全 文 ：２０１６年７月 四川大学学报（自然科学版） Ｊｕｌ．２０１６
第５３卷　第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５３　Ｎｏ．４
收稿日期：２０１５－０３－０６
基金项目：国家自然科学基金（３１１７１５８６）；９７３计划（２０１５ＣＢ７５５７００）．
作者简介：杨皓（１９９１－），男，甘肃白银人，硕士研究生，研究方向为植物遗传与分子生物学．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１６．０７．０４０
拟南芥ＡｔＨＨＲ２基因的功能初步研究
杨　皓，刘志斌，李旭锋，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：为了研究拟南芥 Ｈｉｇｈｌｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　２基因（Ａｔ５ｇ４３２００）在盐胁迫逆
境的功能，通过ＤＮＡ及ＲＮＡ水平鉴定了该基因的Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ａｔｈｈｒ２，并通过根瘤
农杆菌介导法进行遗传转化，筛选获得了ａｔｈｈｒ２／ＡＴＨＨＲ２互补转基因株系．对突变体、互补
转基因株系及野生型进行盐胁迫处理，对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测，发现盐处
理后缺失突变体的萌发率降低，脯氨酸和叶绿素含量低于野生型，互补株系的萌发率、脯氨酸
和叶绿素含量均高于野生型．以上结果证明ＡｔＨＨＲ２基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控
作用．
关键词：ＡｔＨＨＲ２；ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３连接酶；盐胁迫；拟南芥
中图分类号：Ｑ７８；Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１６）０４－０９４５－０７
Ｐｒｉｍａｒｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ２ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＹＡＮＧＨａｏ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎ，ＬＩ　Ｘｕ－Ｆｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＭＯＥ，
Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｆｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ＲＩＮＧ　ｄｏｍａｉｎ　２（Ａｔ５ｇ４３２００）ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ　ａｔｈｈｒ２ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　３ｈｏｍｏｚｕｇｏｕｓ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｌｉｎｅｓ　ａｔｈｈｒ２／ＡＴＨＨＲ２ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔｓ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ａｌ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐｒｏｌｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｐｒｏｌｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｒｅ
ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ａｎｄ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ａｒｅ　ａｌ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－
ｔｙｐｅ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＨＨＲ２ｇｅｎｅ　ｐｌａｙｅｄ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－
ａｎａ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＡｔＨＨＲ２；ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ；ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
１　引　言
植物生长过程中的非生物胁迫通常包括盐碱、
水缺乏、冷、热、重金属等．其中盐胁迫是在世界范
围内广泛分布，危害较大的一类胁迫．也是当前植
物科学研究中的热点领域．植物体为应对多变的外
界环境，会通过生理上的一系列调节途径以响应这
些胁迫，增强自身的逆境耐受性［１］．
