全 文 ：植物生理与分子生物学学报 , oJ u rn a l of p la n t p h夕s ot l口舒 a n d 物 le e u la ; 刀 ot le 舒 2 0 04 , 30 临) : 弓5 3一 5 60
A 工H K I 基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程
郝岗平 ’ , ’ 吴忠义 ’ 陈茂盛 ` , ’ 曹鸣庆 ’ e e o r g e s P e l l e t i e r 3 黄丛林 ” 杨 清 ”
( ,
’ ` 南京农业大学生命科学学院 , 南京 2 10 0 95 ; ’ ` ’ 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 , 北京 1 0 0 8 9 ; ’ UR Z列 nU i沱 de G血 iet q ue
e r A m刁 i o n ar r i o n de s P la n t e s , I N R A 7 8 0 2 6 V e r s a i l le s , F r a n e e )
摘要 : 以拟南芥 A T子I K I 基因 T 一 D N A 插入所产生的缺
失突变体和野生型 W S (W a s s il e w s k ij a ) 生态型为材料 ,
分析了它们在生理和基因表达方面的差异 。 结果表明
突变体的离体叶片失水率明显 大于野生型 ; 在 3 0 %
P E G
一
6X() O胁迫后 , 野生型和 A 丁月K l 突变体的细胞膜离
子外渗率比胁迫前分别增加了 50 % 和 80 % 。 P E G 胁迫
48 h 时突变体的姜蔫程度明显 大于野生型 W S 。 以上
结 果说明 A T H K I 突变体的抗渗透胁迫能力低于野生
型 , 即 A T月K I基因参与 了拟南芥适应逆境的调节反应 。
矛,!用 D D R T一 P C R技术研究二者在 P E G 胁迫 36 h后 的基
因表达差异 , 分离到 9 个在野生型中被 P E G 诱导表达
而在突变体中未被诱导的参与逆境应答的基因片段 , 其
中包括几扒尸天尺天了8和丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶基因 , 即
A 了H K I 基因失活引起下游基因响应渗透胁迫的能 力减
弱 , 进一步说明 A r H K I 基因参与拟南莽适应逆境的调
节反应 , 并且 A T H K I 可能在逆境信号转导组分 M A P K
的上游起作用 , 很可能是植物体中的渗透感受器 。
关键词 : 拟南莽 ; A 7万 K l 突变体 ; 生理差异 ; 基因表
达差异 ; 渗透感受器
中图分类号 : Q 7 4
植物具有多种机制来适应干旱 、 高盐和低温
等胁迫条件引起 的水分亏缺 。 水分亏缺引起的渗
透势变化会启动植物的许多分子生物学响应 (B r ay
1 9 97 )
。 虽然现在 已经克隆了大量干旱 、 盐碱和
低温诱导 的基 因 ( I n g r a m 和 B a r t e l s 1 9 9 6 ,
s h i n o z a k i 和 Y a m a g u c h i 一 S h i n o z a k i 1 9 9 7 ) , 但对植
物细胞如何感受水分亏缺仍知之甚少 。
已经发现 , 细菌和酵母可通过组氨酸蛋 白激
酶 (h i s t id i n e p r o t e i n k i n a s e , H K )感受外界环境刺
激 , 并将信号转导到细胞内部 ( P a r k i n s o n 1 9 9 3 ,
M i z u n o 1 9 9 7
,
O t a 和 V a r s h a v s k y 19 9 3 , U r a o 等
1 9 9 9)
。 它 由两个基本组分构成 : 一个是组氨酸
蛋 白激酶(H K ) , 另一个是响应调节蛋白 ( r es p on s e -
r e g u l a t o r p r o t e i n
,
R R )
。 这种信号系统被称 为
“ 双组分信号系统 ( tw o 一 c o m p o n e n t s y s t e m ) ” 。 酵
母等真核生物的双组分信号系统进化为多步骤磷酸
化传递形式 的信号系统 , 它比细菌的双组分系统
多一个含 h i s t i d i n e 的磷酸转移蛋 白 ( h i s t i d i n e
