全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第4期，第770-774页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.4,770-774
新基因、新品质、新品种
NewGene&Germplasm
拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定
伍祚斌 孙雪飘 汪萌 谭德冠 张家明 *
中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101
*通讯作者,jmzhang@vip.163.com
摘 要 芥子酶是一类水解硫代葡萄糖苷的酶，广泛存在于十字花科植物中。人们在拟南芥中已经发现了3
个芥子酶基因，分别是TGG1、TGG2和TGG3。通过对拟南芥基因组数据库的搜索，发现3个新的芥子酶基因
TGG4、TGG5和 TGG6。本研究克隆了 TGG4基因全长 cDNA序列，构建酵母表达载体，转化毕氏酵母
GS115，进行甲醇诱导表达，重组蛋白用离子交换层析柱纯化。纯化的重组蛋白经测定具有芥子酶活性，而且
其活性被低浓度的维生素C激活，具有芥子酶的典型特征。芥子酶系统发生树分析进一步表明，TGG4代表
一个芥子酶基因新亚家族。
关键词 拟南芥,芥子酶,TGG4,酶活性
Cloning,ExpressionofMyrosinaseGeneTGG4inArabidopsisthalianaand
ConfirmationofMyrosinaseActivity
WuZuobin SunXuepiao WangMeng TanDeguan ZhangJiaming*
InstituteofTropicalBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou,571101
*Corespondingauthor,jmzhang@vip.163.com
Abstract MyrosinaseisafamilyofS-glucosidase,whichareusualypresentincruciferousplants.Threemyrosi-
nasegenes,TGG1,TGG2andTGG3,havepreviouslybeenreportedinArabidopsisthaliana.Similaritysearches
wereperformedagainsttheArabidopsisgenomesequencedatabases,threeadditionalmyrosinasegeneswere
found,denotedasTGG4,TGG5andTGG6.ThecDNAsequenceofTGG4wascloned,andthepichiaexpression
vectorwasconstructed,thentransformationofpichiaGS115wasmade.Expressionofrecombinantpichiastrains
wasinducedbymethanol,theHis-taggedrecombinantproteinofTGG4waspurifiedwithionexchangechro-
matographycolumns.Myrosinasesactivityofthepurifiedproteinwasdetected.Moreover,myrosinaseactivity
wasactivatedbylowconcentrationofascorbicacid,whichwasthetypicalcharacteristicofmyrosinase.Phyloge-
neticanalysisshowedthatTGG4representanovelmyrosinasegenesubfamily.
Keywords Arabidopsisthaliana,Myrosinase,TGG4,Myrosinaseactivity
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30571064)资助
芥子酶(myrosinase,EC3.2.3.1)又称 β-硫代葡
萄糖苷酶，催化硫代葡萄糖苷水解，产生D-葡萄糖、
硫酸盐以及一系列有生物活性的水解产物，如异硫
氰酸酯(李鲜等,2006)。其中一些有毒性的水解产物
在十字花科植物的保护机制中起着重要作用。芥子
酶是一种比较稳定的酶，与其底物硫代葡萄糖苷分
别储存在植株不同的细胞中(Kelyetal.,1998)。当细
胞受损伤时，芥子酶与其底物聚集到一起发生反应，
产生有毒物质，防御有害生物的侵袭。人们将其形象
地比喻为“芥子炸弹”。
芥子酶是一个数量庞大的蛋白质家族。油菜
(B.napus)中就约有25~30个芥子酶基因，这些基因
被分为3个亚家族，分别是MA、MB、MC(Xueetal.,
1992;Thangstadetal.,1993;Rasketal.,2000)。芥子