泛素化途径属于蛋白翻译后修饰途径，也是植
物在该水平上重要的一类抗逆调控机制［２］．泛素是
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
一类真核生物广泛具有、保守性较高的蛋白，泛素
在３种酶的先后作用下完成泛素化过程，分别是泛
素激活酶Ｅ１（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ），泛素
结合酶Ｅ２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）和泛素
连接酶Ｅ３（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）［３］．泛素分
子与Ｅ１相互作用被激活，并被传递到一系列Ｅ２
上，再通过具有特异性的Ｅ３转移至底物蛋白上．
Ｅ３连接酶可对底物蛋白进行特异性选择，在泛素
化过程中起决定性作用．一些Ｅ３泛素连接酶含有
ＲＩＮＧ（Ｒｅａｌｙ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅ）ｆｉｎｇｅｒ结构
域，该类蛋白可分为 Ｃ３Ｈ２Ｃ３和 Ｃ３ＨＣ４两个亚
型，包含有１个锌指结构［４，５］．研究证实Ｅ３连接酶
对植物的非生物胁迫响应有重要的意义，其中包括
冷，盐和干旱等多种胁迫［６］．ＡｔＨＨＲ２ 基因是
Ｃ３ＨＣ４型ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ家族蛋白，与 ＨＨＲ１基因
高度同源，具有１个ＲＩＮＧ结构，具有体外Ｅ３连
接酶活性；在盐胁迫条件下该基因表达量有所升
高［７］．推测该基因可能在盐胁迫相关过程中起作
用．
盐胁迫条件下，植物细胞的损害来自离子胁迫
和渗透胁迫两个方面．植物通过积累体内脯氨酸的
含量以适应高盐环境造成的胁迫．脯氨酸是渗透调
节剂，累积脯氨酸可增大细胞质浓度，维持细胞的
渗透平衡．脯氨酸亦有清除胞内自由基的功能，可
部分消除高 Ｎａ＋离子浓度引起的损伤［８］．植物细
胞内的叶绿素在盐胁迫下会受到破坏，在高盐环境
下，脯氨酸和叶绿素含量的变化是衡量植物耐盐性
的重要指标．
本研究以拟南芥突变体ａｔｈｈｒ２为材料，对突变
体进行筛选获得纯合突变体，并对突变体进行遗传
转化获得了３个独立的ａｔｈｈｒ２／ＡＴＨＨＲ２互补株系
Ｃ１－３，Ｃ１１－６和Ｃ１９－４，同时检测了盐胁迫下突变体、
互补株系与野生型的萌发率情况和生理指标变化，
对ＡｔＨＨＲ２基因在盐胁迫响应中的作用进行初步
探索，为进一步解释该基因的功能提供理论依据．
２　材料与方法
２．１　材　料
野生型拟南芥 （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）哥伦比
亚生态型（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）植株由本实验室保存，ＨＨＲ２
基因Ｔ－ＤＮＡ插入突变体ＳＡＬＫ＿１５０８６０种子购买
于ＡＢＲＣ，突变体的背景为Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型．大肠
杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株 ＤＨ５α、根瘤农杆菌
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株 ＥＨＡ１０５ 及
ｐＺＨ０１载体由本实验室保存．
多种限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ及Ｐｒｉｍｅ
Ｓｃｒｉｐｔ　ＴＭＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ反转
录试剂盒购自ＴａＫａＲａ公司．质粒提取试剂盒购自
Ｏｍｅｇａ公司，ＲＮＡ提取试剂盒，ＤＮＡ胶回收试剂
盒购自天根公司，ｑ－ＰＣＲ　ｍｉｘ－ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ购于
Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司．其余试剂为科龙国产分析纯．
表１　本文所用引物序列
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒｓ
引物用途 序列
ａｔｈｈｒ２突变体
ＰＣＲ鉴定
ＬＰ：５′－ＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＧ－３′
ＲＰ：５′－ＡＡＧＴＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧ－３′ＬＢ
１．３：５′－ＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＧＧＡＡＣ－３
ＨＨＲ２片段
ＰＣＲ扩增
Ｆ：５′－ＣＧＣ　ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＴＴ
ＣＡＡＡＣＴＣＧ－３′
Ｒ： ５′－ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＴＴ－
ＧＴＣＡＡＣＡＧＧ－３′
酶切位点为ＧＧＡＴＣＣ－ＢａｍＨⅠＣＴＣＧＡＧ－ＸｈｏⅠ
ＨＨＲ２ｑＲＴ－
ＰＣＲ
Ｆ：５′－ＡＴＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＧＴＣＧ－３′