p h o s p h o t r a n s f e r p r o t e i n
,
H p ) (W
e s t 和 S t o c k
20 0 1 )
。 该信号系统作为渗透感应器将外界环境水
分亏缺信号跨膜传递到细胞 内 , 调节基 因表达 ,
引起细胞的生理生化反应 ( C h a n g 和 S t e w a rt 19 9 8 ) 。
近年来 , 在植物里相继克隆到 了编码组氨酸
蛋白激酶 的基因 , 并且在拟南芥 、 水稻和番茄等
高等植物 中已鉴定 出双组分信号系统 ( C h a n g 和
S t e w a r t 19 9 8
,
Y a u 等 2 0 0 4 , Z h o u 等 1 9 9 6 ) 。 而
且一 些实验证实此双组分信号系统参与了植物乙烯
和细胞分裂素的信 号传递 ( C h a n g 和 M e y e r o w i t z
1 9 9 5
,
H w a n g 等 2 0 0 2 ) 。
根据拟南芥全基因组序列 , 人们推测拟南芥
中存在 H K 、 H P 、 R R 及其相关蛋白编码基因 5 4
个 , 它们 参与 乙烯 、 细胞分裂素和光等信号的转
导 , 调节植物的生长发育 ( H w a n g 等 2 0 0 2 ) 。 拟
南芥的所有 H K 成员可以分为 3个家族 : 乙烯受体
家族 、 光敏色素受体家族和 A H K 家族 (包括细胞
分裂素受体和 1 个渗透感应器 ) 。 一个典型的 H K
有 5 个保守的基序 (m o t i f ) : H 、 N 、 G l 、 F 、 0 2 ,
这 5 个基序对 H K 的活性起着重要作用 (s t o c k 等
2 0 0 0)
。 但并不是所有的 H K 成员都具有这 5 个保
守基序 , 乙烯受体家族中的 E T R Z (e ht y l e n e
r e s p o n s e Z )
、
E R S Z (e t h y l e n e r e s p o n s e s e n s o r Z )和
全部的 PH Y s ( p h y t o e hr o m e p h o t o er e e p t o r )不具有全
部的 5 个保守的基序 , 可能不具有组氨酸蛋 白激
酶活性 (H w a n g 等 2 0 0 2 ) 。
2 0 0 4
一
0 1
一
12 收到 , 2 0 0 4 一0 6 一 0 3 接受 。
北京市科委项 目 ( H o I 2 0 l o 24 o 2 4 0 l l 3 , H o 2 0 8 2 l l 5 0 13 0 ) 、 科技部
中法 P R A 项 目(中法 P R A B T 0 2 一2) 和国家重大基础研究规划项 目
( 2 0 0 3 C B 1 14 3 0 0 ) 资助 。
, 同为通讯作者 ( E 一 m a i l : H u a n g e o n g l i n @ h o t m a i l . e o m ;
Q y a n g l g @ nj
a u尤 d u . e n ) 。
, * 同为第一单位 。
植物生理与分子生物学学报 3 0卷
拟南 芥中的乙 烯 受体家族 包括 5个 成 员 :
R E T I
、
R E T Z
、
E I N4( e th y ln e e
一
in n e s s i tiv e4 )
、
R E sl和 ER s Z( Hwa n g等 0 0 2 2 )。 根据氨基酸序列
相似性它们又可 以分为 2个亚家族 :第一亚家族
包括 R E T I和 R ES I, 具有 H K 所有 5 个保守的基
序 : 另一亚家族包括 E T R Z 、 E R s Z 和 E I N 4 , 缺
乏 H K 大部分保 守的基序 ( G a o 等 2 0 0 3 ) 。 E T R I 是
研究最 清 楚 的 乙烯受体 , 乙烯 的结 合位 点在
E T R I氨基末端的跨膜结构域内 , 信号输出端位于
C 端 , 它直接作用于下游的 C T R I , 引发 M A P K
级联反应 ( K i e b e r 等 1 9 9 3 , H u a n g 等 2 0 0 3 ) ; 另
外 , w an g 等 (2 003 )认为乙烯信号转导过程并不需
要 E T R I 跨膜区的组氨酸蛋 白激酶活性 。 最近又
分别在水稻 、 番茄和绿豆中克隆到编码 乙烯受体
