全 文 ：
第 38 卷第 6 期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.38 No.6
2012 年 12 月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Dec．2012

DOI:10.3724/SP.J.1238.2012.00597
拟南芥 DWF4 基因的内含子影响自身表达
彭志红 1,2，黄颖 1，袁利兵 1，任春梅 1,2*
(1.湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

摘 要：为了进一步确定 DWF4 基因的内含子是否影响自身表达，构建了 35S启动子驱动的带内含子和不带内
含子的 DWF4基因表达载体，分别转入拟南芥 DWF4基因的弱突变体 psc1。对 T2代幼苗进行表型分析发现，转
入带内含子的 DWF4基因的转基因株系 TgD4能完全恢复突变体的表型，而转入不带内含子的 DWF4基因的转基
因株系 TcD4 只能部分恢复突变体的表型。RT–PCR 分析显示，TgD4 的 DWF4 表达水平明显增加，说明内含子
对 DWF4基因的表达有增强作用。
关 键 词：拟南芥；DWF4基因；内含子；基因表达
中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：10071032(2012)06059705

Introns of DWF4 gene influence gene expression in Arabidopsis
PENG Zhi-hong 1,2, HUANG Ying1, YUAN Li-bing1, REN Chun-mei1,2*
(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agicultural University, Changsha 410128, China; 2.Crop Gene
Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha 410128, China)

Abstract: To better understand the expression patterns of DWF4, expression plasmids with 35S CaMV constitutive
promoter containing DWF4 gene with or without its own introns were constructed and transformed respectively into the
psc1 mutant deficient in the biosynthesis of brassinosteroids (BRs). Phenotypic analysis showed that the transgenic lines
TgD4 with the introns of DWF4 gene could rescue the defect of BR biosynthesis in psc1 totally, whereas the transgenic
lines TcD4 without the introns of DWF4 gene could only rescue the defect of BR biosynthesis partially. RTPCR
demonstrated that the expression of DWF4 in the transgenic lines TgD4 was obviously increased indicating the
expression of DWF4 gene could be enhanced by its own introns.
Key words: Arabidopsis; DWF4; intron; gene expression


收稿日期：2012–05–29
基金项目：湖南省研究生科研创新项目(CX2010B288)；湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室开放基金项目(10KFXM06)
作者简介：彭志红(1972—)，女，湖南永州人，博士研究生，讲师，主要从事植物分子遗传学研究，zhihong_peng@126.com；*通信作
者，rencm66@163.com
芸薹素(brassinosteroids，BR)是 20世纪 70年代
发现的一类重要的植物激素[1]。芸薹素参与植物的细
胞伸长和分裂、输导组织分化、衰老、抗逆性以及
光调控，对植物生长发育起至关重要的作用[2–4]。拟
南芥DWF4基因编码芸薹素生物合成途径中的一个
非常关键的酶[5–6]，通过调控 DWF4 基因的表达可
以控制芸薹素的生物合成，但目前对 DWF4基因表
达调控的研究仅涉及到启动子。内含子是断裂基因
中的非编码区序列，其中，真核基因前体 mRNA的
内含子是最常见的内含子[7]，在mRNA转录加工后，
内含子被切除掉，起初人们认为内含子没有功能。
但近年来的许多研究发现，有些真核基因的内含子
在基因表达中具有相当重要的作用[8–17]。笔者构建
了 35S 启动子驱动的带内含子和不带内含子的
DWF4 基因表达载体，分别转入拟南芥 DWF4 基因
的弱突变体 psc1，以期通过对 T2代幼苗的表型分析
以及对基因表达水平的检测，探讨 DWF4 基因的内
含子是否影响自身的表达，为 DWF4 基因调控芸薹