Ｒ：５′－ＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴ－３
Ａｃｔｉｎ２－Ｆ：５′－ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＡ－
ＣＡ－３′
Ａｃｔｉｎ２－Ｒ：５′－ＣＧＡＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣ－３′
２．２　方　法
２．２．１　蛋白进化树构建　在ＴＡＩＲ拟南芥信息资
源数据库中查找拟南芥中与 ＡｔＨＨＲ２同源的
ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ家族蛋白的氨基酸序列，并分析其相
似性，于 ＭＥＧＡ５软件中使用Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ 进行氨基
酸序列比对，邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建蛋白
系统进化树．
２．２．２　纯合突变体的分子鉴定　使用ＣＴＡＢ法
提取植物叶片总ＤＮＡ，根据拟南芥突变体网站ｈｔ－
ｔｐ：ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ上相关Ｔ－ＤＮＡ插入位点信息
设计引物（所有引物序列见表１），以提取的野生型
ＤＮＡ为负对照，ＬＰ＋ＲＰ、ＬＢ１．３＋ＲＰ两种引物组
合进行ＰＣＲ，反应程序为：９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，
５９℃３５ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ．
按照ＴＩＡＮＧＥＮ　ＲＮＡ提取试剂盒说明提取
植物材料 ＲＮＡ，所提的 ＲＮＡ 按照 ＴＡＫＡＲＡ
Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＴＭＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ
反转录试剂盒说明反转录为ｃＤＮＡ，以野生型ｃＤ－
ＮＡ为负对照，内参基因Ａｃｔｉｎ２作为对照基因，引
物见表１进行ＰＣＲ反应，反应程序为：９４℃４ｍｉｎ；
９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３５ｓ，３０ 个 循 环；７２℃
１０ｍｉｎ．
６４９
第４期 　　 杨皓，等：拟南芥ＡｔＨＨＲ２基因的功能初步研究 　
２．２．３　植物过量表达载体的构建　依照ＴＩＡＮ－
ＧＥＮ　ＲＮＡ 提取试剂盒说明提取野生型植株
ＲＮＡ，按 ＴＡＫＡＲＡ　Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＴＭ ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ反转录试剂盒说明反转录
为ｃＤＮＡ，对其利用表１所示引物进行扩增，反应
程序为：９４℃ ４ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，５８℃３５ｓ，７２℃
５０ｓ，３０ 个循环，７２℃ １０ｍｉｎ．ＰＣＲ 产 物 依 照
ＴＩＡＮＧＥＮ胶回收试剂盒说明进行回收纯化．使用
ＸｈｏⅠ和ＢａｍＨⅠ将 ＨＨＲ２连接到载体ｐＺＨ０１
上，获得ｐＺＨ０１－ＡｔＨＨＲ２载体，转化至大肠杆菌
ＤＨ５α菌株，贮藏于－８０℃冰箱．
２．２．４　拟南芥的转化及阳性植株分子鉴定　利用
冻融法将ｐＺＨ０１－ＡｔＨＨＲ２载体转化 ＥＨＡ１０５
农杆菌，通过菌落ＰＣＲ鉴定出阳性克隆．利用花序
浸染法将转化农杆菌浸染突变体花序［１０］，收取的
种子经含有潮霉素的１／２ＭＳ培养基筛选Ｔ１，对阳
性苗提取ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定，并继续用潮霉素
１／２ＭＳ培养基筛选 Ｔ２及 Ｔ３代，获得纯合互补株
系．依照Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ｑ－ＰＣＲ　ｍｉｘ－ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ使用说
明，以所获得的ｃＤＮＡ为模板通过Ｂｉｏ－Ｒａｄ实时荧
光定量ＰＣＲ系统进行反应，定量内参用Ａｃｔｉｎ２使
用引物见表１，ｑ－ＰＣＲ实验程序：９５℃５ｍｉｎ；９５℃
１０ｓ，６０℃１０ｓ，７２℃２０ｓ，４０个循环．
２．２．５　盐处理下萌发率表型实验　将突变体、野
生型，及互补株系拟南芥种子经０．１％ＨｇＣｌ溶液
消毒后置于含１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培养基及
对照组１／２ＭＳ培养基中，每个株系点种约５０颗种
子，置于４℃冰箱春化２ｄ打破种子休眠，移入２２℃
长日照条件的组培室，４ｄ后对其萌发状况进行观
察，检测盐胁迫对以上株系种子萌发率的影响，重
复实验３次．
２．２．６　盐处理下脯氨酸与叶绿素含量的测定　将
突变体、野生型及互补株系拟南芥种子经 ＮａＣｌＯ
溶液消毒后置于１／２ＭＳ培养基中，竖直培养３周
后取幼苗移入含有０或１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的土中
培养１４天测定其脯氨酸含量、叶绿素含量．脯氨酸
含量测定采用茚三酮法；叶绿素含量测定采用