的基因 (Y a u 等 2 0 0 4 , Y o k o t a n i 等 2 0 0 3 , L e e 和
幻m 2 0 0 3 ) 。 乙烯和 IA A 诱导水稻 0 5 一ER S ] 和 0 5 -
E RT Z 的表达增强 , 但 0 5 一ER S Z 的表达减弱 ( Y au
等 2 0 0 4 ) 。
C K n 是在拟南芥中发现的第一个细胞分裂素
受体 , 其编码蛋 白具有 H K 的功能区域 , 但它的
功能 目前仍不清楚 ( H u t c h i s o n 和 K i e b e r 2 0 0 2 ) 。
In o u e 等 (2 0 0 1) 筛选到 cR E I 拟南芥突变体 , 发现
C况石1与 A H K r4 属于同一个基 因 , 该突变体对细胞
分裂素 的反应减弱 , 而且证实细 胞分裂素激 活
C R E I 受体 , 从而启动磷酸化反应信号 。 R e i s e r
等 (2 0 0 3) 研究发现 , 当被激动素激活时 , 拟南芥
C R E I 在酵母细胞中可 以代替 S ln l 的渗透感受功
能 , 它的激酶活性与酵母的 lS nl 相似 , 可 以被膨
压变化所调节 , 但是没有实验结果说明 C R E I 在
植物体 内可 以感受膨压的变化 。
A T H K I (A ar b id o P s i s t h a li a n a h i s t id i n e k i n a s e )
是拟南芥里 H K 家族的成员之一 (U r ao 等 19 9 9) , 其
c D N A 全长 4 0 4 0 b p , 推算它可编码 1 2 0 7 个氨基
酸残基 , 分子量 1 3 5 k D 。 A T H K I 蛋白质具有组
氨酸残基的信号转导域和保守的A sP 残基的受体区
域 。 疏水性分析表明 A T H K I 在 N 端具有两个疏
水域 , 说明 A T H K I 是膜蛋 白 。 从同源性 比较结
果得出 A T H K I与酵母 H K 具有 3 0% 的相似性 , 结
构分析也表明它与酵母 H K 在结构上也有一定相似
性 。 将 A T H K I 导入酵母 H K 突变体 (S I nl ) , 免疫
分析法检测 H K 下游 H O G I M A P K 的 T yr 磷酸化
情况 , 证实在酵母细胞中 A T H K I 具有对渗透的感
受功能 ( u r a o 等 1 9 9 9 ) 。
但 A T H K I 是否是植物渗透感应器 , 是否参与
植物的抗渗透胁迫反应 , 至今仍无确切的直接证
据 。 本实验中我们一方面分析 A不厅 K l 突变体及其
野生型在 P E G 胁迫下的生理表型差异 : 另一方面
用 D D R T 一 PC R 技术研究拟南芥 A r HK I 基因突变体
及其野生型在 3 0% P E G 处理下的基 因表达差异 ,
克隆这些差异片段后 , 用 B L A s T ( B a s i c L o c a l
A h g n m e nt S e acr h T
o ol )分析这些差异片段对应的基
因 , 分析这些基因与 A T H K I 基 因的关系 , 从而
为进一步研究 A Z 厅K l 在植物逆境胁迫反应中的功
能奠定 基础 。
1 材料与方法
L l 植物材料
A Z H K I 突变体是 T 一 D N A 插入所产生的缺失
突变体 , 来源于法国 IN R A 凡耳赛突变体库 , 野
生型材料为 W S 生态型 。 T 一D N A 插入到 A 不日K l 基
因的第 1 2 外显子区 , 突变体 F S T ( lF a n k i n g
S e q u e n c e T a g )号是 F L A G _ 1 5 5 F 0 8 , P C R 验证为
纯合突变体 ; 我们单株收集 T l 代种子 , 播种在含
k a n a m y e i n 5 0 m g / L 的 M s 培养基上 , 重复 3 次 ,
每次 8 0 粒 。 所有种子均萌发 , 进一步说 明其为
纯合突变体 (结果未列出 ) 。 A r 付K l 突变体和野生
型 (W )T 拟南芥种子播种于 M S 培养基 10 d 后 , 移栽
于蛙石和营养土 1 : 1 比例的混合基质中 , 继续于
2 3 oC
、
1 6 h 光照下培养 1o d , 用 3 0% (林丫w ) 的
P E G
一
60 0 溶液进行胁迫处理 , 观察突变体和野生
型表 型变 化 。
1
.