酶不仅在十字花科等植物中广泛存在，在植物以外
的一些生物中也能检测到芥子酶活性，如某些昆虫、
真菌和细菌，说明芥子酶活性物质在自然界中是广
泛存在的。自然界还存在一种与芥子酶相似的生氰
葡萄糖苷酶，其在自然界的存在比芥子酶系统更为
广泛，且进化更早(Soupe,1981)。不过，生氰葡萄糖苷
酶只能降解β-O-葡萄糖苷。人们推测“芥子炸弹”
系统可能起源于生氰葡萄糖苷系统。理由是硫代葡
萄糖苷与生氰葡萄糖苷不管是在结构还是生物合成
方面都有比较高的相似性，且芥子酶与生氰葡萄糖
苷酶在一级、二级乃至四级结构上都有较高的相似
性(汪萌等,2007)。
据前人的研究，已发现3个拟南芥芥子酶基因，
分别是TGG1、TGG2和TGG3(Xueetal.,1995)。而
TGG3是一个在花中表达的假基因(Zhangetal.,2002)。
值得注意的是，已发表的3个芥子酶基因都是通过
Southern杂交筛选基因文库而获得的。研究表明
(Rasketal.,2000)，TGG1、TGG2在拟南芥子叶、茎、
叶片和花中表达。 而人们在拟南芥的根和种子中
发现有芥子酶的底物硫代葡萄糖苷存在，于是人们
推测还有新的芥子酶没有被发现。张家明等通过搜
索拟南芥基因组序列数据库，发现了TGG4、TGG5和
TGG6基因，其编码产物与芥子酶的某些片段相似(汪
萌等,2007)。本研究克隆了TGG4基因cDNA编码序
列全长，构建酵母表达载体，转化毕氏酵母，初步研究
了重组蛋白的酶学特性。
1材料与方法
1.1数据库搜索及序列分析
以芥子酶基因TGG1(GenBank登录号:AT5G2
6000)和 TGG2 (GenBank登录号:AT5G25980)的
cDNA序列为搜索探针，用BLASTn搜索GenBank数
据库中的拟南芥基因组序列数据库。挑选具有一定
同源性的序列翻译为蛋白质，以芥子酶的保守特性
进行检验。用系统发生分析法分析编码植物糖苷酶
的cDNA序列。这些序列用ClustalW进行比对，系
统发生树则是用MEGA2制作。
1.2植物材料
材料中拟南芥的生态型Col-0来自Notingham
ArabidopsisStockCentre(NASC)，种子播种在标准营
养土中，放置培养室培养，培养室温度是20℃，空气
相对湿度为80%，光照时间为16h/d，光照强度是
200μmol·m-2·s-1。毕氏酵母GS115由本课题组保存。
根取自生长2周的植株，子叶取自生长1周的植株，
叶子取自生长2~5周的植株，而花和荚果则是取自
生长4~5周的植株。
1.3拟南芥mRNA提取、RT-PCR及TGG4基因克隆
采用3STrizolTotalRNAisolationreagents(申
能博彩生物科技有限公司)提取拟南芥各部位总
RNA。经OligotexDirectmRNApurificationkit(Qia-
genGmbH,Hilden,Germany)纯化后，获得mRNA。用
MoloneyMurineLeukemiaVirus(M-MuLV)reverse
transcriptase(大连宝生物公司)合成第一链cDNA。根
据从拟南芥基因组数据库中搜索所得的TGG4序列
(At1g47600)设计 TGG4基因特异引物。以第一链
cDNA为摸板，采用基因特异引物5ATCACCAAA
AGAAGCACA3(位于TGG45编码区外)和 5
CATATACAAAACACATAAGGTC3(位于
TGG43编码区外)扩增TGG4基因的编码区全长。
PCR产物经 QiagenPCRpurificationkit(Qiagen
GmbH,Hilden,Germany)纯化，克隆至 pMD19-T载
体(大连宝生物公司)。挑选片段大小与预期相符的克
隆寄往上海闪晶公司测序。
1.4TGG4基因酵母表达载体构建及转化
选择测序序列与拟南芥基因组数据库中一致的
克隆为模板，利用基因特异引物5GGGTGATCA
AACCATGGCAATTCCAAAAGC3(含BclI限
制性酶切位点)和5TAAACCTAGGGCTTCAAC
TTATTTTGCG3(含AvrI限制性酶切位点)，采用
PfuDNApolymerase(大连宝生物公司)扩增TGG4
基因编码区。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃
退火30s，72℃延伸3.5min，30个循环。扩增产物
经 BclI和 AvrI酶切后，连接至载体 pPIC3.5 (经
BamHI和 AvrI酶切)，电击转化 E.coli，提取质粒，
经BclI和AvrI酶切鉴定后，测序。选择序列完全正
确的克隆提取质粒，用SalI酶切线形化，电击(电压
1.5kV,电阻 200Ω,电容 25μF)转化毕氏酵母
GS115(Invitrogen)，按Invitrogen的PichiaExpression
Kit手册进行筛选培养。
1.5重组TGG4蛋白纯化
挑取阳性克隆，经甲醇诱导5d后，离心收集酵
母菌体后用裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl,pH7.5,