９５％乙醇提取法．每个株系取１０株进行测定，各项
测定重复３次，取结果平均值．
３　结果分析
３．１　ＡｔＨＨＲ２蛋白系统进化分析
拟南芥ＡｔＨＨＲ２基因位于拟南芥第５号染色
体上，利用 ＯＲＦｉｎｄｅｒ分析［９］，该基因包含１个完
整的阅读框，编码２０７个氨基酸，相对分子质量
２３．４２２ｋＤ．根据之前的研究，该基因是Ｃ３ＨＣ４型
ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ家族蛋白，具有１个ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ结
构［７］．本研究将该基因所编码蛋白的氨基酸序列与
拟南芥其他１４个 ＲＩＮＧ　Ｆｉｎｇｅｒ型蛋白的同源序
列进行比对，并建立系统进化树．如图１的聚类分
析结果显示，ＨＨＲ２与 ＨＨＲ１（Ａｔ２Ｇ２４４８０）及
Ａｔ３Ｇ２８６３０具有较高的同源性，与其他的同家族
蛋白亦具有一定的同源性，说明该蛋白序列与
ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ家族蛋白在结构上高度相似，可能有
相似或相关的功能．
图１　拟南芥ＡＴＨＨＲ２同源基因进化树
Ｆｉｇ．１　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡＴＨＨＲ２ｈｏｍｏ－
ｌｏｇｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
３．２　ａｔｈｈｒ２纯合突变体鉴定
ａｔｈｈｒ２突变体结构示意图见图２Ａ．为鉴定
ａｔｈｈｒ２纯合突变体，我们分别用ＬＰ＋ＲＰ，ＬＢ１．３
＋ＲＰ做引物对基因组ＤＮＡ进行扩增（如图２Ｂ），
野生型ＤＮＡ用ＬＰ＋ＲＰ引物扩增获得目的条带，
而用ＬＢ１．３＋ＲＰ扩增无条带；纯合突变体 ＤＮＡ
用ＬＰ＋ＲＰ引物扩增未获得目的条带，而用ＬＢ１．３
＋ＲＰ扩增有条带．
为进一步验证ａｔｈｈｒ２突变体的基因表达情
况，我们提取植株的 ＲＮＡ进行 ＲＴ－ＰＣＲ实验，
结果显示野生型中ＨＨＲ２基因正常表达，而在突
变体中检测不到目的基因的表达，说明Ｔ－ＤＮＡ的
插入成功抑制了该基因在植株内的表达．
３．３　ａｔｈｈｒ２／ＡｔＨＨＲ２互补株系的阳性植株鉴定
构建表达载体如图３Ａ所示．运用根瘤农杆菌
对突变体植株进行花序浸染，经潮霉素抗性筛选获
得２４株阳性苗．提取突变体和其中４个互补株系
Ｔ１代植株，１＃，６＃，１１＃，１９＃的基因组ＤＮＡ，进
行ＰＣＲ扩增，电泳结果如图３Ｂ显示，互补株系
７４９
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
Ａ
　　　　　　
Ｂ
图２　ａｔｈｈｒ２突变体的分子鉴定
Ａ．ａｔｈｈｒ２（ＳＡＬＫ＿１５０８６０）突变体 Ｔ－ＤＮＡ插入位置示意．
三角形示Ｔ－ＤＮＡ插入位置，黑色框为外显子．Ｂ．利用基因
组ＰＣＲ及反转录ＰＣＲ对野生型和突变体分别进行ＤＮＡ水
平与ＲＮＡ水平鉴定．
Ｆｉｇ．２　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｔｈｈｒ２ｍｕｔａｎｔ．
Ａ．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅａｔｈｈｒ２ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒ－
ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｔｒｉａｎｇｌｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ，ｄａｒｋ　ｂａｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｂ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｔｈｈｒ２ｐｌａｎｔｓ　ａｔ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ．
的阳性植株扩增均获得了６２４ｂｐ的单一条带，而
缺失突变体无条带．说明ＡｔＨＨＲ２基因在互补株
系中成功表达．
以野生型植株为对照，Ａｃｔｉｎ２为内参基因，对
互补株系进行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，结果如图３Ｃ显示
筛选出的三个 Ｔ３代互补株系Ｃ１－３，Ｃ１１－６，Ｃ１９－４
其ＡｔＨＨＲ２基因的表达量与野生型相比分别提高
至１２９，８７和３０３倍．ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ的结
果均说明所获得的互补株系中该基因能够表达，且
在一定程度上过量表达．
３．４　盐处理下的萌发率表型
野生型，突变体及三个互补转基因株系的种子
播于０及１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培养基上，对萌
发率进行了统计，观察盐胁迫下各个株系之间萌发
率的差异（如图４Ａ，Ｂ）．当种子于１／２ＭＳ培养基
上萌发时，各株系萌发率几乎相同，均为９６％以
上．在添加１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的培养基上，种子的萌发
均受到明显的抑制，野生型萌发率为５０．５％，突变
体的萌发率仅为５％，互补株系Ｃ１－３，Ｃ１１－６，Ｃ１９－４