2 离体叶片失水率测定
按照张宪政 ( 1 9 8 9) 的方法 , 每个样品 3 个重
复 。
1
.
3 细胞膜离子渗透率测定
参照李振国 ( 1 9 9 9) 的方法 , 分别测定 P E G -
60 0 处理 36 h 前后的细胞膜离子渗透率 , 每个样品
3 个重 复 。
1
.
4 基因表达差异 D D R T · P C R 分析
取材 : 按 1 . 1 的方法用 P E G 一 6 0 0 0 处理 36 h
后 , 分别取 突变体和野 生型叶片 , 用液氮速冻
后 , 置于 一 7 0 ℃ 下保存备用 。
总 RN A 的提取 : 按照 Ivn it or 郎 n 公司的 itr oz l
5期 郝岗平等 : A r付 l K基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程
试剂 ( C at . No. 0 5 5 9 6一 0 2 6 )说明书进行操作 。 提取的
总 A R N溶解后用 1%的琼脂糖凝胶检测其完整
性 , 用紫外分光光度计测定其纯度和浓度 。
反转录及 D D 一 p C R 反应 : 取 5 林g 总 R N A ,
用上海生物 工程 公 司 的三条锚 定 引 物 , 按 照
I n v iotr g
e n s u p e r s e ir tP 11 反转录酶说明书进行反转
录 。 取 2 林L 反转录产物做模板进行 D D 一 P C R 反
应 。 从上海生物工程公司的 26 条差异显示随机引
物中随机抽取 20 条与三条锚定引物组合进行 P C R
反应 , CP R 反应体系为 25 匹 , 反应程序为 : 94 ℃
预变性 2 m i n , 然后 9 4 oC 变性 3 0 5 , 4 0 oC 退火 1
m i n
,
7 2 oC 延伸 2 m i n , 4 0 个循环后 7 2 oC 延伸 7
I n 1 1
。
差异显示及 c D N A 片段的回收 : 取 5 林L P C R
扩增产物 , 在 5% 的变性聚丙烯酸胺凝胶上 7O W
恒功率电泳约 2 . 5 h 。 银染显色 , 找出差异带 。
切下载有差异带的凝胶 , 加入 10 林L d d H Zo , 4 ℃
过夜 , 取 2 林L 做二次 P C R , P C R 条件同前 。 二
次扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶检测 , 采用 O me ga
公 司胶回收试剂盒回收二 次扩增产 物 。 采 用
p G E M 一 T v e以 or 克隆这些差异片段 , 测序 。 将
测序结果与拟南芥数据库进行 B l as t 同源性分析 。
反向(er v e r s e ) N o hrt em 杂交 : 取 5 林g 总 R N A
,
利用 R o e h e 公司的地高辛标记 ( D i g lab e l i n g ) dN TP ,
按照 In v iotr g e n S u p er s e ir p t 11反转录酶说明书进行
反转录标记总 R N A 。 将等量的约 30 0 n g 的二次扩
增产物用 B IO 一 R A D 公司的斑点印迹抽滤加样器点
样于尼龙膜上 。 杂交及检测过程按照 R oc h e 公司
的地高辛高效标记和检测试剂盒 (I D I G hi hg p ir me
n N A lab e l i
n g a n d d e t e e t i o n s t a r t e r k i t 11 )说明书进
行 。
图 1 P E G一 6 00 0 处理 48 h 后突变体和 w T 的表型差异
R .g 1 iD fe er
n ce in hP en ot y Pe be twe en A ar b i故沪 s is A不日K少-
mu t an t an d W T
a fet r b e i n g etr aet d w i ht P EG
