)BV。为
进一步证明目的基因已整合到烟草基因组中，利用
叶片涂抹法对与 RBKAB69 紧密连锁的 R达进行了检测。结果发现，转化株与对照株对溴苯腈
的敏感性有很大差异，转化株对溴苯腈的耐受力可
达到 1)LL;CXYM 而对照株 1!L;CXY 时就表现出叶
片萎蔫，继而枯死的症状（图 ,M)+）。通过 !#$%& 基
因分子检测和抗溴苯腈检测表明外源目的基因已整
合到烟草植物基因组中。
!$####%&、%’启动的 ()*+),-基因在花药中的特异表达
将转基因植株移至温室培养至开花，生物学性
状观察表明转目的基因的植株均表现出了明显的雄
性不育性状，即花药瘦小、花粉量少，花丝变短，雌蕊
柱头明显高于雄蕊’ 而其它性状却表现正常 (图 WM)
%V。花粉萌发实验也表明雄性不育烟草花粉萌发率
低，甚至不萌发，而对照株花粉萌发正常，花粉管发
育良好（图 WM)R）。
经人工辅助自交后发现，不育植株果实空瘪，无
正常种子形成，而对照植株则发育正常，对 : 代不
育植株人工授粉，可获得发育良好的 :1代植株。这
表明 %-、%0 启动子只在花药中启动了 RBKAB69 的
表达，造成转基因植株的雄性不育，而在雌蕊及其它
组织中无表达活性或活性很低。
图 ,&)转基因植物的检测
?7@&,&%ABCD676);E)8KBA6@9A7I)8;+BII;
%M)T;H8F9KA 杂交结果。1M)3P5%-$ 质粒的 ZI;)S酶切结
果；!2N，利用 3P5%-$ 或 3P5%0$载体获得的转基因烟草
基因组 #$% ZI;)S酶切结果；-，对照。R抗溴苯腈检测。
%M)T;H8F9KA)+C;887A@&1MZI;)S[X8F9)3CB6L7J);E)3P5%-$\))!2NM)
ZI;)SX)@9A;L9)#$%)7A)8KBA6@9A7I)8;+BII;)O78F)3P5%-$)
;K)3P5%0$\)-M4;A8K;C)8;+BI;;&)RM)S968BA8)8;)+K;L;
在正常温室条件下，%-、%0QRBKAB69 嵌合基因
的 :1 代转基因植株U各 - 株V都表现出了明显而稳
定的雄性不育性状，而经高温处理后发现了育性恢
复现象，其花丝延长至与雌蕊等高，花药形态饱满，
花粉萌发正常。而未经高温处理的转基因植株不育
1W-
第 !!期 马 宏等：拟南芥花药特异启动子启动的 #$%#&’ 基因在烟草中的表达
性状稳定，当温度恢复正常后又表现出了典型的雄
性不育性状。这初步说明 ()*#$%#&’和 +,*#$%#&’
嵌合基因的表达受到高温的影响。
图 -.//转基因烟草的生物学特征
012.-./34’/51676218#7/84#$#89’$&/6:/9$#%&2’%18/;7#%9&
+，花器特征；，花粉萌发状况。#<可育花粉；5<不育花
粉。+’$/#;;#$#9?&/@/;677’%/2’$B1%#916%/.//#////讨 论
拟南芥 +)、+,基因为花药早期表达基因，定位
表达于花药绒毡层细胞，自小孢子母细胞减数分裂
完成时开始，到四分体解离时结束。本实验克隆的
+)、+, 基因转录起始点上游各 DEF/5; 和 GFF/5; 的
启动子片段，经形成 +)*#$%#&’、+,*#$%#&’ 的嵌
合基因整合进烟草基因组，分别启动了细胞毒素基
因在花药绒毡层细胞中的表达，破坏了在正常花粉
发育过程中绒毡层细胞对小孢子形成及发育的营养
供给功能，最终导致小孢子发育不良，花粉败育，而
转基因植株其它生物学性状发育正常，+)、+, 启动
子成功地完成了花药特异表达外源细胞毒素基因的
功能，获得了雄性不育性状稳定的转基因植株。这与
H1$I 等JEK和 L#?7 等J,K分别用 2?& 基因对 +)、+, 启动
子功能研究的结果相一致。
用正常可育花粉与转基因雄性不育植株杂交，
对其 3M代不育植株高温敏感性初步测试发现，转基
因雄性不育植株存在着受高温影响育性恢复现象，
即在高温生长条件下，花丝延长生长至与雌蕊等高，
花药发育良好，显微观察可见有可育花粉的萌发。这
与 N#$91%’ 等JDK，李胜国等 J)K研究 3+O,*#$%#&’ 嵌合
基因表达也存在着温度敏感性的结果相一致。由此
可见，由 3+!,*#$%#&’ 嵌合基因引起的转基因植物
雄性不育性状受高温影响育性恢复现象受启动子影
响的可能性较少，还存在着较为复杂的影响因子如
花粉形成过程中存在的热激蛋白等JM!K，这有待进一
步探讨。
致谢P// 中国科学院微生物研究所分子病毒学和生物工
程实验室< 中国科学院院士田波院士对本论文的完成给予了
很多指导和帮助<在此谨致谢意。
参 考 文 献
M//N#$1#%1/=B#7’/&9’$1719T/1%/;7#%9&/5T/#/841B#’$18/$156%?87’#&’/2’%’./U#*
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;7#%9&.U#9?$’G//罗玉英<刘玉乐 <李胜国 <等.3+O,*#$%#&’ 嵌合基因导入对
烟草花药绒毡层及花粉发育的影响 .植物学报 E,-!E,E
-//钟蓉<刘玉乐<朱峰<等./3+O,*5#$%#&’ 介导的转基因油菜的
获得./植物学报X///彭仁旺<周雪荣<王峻岭<等.表达 #$&9#$ 基因及 5#$ 基因的
转基因油菜的研究./遗传学报)//李胜国度敏感性.植物学报D//N#$91%’/Y’%1&’%21%’’$’I/%?87’#$/&9’$1719T/1%/$#&&18# %#;?&. /L7#%9/L4T&167<
M,,GE//H1$I/Y/\<]6$$#77/Y9’1%/’%86I’I/5T/94’/$#&&18# %#;?&/#%I/+$#51I6;&1& 94#71#%#
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415196$/;’$B19&/’[;$’&&16%/6:/#/876%’I/$156%?87’#&’./R/N67/1*
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