的萌发率则分别维持在７６％，７５％，８１％．可以看
出突变体对盐过度敏感，而互补株系对盐的敏感性
比野生型低．
Ａ
Ｂ
Ｃ
图３　互补转基因株系的分子鉴定
Ａ．互补株系载体示意图，ＡｔＨＨＲ２由３５Ｓ启动子驱动．Ｂ．
ＤＮＡ水平ＰＣＲ检测ＡｔＨＨＲ２在突变体和互补株系中的表
达．Ｃ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测 ＡｔＨＨＲ２在野生型和互补株系
中的相对表达量．
Ｆｉｇ．３　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｔｈｈｒ２／ＡＴＨＨＲ２ｃｏｍ－
ｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｌｉｎｅｓ．
Ａ．Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ，ＡｔＨ－
ＨＲ２ｗａｓ　ｄｒｏｖｅ　ｂｙ　３５Ｓｐｒｏｍｏｔｏｒ．Ｂ．ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｔＨ－
ＨＲ２ｉｎ　ａｔｈｈｒ２ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｐｌａｎｔｓ．Ｃ．Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＡｔＨＨＲ２ｉｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ－
ｔａｒｙ　ｐｌａｎｔｓ．
３．５　盐处理下脯氨酸与叶绿素含量的变化
植物响应盐胁迫的过程中，脯氨酸是重要的调
节物质，而叶绿素则是植物生长代谢所必需的．为
探究盐胁迫处理下ＡｔＨＨＲ２的突变体及互补株系
是否发生渗透物质累积的变化，本文检测了 ＮａＣｌ
处理下野生型，突变体ａｔｈｈｒ２及互补株系Ｃ１－３，
Ｃ１１－６，Ｃ１９－４的脯氨酸与叶绿素含量，如图５所
示．由图可知，在正常条件下，突变体，野生型与互
８４９
第４期 　　 杨皓，等：拟南芥ＡｔＨＨＲ２基因的功能初步研究 　
Ａ
Ｂ
图４　野生型、突变体及互补株系在 ＮａＣｌ处理下种
子萌发表型
Ａ．野生型，突变体及三个互补转基因株系在萌发期对盐的
敏感表型．Ｂ．各株系种子在０或１２５ｍＭ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培
养基上的萌发率统计．
＊表示差异显著（Ｐ＜０．０５）
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　３
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｄｕｒｉｎｇ
ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．
Ａ．Ｓａｌｔ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ（ＷＴ），ａｔｈｈｒ２ａｎｄ　ａｔｈ－
ｈｒ２／ＡＴＨＨＲ２ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｓｔａｇｅ．Ｂ．Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｓｅｅｄｓ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　１／２ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎ－
ｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　１２５ｍＭ　ＮａＣｌ．
＊ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ＜０．０５
补株系的脯氨酸含量均较低，且无明显差别．在盐
胁迫处理下，突变体，野生型和互补株系的脯氨酸
质量比均升高，但突变体增加量较低，而互补株系
的增加最为明显．野生型脯氨酸含量升高了１．７１
倍，突变体仅升高１．５０倍，而三个互补株系分别升
高了２．３４，２．３７，２．４１倍．叶绿素含量在不同株系
中的变化趋势是类似的，与未处理之前相比，野生
型叶绿素含量降低３３．７％，突变体降低了４３．６％，
３个互补株系分别降低了２４．３％，２４．７％，２３．２％．
Ａ
Ｂ
图５　野生型、突变体及互补株系在 ＮａＣｌ处理下脯
氨酸和叶绿素的含量
Ａ．在１５０ｍＭ　ＮａＣｌ处理和无处理对照下野生型、突变体及
互补转基因幼苗的脯氨酸含量．Ｂ．在１５０ｍＭ　ＮａＣｌ处理和
无处理对照下野生型、突变体及互补转基因幼苗的叶绿素含
量．
＊表示差异显著（Ｐ＜０．０５）
Ｆｉｇ．５　Ｐｒｏｌｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ
ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
Ａ．Ｐｒｏｌｉｎｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ａｔｈｈｒ２ａｎｄ
ｔｈｒｅｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ１５０ｍＭ　ＮａＣｌ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂ．Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－