一
6 00 0 fo r 4 8 h
力的强弱 , 抗旱性越强的植物其离体叶片失水率
越小 。 不同基因型的小麦离体叶片失水率不同 ,
其抗旱性不同 ( e l a kr e 和 M e C a i g 19 8 2 ) 。 抗旱性较
高的高粱 , 其蒸腾速率较低 , 离体叶片失水率较
低 (oJ dr a n 等 19 84) 。 A z HK I 突变体与野生型的离
体叶片在 12 h 内的失水速率如图 2 所示 , 突变体
的失水速率快于野 生型 。
- -山一 M U t a n t
一 四下60420ǎ岁à艺。一牟上s邀Jo.50-
6 8 1 0 1 2 14
石m e (h )
图 2 A r 付K l 突变体和野生型的离体叶片失水率差异
F i g
.
2 D ife
r e n e e in w at e r 10 5 5 ar t e o f d e tac h e d l e af b e t w e e n
A ar ib d op is
`
A r 日K l 一mu t a n t an d W T
2 结果
2
.
1 P E G 处理后的表型差异
A r 日K l 突变体和野生型经 30 % (林夕w ) P E G 处
理 2 4 h 后 , 表型差异不明显 ; 随着胁迫时间的
延长 , 两者的差异逐渐变得明显 。 3 6 h 时突变体
开始萎蔫 , 4 8 h 时突变体的萎蔫程度明显高于野
生型 W T (图 1 ) 。 说明 A Z’H K l 突变体的抗胁迫能力
明显低于野生型 。
.2 2 离体叶片失水率差异
离体叶片失水率的大小能够反映植物抗旱能
.2 3 P E G 胁迫前后的细胞膜离子渗透率差异
一般认为 , 抗渗透胁迫的植物品种对水分亏
缺有较强 的适应能力 , 原因与其在水分亏缺下细
胞膜透性改变较小有关 , 而细胞膜透性可以通过
测定 电导率来反映 。 电导率大 , 离子渗透率高 ,
细胞膜受伤害大 , 反映植物抗渗透胁迫能力弱 (黄
有总等 2 0 0 2 ) 。 图 3 所示在 3 0% P E G 胁迫处理 3 6
h 后 , 野生型 的细胞膜离子渗透率比胁迫前增加
了 5 0 % , 而 A T H K I 突变体比胁迫前则增加 了
8 0 %
, 可以说明突变体抗 P E G 胁迫能力减弱 。
植物生理与分子生物学学报 30卷
A B 人 B A B A B M人 分 A B A B A B 人 B A 日 ^ B A B
图 3 P EG胁迫前后 A不 HK I突变体和野生型的细胞膜离子
外渗率的差异
F ig
·
3 D ife
r e n e e in io n l e a k a g e r ta i o o f e e ll m e m b r na
e o f
l e a v e s w ith a n d w i th o u t P E G rte
a t m e n t b e t w e e n A ra b i故少 5 15
AT H K I
一
m u t na t na d WT
2. 4 P E G胁迫下 A T H KI 突变体和野生型基因表
达的差异
P E G 处理后 , 分别对野生型和突变体叶片总
RN A 进行 D D R T 一CP R 分析 , 用 3 条锚定引物和 20
条随机引物组合的 6 0 对引物进行 CP R 反应 , 产物
在 5% 的变性聚丙烯酞胺凝胶上 电泳约 .2 5 h , 银
染显色 , 其中 3 2 对引物组合中发现有差异片段 ,
个别的引物组合扩增出 2一 3 条差异带 , 共发现重
复性较好的差异条带 3 7 条 , 其中 5 条在突变体中
特异表 达 , 其余在野生 型中特异表达 或表达增
强 。 二次扩增效果较好的有 3 条 。 图 4 显示的是
其中部分差异带 (箭头所示 ) 。
图 4 拟南芥 A厂付K l 突变体和野生型 m R N A 差异显示分析
F i g
.