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素生物合成的分子机制的研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(Col–0，WT)
和 psc1突变体，由作物基因工程湖南省重点实验室
植物信号传导课题组提供。
1.2 方 法
1.2.1 植株培养
拟南芥 Col–0、psc1突变体种子用消毒液(20%
bleach+0.1% Triton X–100)浸泡 10 min后，无菌水
清洗 5次，播种于含 1%蔗糖的 1/2MS固体培养基
上，经 4 ˚C暗处理 3 d后，转入植物培养室，每天
16 h光照(22～24 ℃)、8 h 黑暗(16～19 )℃ 培养。
1.2.2 目的片段的扩增
以拟南芥野生型 Col–0的基因组 DNA和反转
录所得的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。使用
Premier Primer 5.0软件，设计引物 D–5：5–ATGTT
CGAAACAGAGCATCATA–3，D–3：5–AAAGAG
CTCAAAAAAAAAAGAAGAGAATAAAAA–3。PCR
反应体系：DNA /cDNA模板 2 μL，引物 D–5 (10
μmol/L)1 μL，引物 D–3 (10 μmol/L) 1 μL，10×
Phusion Buffer 2 μL，dNTPs(10 mmol/L) 0.4 μL，
Phusion DNA聚合酶 0.2 μL，ddH2O 13.4 μL，反应
总体积为 20 μL。DWF4 全长基因的 PCR反应程
序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退
火 30 s，72 ℃延伸 3 min，循环 30次，72 ℃终延
伸 10 min。 DWF4 基因 cDNA 的 PCR反应程序：
94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30
s，72 ℃延伸 100 s，循环 30次，72 ℃终延伸 10
min。反应结束后于 16 ℃保存。使用天根普通
DNA片段纯化试剂盒纯化 PCR的扩增产物。
1.2.3 植物表达载体 pMD4 和 pMcD4 的构建
首先将扩增的目的片段用限制性酶 SacⅠ单酶
切，质粒 pMYC2用 SmaI和 SacI双酶切，并以质粒
pMYC2 的酶切作对照，电泳检测。然后用 T4 连接
酶将酶切纯化的 DWF4 基因和 pMYC2连接。将分
别连有 DWF4全长基因和 DWF4 cDNA的载体命名
为 pMD4和 pMcD4。采用热激法分别将载体 pMD4
和 pMcD4转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞，用含有
100 μg/mL Kan的 LB培养基进行培养。PCR鉴定为
阳性的菌落进行液体小量培养用于质粒提取，并将
提取的pMD4和pMcD4质粒交北京奥莱博公司进行
测序鉴定。
1.2.4 工程菌的制备及拟南芥的遗传转化
采用电击法，将测序结果正确的质粒 pMD4和
pMcD4转化到农杆菌 AGL–1中，用含有 100 μg/mL
Kan 和 50 μg/mL Rif的 LB培养基进行筛选，随机
挑选阳性菌落进行 PCR 鉴定。挑取阳性单克隆农
杆菌在含有 50 μg/mL Rif、100 μg/mL Kan的 LB液
体培养基中，28 ℃、250 r/min振荡培养过夜，制备
农杆菌悬浮液。采用农杆菌浸花转化法，将 pMD4
和pMcD4转入拟南芥psc1突变体中，在含50 μg/mL
Kan 的 MS 培养基上筛选，提取转化植株 DNA 采
用 PCR进行分子鉴定。
1.2.5 RT–PCR 分析
RT–PCR分析按常规操作进行，使用 ABI–2720
Thermal Cycler 型 PCR仪，采用反转录试剂盒进行
逆转录，得到 cDNA 第 1 条链。DWF4 基因 PCR
扩增所用的引物为 5– ATGTTCGAAACAGAGCAT
CATA–3和 5– AAAGAGCTCAAAAAAAAAAGAA
GAGAATAAAAA–3；以 ACT2 为参照基因，所用
引物为5–TTCCGCTCTTTCTTTCCAAGCTCA–3和
5–AAGAGGCATCAATTCGATCACTC A–3。PCR
反应体系：cDNA 2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTPs
(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，引物各
0.8 μL，ddH2O 13.4 μL，反应总体积为 20 μL。PCR
反应程序：95 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，循环 26次；72 ℃终延
伸 10 min。RT–PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测基因表达情况。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体 pMcD4 和 pMD4 的构建结果
用载体pMyc2[18]构建了35S启动子驱动的带内
含子和不带内含子的 DWF4基因表达载体，其中扩
增的 DWF4基因组 DNA为 2 952 bp，包含从起始