ｔｙｐｅ，ａｔｈｈｒ２ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈ－
ｏｕｔ　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
＊ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ＜０．０５
４　讨　论
在盐胁迫下，植物体细胞的离子平衡受到影
响，胞质中浓度过高的Ｎａ＋对代谢产生毒害，引起
细胞生长停滞或死亡．而目前的研究表明Ｅ３连接
酶广泛参与到植物各类非生物胁迫的应答中，包括
盐、干旱、冷及热胁迫．本研究为探究Ｅ３连接酶基
因 ＨＨＲ２ 在耐盐胁迫应答中所起的作用，从
９４９
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５３卷
ＡＢＲＣ购买了 ＨＨＲ２的 Ｔ－ＤＮＡ插入突变体，对
其进行ｑＰＣＲ 及 ＲＴ－ＰＣＲ鉴定，成功获得了 Ｔ－
ＤＮＡ突变纯合体．随后将ＡｔＨＨＲ２作为目的片段
插入到载体ｐｚＨ０１上，构建ｐｚＨ０１－ＨＨＲ２载体．
采用根瘤农杆菌介导法浸染突变体植株花序，并经
过筛选获得 ｈｈｒ２／ＨＨＲ２互补株系．定量 Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ结果显示，互补株系 ＨＨＲ２基因的表达
量远高于野生型，证明目的基因被成功转入互补株
系中，且其表达量超过野生型的表达水平．
在盐处理条件下的１／２ＭＳ培养基上，野生
型，突变体和互补株系种子的萌发率表现出较大的
差异．在１２５ｍＭ　ＮａＣｌ处理下，与野生型相比，互
补株系的萌发率更高，而突变体的萌发率几乎为
零，表现出对盐高度敏感的表型．逆境胁迫下脯氨
酸含量的提高对植物的抗逆和维持自身稳态具有
重要作用，本文进行了ａｔｈｈｒ２突变体和ａｔｈｈｒ２／
ＡＴＨＨＲ２互补株系的生理指标测定，结果表明，
在ＮａＣｌ处理下，突变体，野生型和互补株系的脯
氨酸含量与未处理相比均有上升，但在处理后突变
体的脯氨酸含量低于野生型，互补株系的脯氨酸含
量则较高．叶绿素含量是植物耐盐性的一项指标，
在外界盐浓度较高时，细胞内色素系统遭到破坏，
叶绿素含量下降［１１］．生化指标检测说明ａｔｈｈｒ２／
ＡｔＨＨＲ２互补株系抵抗逆境的能力更强，而突变
体对盐胁迫则更为敏感．在对ＮａＣｌ存在下的叶绿
素含量的测定中，结果显示与野生型相比，突变体
的叶绿素含量更低，而３个互补株系的叶绿素含量
维持在较高水平．这些生理指标的变化暗示了该基
因的功能缺失导致植物体对盐处理更加敏感，而互
补株系经过恢复该基因的表达水平后，对植物体的
耐盐性有明显的恢复，因此推断ＡｔＨＨＲ２是参与
到植物耐盐胁迫响应的过程中的基因．
ＡｔＨＨＲ２基因编码一种包含ＲＩＮＧ结构域的
Ｃ３ＨＣ４型Ｅ３连接酶，并受到多种逆境胁迫的诱
导．高等植物在生命周期中往往受到各种非生物胁
迫的影响，而ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ型Ｅ３连接酶被证实参
与多种胁迫的信号通路，如Ｅ３连接酶 ＡｔＡＩＲＰ１，
ＡｔＡＩＲＰ２，ＡｔＡＩＲＰ３ 等 参 与 干 旱 胁 迫 信 号 通
路［１２，１３，１４］，ＯｓＨＣＩ１参与到对热胁迫的响应中［１５］．
拟南芥ＳＤＩＲ１是正调控 ＡＢＡ 相关胁迫响应的
ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３ 连接酶［１６］．ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ结构
ＲＧＬＧ２蛋白参与拟南芥干旱胁迫的负调控［１７］．同
时Ｅ３连接酶亦有能力将不同底物进行泛素化，如
ＫＥＧ可降解ＣＩＰＫ２６，ＡＢＩ５，ＡＢＦ１，ＡＢＦ３等多个
ＡＢＡ信号通路中的重要基因［１８，１９，２０］，参与ＡＢＡ信
号通路的调节．对ＡｔＨＨＲ２基因的功能深入探究
需要了解在盐信号通路及其他通路中ＡｔＨＨＲ２的
相互作用蛋白，以更加明确地揭示其作用机理，为
通过基因工程提高农作物耐盐性提供理论依据．
参考文献：
［１］　 Ｚｈｕ　Ｊ　Ｋ．Ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，
２０００，５１：４６３
［２］　Ｐｉｃｋａｒｔ　ＣＭ，Ｆｕｓｈｍａｎ　Ｄ．Ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｃｈａｉｎｓ：ｐｏｌ－
ｙｍｅｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｉｇｎａｌｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，
２００４，８（６）：６１１．
［３］　Ｋｒａｆｔ　Ｅ，Ｓｔｏｎｅ　Ｓ　Ｌ，Ｍａ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ａｎｄ　ｆｕｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ２ａｎｄ　ＲＩＮＧ－
Ｔｙｐｅ　Ｅ３Ｌｉｇａｓｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，１３９：１５９８．