1mmol/LPMSF,1mmol/LBenzamidine)将菌体重
悬。酵母细胞经弗氏压碎器 (Aminco,SLMinstru-
ments,Inc.)破碎后离心，收集上清，用0.45μm过滤膜
过滤，收集滤液，过柱。柱子是经缓冲液(20mmol/L
Tris-HCl,pH7.5)平衡的FPLCMonoQ阴离子交换
层析柱(pharmacia)。然后增加NaCl浓度将目的蛋白
拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定
Cloning,ExpressionofMyrosinaseGeneTGG4inArabidopsisthalianaandConfirmationofMyrosinaseActivity
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
洗脱，收集洗脱液，检测其芥子酶活性。将具有芥子
酶活性的组分用MonoS阳离子交换层析柱进一步
分离纯化。洗脱液经芥子酶活性检测后进行 10%
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳以检测其纯度。
1.6芥子酶活性分析
芥子酶活性测定的方法是通过检测芥子酶水解
sinigrin(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MA,USA)所
释放的葡萄糖的量来确定芥子酶的活性。芥子酶活
性测定的反应体系是：10μLNa-Citrate(100mmol/L,
pH4.5)，2μLsinigrin(100mmol/L)，2μLmyrosinase
solution，2μLascorbate(3mmol/L)，蒸馏水定容至
20μL。混匀后置37℃反应30m，95℃灭活5min。加
入葡萄糖测定试剂(Randox)37℃反应15min，用分
光光度计测定 550nm消光值。根据测定结果按
Randox试剂的使用方法计算芥子酶活性。
2结果与分析
2.1拟南芥新型芥子酶基因的发现
人们在研究中检测到拟南芥的根部具有芥子酶
活性，而已发现的3个芥子酶基因TGG1、TGG2和
TGG3均不在根部表达，因此推测还有芥子酶基因未
被发现。通过对拟南芥基因组数据库的搜索，发现了
编码产物与芥子酶相似的 3个基因 AT1G47600、
AT1G51470和 AT1G51490，并依次将其命名为
TGG4、TGG5和TGG6。3个基因都在第一条染色体
上，呈紧密连锁。而已知的3个芥子酶基因都在第五
条染色体。在蛋白质水平上，TGG4与TGG5有97%
的相似性，只有12个氨基酸残基不同，而在DNA水
平上则有着98%的相似性。TGG6则可能是一个假基
因(汪萌等,2007)。所有芥子酶在187位(以S.alba结
晶芥子酶为参照)都是谷氨酰胺，这也是S-葡萄糖
苷酶与O-葡萄糖苷酶的区别之处。TGG4与TGG5
所编码的蛋白质也具有这一特征。
2.2TGG4基因cDNA的克隆
根据数据库中的序列设计基因特异引物，扩增
TGG4基因的全长编码区，克隆至载体pMD19-T后，
挑选与预期相符的克隆测序，筛选与数据库序列一
致的克隆进入下一步研究。所克隆序列在5端非翻
译区有37bp，而在3端非翻译区有38bp，编码511
个氨基酸残基的蛋白质。TGG4基因与已发现的3个
芥子酶基因有所不同，已发现的3个芥子酶基因有
12个外显子和 11个内含子，而基因 TGG4在与
TGG1第5个外显子对应处插入一个内含子，变成了
13个外显子和12个内含子(图1)。
图1TGG4与TGG1、TGG2及TGG3的基因结构比较
注:相对于已知的3个芥子酶基因TGG1、TGG2及TGG3的外
显子5,TGG4的外显子5和外显子6是被一个内含子分隔而
得到的
Figure1OrganisationofTGG4genecomparedtoTGG1,TGG2
andTGG3
Note:Comparedtotheexon5ofthethreeknownmyrosinase
genesTGG1,TGG2andTGG3,theexon5andexon6ofTGG4,
camefromthesplitingofexon5byashortintron
2.3TGG4基因在根部特异表达
通过RT-RCR检测，发现TGG4只在拟南芥根
部有特异表达，在拟南芥的子叶、茎、叶、花、荚果中
都没检测到TGG4的表达，而TGG1及TGG2基因则
相反，在子叶、茎、叶、花、荚果中表达，而不在根部表
达(图2)。TGG4的发现正好解释了拟南芥根部芥子
酶活性的来源。
图2拟南芥3个芥子酶基因的组织特异表达(RT-PCR结果)
注:Actin:对照
Figure2Tissuespecificexpressionof3myrosinasegenesof
Arabidopsis(RT-PCRresults)
Note:Actin:Control
2.4TGG4重组蛋白的芥子酶活性鉴定