第 38 卷第 6期 彭志红 拟南芥 DWF4基因的内含子影响自身表达 599

密码子 ATG 开始到终止密码子TAA的 8 个外显
子和 7个内含子以及 3–UTR中的 45 bp碱基片段。
扩增的 DWF4 cDNA 全长 1 587 bp，包括 DWF4
cDNA和 45 bp的 3–UTR区。
pMYC2质粒(图 1–A)是在质粒 pROK2 T–DNA
区的 35S 启动子后加入了一段 MYC2 序列标签，
与转入的外源 DNA 片段一同转录翻译。用 SmaI
和 SacI 将 pMYC2载体切开，使用 T4连接酶将载
体和 DNA 片段连接。靠近 nos 终止子的一端与
DWF4 基因片段的 3′端相连，SmaI 由于切开的是
平末端，可与基因片段磷酸化的 5′端相连，这样就
分别得到连有 DWF4 cDNA 的 pMcD4载体和连有
DWF4 全长基因的 pMD4载体(图 1–B)。

A pMYC2质粒 T–DNA 区；B 连入了基因片段的 pMcD4和 pMD4载体。
图 1 pMD4 和 pMcD4 载体的构建
Fig.1 The construct of pMcD4 and pMD4
2.2 纯合单拷贝转基因植株的筛选与鉴定
采用农杆菌介导法将 pMD4 和 pMcD4 转入拟
南芥 psc1突变体中，在含 50 μg/mL Kan的培养基
上筛选阳性苗，获得的阳性苗分别命名为 TgD4 和
TcD4，转基因植株 T1代提取 DNA 进行 PCR 鉴定
的结果均为阳性(图 2)。对 T2代植株进行 Kan抗性
鉴定，最终各得到了 2 个 TgD4 和 TcD4 的纯合
T–DNA 株系。

TgD4 转入带内含子的DWF4基因的转基因株系；TcD4 转
入不带内含子的 DWF4基因的转基因株系。
图 2 转基因植株的 PCR 鉴定结果
Fig.2 PCR identification of transgenic plants
2.3 内含子对 DWF4 基因表达的影响
2.3.1 转基因植株的表型
将转基因植株 T2 代纯合单拷贝的种子转移至
土壤中继续生长，观察 3周龄转基因株系的表型(封
三彭志红图 3)，发现 TgD4 转基因植株由于转入了
由 35S 启动子驱动 DWF4 全长基因，原来的 psc1
突变体表型已完全被恢复，与同期的 psc1 差异明
显，叶形、叶柄，叶色等与野生型 Col–0 相似，甚
至其生长状态在一定程度上超过了野生型，有
DWF4 过表达表型。而 TcD4转基因植株由于转入
了 35S 启动子驱动 DWF4 cDNA， 也能部分互补
psc1的表型，与同期的 psc1相比，TcD4 叶片大小、
叶柄长度等都超过了 psc1，叶片颜色较野生型深，
不过其植株生长较野生型仍然缓慢，生长状态介于
野生型和 psc1 之间，说明由 35S 启动子驱动的
DWF4 cDNA转化植株能部分恢复 psc1的表型。
2.3.2 转基因植株的 DWF4 基因表达
为了进一步确定DWF4 内含子是否在该基因转
RB
SmaⅠ SacⅠ
NPTⅡ CaMV 35S 6×Myc DWF4 cDNA nos LB
NPTⅡ RB CaMV 35S 6×Myc nos LB DWF4 gDNA
D–5′
D–5′
D–3′
D–3′
A pMYC2
B pMcD4
pMD4
RB Pnos–NPTⅡ–nos CaMV 35S 6×Myc nos LB
6×Myc CCCGGG GAGCTC nos CAGA
M
M
TgD4
TcD4
1 000 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp


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录水平起调控作用，分别提取 3 周龄的转基因株系
TgD4和 TcD4叶片的 RNA，以 Col–0和 psc1作为
对照，ACTIN作为内参进行 RT–PCR(图 4)。结果发
现，Col–0 和 psc1 中 DWF4 基因表达水平相当，
说明 psc1 植株内 DWF4 基因的点突变不影响该基
因的表达水平，由此推测 psc1植株表型的变化可能
是该基因编码蛋白的活性降低引起的。而在转基因
株系 TcD4 中 DWF4 基因的表达水平要高于 Col–0
和 psc1，表明转入 DWF4 cDNA 在 35S 启动子的驱
动下在拟南芥中过量表达，使基因的转录水平升高，
并且 TgD4 的 DWF4 基因的表达水平又明显高于
TcD4，这表明内含子能提高 DWF4 基因的表达量。

WT 拟南芥野生型； psc1 DWF4 基因的弱突变体； TgD4–1 和 TgD4–2 转入带内含子的 DWF4 基因的单拷贝转基因株系；
TcD4–1和 TcD4–2 转入不带内含子的 DWF4基因的单拷贝转基因株系。
图 4 DWF4 基因的 RT–PCR 检验结果
Fig.4 RT–PCR testing of DWF4 gene
3 讨 论
在高等植物中，有些基因的内含子能增强基因
的表达，如玉米 Sh1 基因、水稻 Ostub16 基因和
Wx基因、拟南芥 PAT1基因和 COX5c基因等[8–12]；
有些基因的内含子具有调节基因时空特异表达的
作用，如水稻 OsTubA1 基因、矮牵牛花 PhADF1
基因、拟南芥 AGAMOUS基因等[13–15]；还有一些基
因的内含子为基因表达所必需，如水稻 TPI基因和
OsBP–73基因等[16–17]，但并非所有真核基因的内含
子都影响基因表达。拟南芥 DWF4基因编码芸薹素
生物合成途径中的一个非常关键的酶，对芸薹素生
物合成起到限速的作用。用载体 pMyc2 构建 35S
启动子驱动的带内含子和不带内含子的DWF4基因
表达载体，分别转入拟南芥 DWF4基因的弱突变体
psc1，研究 DWF4基因的内含子是否影响自身的表
达，通过表型观察发现：转入带内含子的 DWF4基
因的转基因植株 TgD4 能完全恢复突变体的表型；
而转入不带内含子的 DWF4 基因的转基因植株
TcD4 只能部分恢复突变体的表型，但并不能完全
弥补 psc1基因突变带来的生长障碍。RT–PCR进一
步分析，转基因植株 TgD4 和 TcD4中 DWF4基因
的表达水平都要高于野生型和 psc1，并且，DWF4
基因在 TgD4 的表达水平明显增加，这说明内含子
对 DWF4基因的表达有增强作用。
由于 DWF4的表达受芸薹素反馈调控影响，即
当芸薹素合成不足时，DWF4表达量上升，能促进
芸薹素的生物合成；而当植物体内芸薹素的含量达
到某个阈值时，DWF4的表达受到抑制，导致芸薹
素合成速度下降，从而使植物体内芸薹素含量处于
一种动态平衡状态。本研究结果表明，DWF4 基因
的内含子在该基因的表达中起着正调控的作用，那
么，对 DWF4 基因进行负调控的元件很可能是该基
因的启动子区。然而，不同基因的内含子增强基因
表达的机理也不完全相同：有的提高转录效率；有
的增加mRNA的稳定性；有的影响基因翻译等[19–21]。
此外，DWF4 基因中总共有 7 个内含子，究竟哪
个内含子或者哪几个内含子以何种方式对该基因
的表达起着调控作用，还有待进一步的研究。
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责任编辑：罗慧敏
英文编辑：罗 维