［４］　Ｓｔｏｎｅ　Ｓ　Ｌ，Ｈａｕｋｓｄｏｔｔｉｒ　Ｈ，Ｔｒｏｙ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃ－
ｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＩＮＧ－Ｔｙｐｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ
ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００５，
１３７：１４．
［５］　Ｌｅｅ　Ｊ　Ｈ，Ｋｉｍ　ＷＴ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｓｉｇ－
ｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｂｙ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｃｅｌ，２０１１，３１：２０２．
［６］　Ｌｉｕ　Ｋ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｘｕ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
ＯｓＣＯＩＮ，ａｐｕｔａｔｉｖｅ　ｃｏｌｄ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｈｉｌｉｎｇ，ｓａｌｔ　ａｎｄ
ｄｒｏｕｇｈｔ，ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｒｏｌｉｎｅ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｒｉｃｅ ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔａ，２００７，２２６（４）：１００８．
［７］　杨虹伟，翟先芝，刘志斌，等．两个高度同源的
ＲＩＮＧ结构域蛋白功能初步研究［Ｊ］．中国农业科技
导报，２０１３，１５（５）：１０１．
［８］　焦蓉，刘好宝，刘贯山．论脯氨酸累积与植物抗渗
透胁迫［Ｊ］．中国农学通报２０１１，２７（７）：２１６．
［９］　Ｃａｉｒｎｅｙ　Ｊ，Ｚｈｅｎｇ　Ｌ，Ｃｏｗｅｌｓ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ　ｆｒｏｍ　ｌｏｂｌｏｌｙ　ｐｉｎｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｓｉｍ－
ｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００６，６２（４－５）：４８５．
［１０］　Ｃｌｏｕｇｈ　ＳＪ，Ｂｅｎｔ　ＡＦ．Ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ：ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｍｅｔｈ－
ｏｄ　ｆｏｒ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９８，１６：７３５．
［１１］　Ｈｏｓｈｉｄａ　Ｈ，Ｔａｎａｋａ　Ｙ，Ｈｉｂｉｎｏ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｔｈａｔ　ｏｖｅｒ
ｅｘｐｒｅｓｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｇｌｕｔｍｉｎｅ　ｓｙｓｔｈｅｔａｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ，２０００，４３（１）：１０３．
［１２］　Ｒｙｕ　Ｍ　Ｙ，Ｃｈｏ　Ｓ　Ｋ，Ｋｉｍ　Ｗ　Ｔ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｃ３Ｈ２Ｃ３－ｔｙｐｅ　ＲＩＮＧ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　ＡｔＡＩＲＰ１ｉｓ
ａｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ａｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅ－
０５９
第４期 　　 杨皓，等：拟南芥ＡｔＨＨＲ２基因的功能初步研究 　
ｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１０，
１５４（４）：１９８３．
［１３］　Ｃｈｏ　Ｓ　Ｋ，Ｒｙｕ　Ｍ　Ｙ，Ｓｅｏ　Ｄ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ＲＩＮＧ　Ｅ３ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　ＡｔＡＩＲＰ２ｐｌａｙｓ
ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ　ｒｏｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ＡｔＡＩＲＰ１ｉｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－
ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ－