用毕氏酵母表达的重组蛋白经测定具有芥子酶
活性。植物芥子酶的一个显著特征就是低浓度的抗
坏血酸能提高芥子酶的活性。重组TGG4蛋白的芥
子酶活性实验结果表明抗坏血酸对TGG4的芥子酶
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拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定
Cloning,ExpressionofMyrosinaseGeneTGG4inArabidopsisthalianaandConfirmationofMyrosinaseActivity
活性有显著影响，低浓度的抗坏血酸能提高重组
TGG4蛋白的芥子酶活性。0.1mmol/L的抗坏血酸能
将TGG4的芥子酶活性提高3倍，当抗坏血酸的浓
度为0.5mmol/L时，TGG4的芥子酶活性达到最高，
当抗坏血酸高于此浓度时，TGG4的芥子酶活性就下
降，当抗坏血酸浓度超过10mmol/L时，重组TGG4
蛋白的芥子酶活性几乎被完全抑制(图3)。
图3各种抗坏血酸浓度(0~10mmol/L)对重组TGG4蛋白芥子
酶活性的影响
Figure3RecombinantTGG4proteinwasincubatedinvarious
ascorbateconcentrations (0~10mmol/L)andtheactivitywas
examined
3讨论
本研究结果显示，拟南芥TGG4所编码的的蛋
白质具有芥子酶活性功能，而且活性被低浓度抗坏
血酸激活，被高浓度的抗坏血酸抑制，具有植物芥子
酶的活性特点。
准确地说，TGG4在没有抗坏血酸的情况下其芥
子酶活性是比较低的。因此它需要抗坏血酸的存在
才能提高其活性。因此当植物遭受攻击，植物中的抗
坏血酸的量及其分布的位置对植物的芥子酶活性的
影响甚是关键。
与已发现的芥子酶相比，TGG4、TGG5和 TGG6
基因有着许多不同的特征。以前报道的芥子酶基因
都由12个外显子组成，而TGG4等具有13个外显
子。虽然基因序列的某些区域对芥子酶来说是很保
守的，但TGG4、TGG5和TGG6基因序列与其它芥子
酶基因序列的同源性低于60%。在已发现的芥子酶
之间，序列间的同源性都在70%~80%。拟南芥中已
发现的3个芥子酶基因 TGG1、TGG2和 TGG3(Xue
etal.,1995)，其同源性都在70%以上。因此可以用已
发现的芥子酶基因序列做探针，通过Southern杂交
获得TGG1、TGG2和TGG3。而TGG4、TGG5和TGG6
与TGG1、TGG2和TGG3的同源性只有50%，所以
用Southern杂交的方法不能获得。基因搜索结果表
明TGG4(AT1G47600)、TGG5(AT1G51470)和 TGG6
(AT1G51490)区别于已发现的拟南芥介子酶基因。此
外，TGG4基因还包含着一个与其他已发现的芥子酶
不一样的GC5供体剪接位点，已发现的芥子酶的
GC5供体剪接位点都在第1个内含子，而TGG4则
是在第10个内含子。
分子进化研究表明，TGG4、TGG5和TGG6基因
属于芥子酶的一个新分支(图4)。因此，TGG4代表芥
子酶基因的一个新家族。
图4植物糖苷酶的分子进化分析
注:Ar:辣根;At:拟南芥;Bb:甘蓝;bG:O-β葡萄糖苷酶;Bj:
芥菜;Bn:甘蓝型油菜;Me:木薯;MYR:黑芥子酶;Os:水稻;
Rs:萝卜;Sa:白芥;Sb:高粱;Tr:三叶草
Figure4Phylogeneticanalysisofplantglycosidases
Note:Ar:Armoraciarusticana;At:Arabidopsisthaliana;Bb:
Brevicoryne brassicae;bG:O-β-glucosidase;Bj:Brassica
juncea;Bn:Brassicanapus;Me:Manihotesculenta;MYR:My-
rosinase;Os:Oryzasativa;Rs:Raphanussativus;Sa:Sinapisal-
ba;Sb:Sorghumbicolor;Tr:Trifoliumrepens
研究表明(Petersenetal.,2002)，在拟南芥的根部
有芥子酶底物硫代葡萄糖苷存在，这意味在根部存
在着一个有功能的芥子酶系统。而TGG1、TGG2和
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
TGG3都不在根部表达。我们的研究证明了TGG4在
拟南芥的根部转录，这可以解释在根部检测到芥子
酶活性的疑问(Andréassonetal.,2001)。有研究发现
拟南芥植株硫代葡萄糖苷的水平与外界压迫及激
素水平有关(Mikkelsenetal.,2003)。硫代葡萄糖苷
的成分随着植株的老化也会发生变化(Petersenetal.,
2002)。因此，芥子酶的活性也会随着植株的生长和外
界压迫的变化而改变。
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