ｏｌ，２０１１，１５７（４）：２２４０－５７．
［１４］　Ｋｉｍ　Ｊ　Ｈ，Ｋｉｍ　Ｗ　Ｔ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＲＩＮＧ　Ｅ３
Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　Ｌｉｇａｓｅ　ＡｔＡＩＲＰ３／ＬＯＧ２ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ　ｉｎ
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ－Ｓａｌｔ　ａｎｄ　Ｄｒｏｕｇｈｔ　Ｓｔｒｅｓｓ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１３，１６２：１７３３．
［１５］　Ｌｉｍ　Ｓ　Ｄ，Ｃｈｏ　Ｈ　Ｙ，Ｐａｒｋ　Ｙ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｒｉｃｅ
ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ，ＯｓＨＣＩ１，ｄｒｉｖｅｓ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｘ－
ｐｏｒｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｈｅｔｅｒｏｇｅ－
ｎｅｏｕｓ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｔｈｅｒｍｏｔｏｌ－
ｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２０１３，６４（１０）：２８９９．
［１６］　Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｙ，Ｙａｎｇ　Ｃ　Ｗ，Ｌｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．ＳＤＩＲ１ｉｓ　ａ
ＲＩＮＧ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ　ｔｈａｔ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　２００７，１９：１９１２．
［１７］　Ｃｈｅｎｇ　Ｍ　Ｃ，Ｈｓｉｅｈ　Ｅ　Ｊ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＲＧＬＧ２，ｆｕｎｃ－
ｔｉｏｎｉｎｇ　ａｓ　ａ　ＲＩＮＧ　Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ
ＡｔＥＲＦ５３ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｒｅｇｕ；ａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｄｒｏｕｇｈｔ
ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１２，１５８：３６３．
［１８］　Ｌｉｕ　Ｈ，Ｓｔｏｎｅ　Ｓ　Ｌ．Ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ＡＢＩ５ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｌｅｖｅｒｌｓ　ｂｙ　ｐｒｏｍｏ－
ｔｉｎｇ　ＫＥＧ　Ｅ３ｌｉｇａｓｅ　ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅａｓｏ－
ｍａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２０１０，２２：
２６３０．
［１９］　Ｌｙｚｅｎｇａ　ＷＪ，Ｌｉｕ　Ｈ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ　ＣＩＰＫ２６ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ＫＥＧ，ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ＡＢＡ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ａｎｄ　ｉｓ　ｄｅｇｒａｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２０１３，
６４（１０）：２７７９．
［２０］　Ｂａｔｉｓｔｉｃ　Ｏ，Ｗａａｄｔ　Ｒ，Ｓｔｅｉｎｈｏｒｓｔ　Ｌｅｔ　ａｌ．ＣＢＬ　ｍｅｄｉ－
ａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ＣＩＰＫｓ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｄｅｃｏｄｉｎｇ　ｏｆ
ｃａｌｃｉｕｍ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｅｍａｎａｔｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｃｅｌｕｌａｒ
ｓｔｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０１０，６１：２１１．
１５９