4 D i fe er
n t i a l m R N A d i s P I盯 o f A ar b i d o P s is A T H K I -
m u ta n t an d W T
A : W T : B : A 不日K I 一 m u atn t : M : M ar k e r ( for m toP ot b o t t o m 62 2
,
5 27
,
4 04
,
3 11
,
3 09
,
2 42
,
2 3 8 bP )
.
由 D D R T 一 P C R 所获得的 c D N A 片段一般长
3 0 0一5 0 0 b p , 被称为 D n 一 E S T 。 对二次扩增效果
较好的 3 3 条序列测序后 ,将其在 w w w . a r a b id o p s i s .
or g 数据库 B L A S T , 同源性比较结果都在 9 8% 以
上 , 除了两个片段表达蛋白未知功能 以外 , 其余
的均为己知功能的拟南芥基因 。 其中 , 发现 12 个
片段是植物适应逆境时特异表达或表达增强的基因
(表 l) , 且 D D R T 一 P C R 结果显示这 12 个片段都在
表 1 D D R T 一 P C R 分离到的 A r 日K l 突变体和野生型差异表达 。 D N A 片段序列
T a b le 1 e D N A o f g e n e s d i fe
r e n t i a l l y e x P re s s e d in th e A不H K了一 m u ta n t a n d WT o f A ar b id op s is
N u m b e r o f e D N A eL n g ht b( P) rP o d u e t o f e x Pr e s s i o n
P r o te i n ty r o s in e P h o s Ph a ta s e (P T P )
L e u c in e
一
ir e h er Pe a t P r o t e i n ik n a s e
G l u ta ht i o n e r e d u e t a s e
,
P u ta t iv e
A s e o rb a te Pe or x i d a s e
,
Pu at t iv e (A P X )
M A PK K K 18
A e ir n et/ hr e o n in e Pr o t e in ik n a s e
,
Pu t iat v e
A T CO R 4 13
~
PM I
M y o
一
in o s i to l m o n o P I一o s P hat a s e 一re la te d
P r o t e in P h o s Ph a ta s e Z C
uP t iat
v e Por te i n P h o s P h at as e
一
ZC
hP
o to s y s t e m 11 Por te i n M (P S B M )
D
一
40 re P e a t Por t e in
一
re la t e d
L o e u s N o
.
A t l G 7 1860
.
l
A t l G 5 18 05
.
l
A t 3G 24 170
.
l
A t 1G 0 78 90
.
2
A t 1G 0 5 100
.
1
A t2 G 3 07 40
.
l
A tZ G 159 70
.
l
A t3 G 0 28 70
.
l
A t l G 7 27 70
.
l
iA 2 g 3 37 0()
.
l
A t C G 0() 22 0
A t l G 0 33 80
.
l
0吸.几洲zC,4Q
尹`n,àùnU,1.州fù,`了O飞Jlù-八jCR040了J竹41月了2八、à内1,jl,`飞é4咤J孟U口少OCù2-内,
.且,1J1.ù
5期 郝岗平等: A 丁日 K l基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程
P E G诱导 的野生 型 中表 达增强 。 其中 GS H
(g lut at h io n er ed
u ct as e )和P AX (o s e at h at eP eo rx id as e )
在解除逆境胁迫下植物产生的有害自由基方面起主
要作用 (No et o r 等 20 2, T o r s e小 a u g e n 等 19 9 7 ) ; 亮
氨酸富集重复 (l e u e i n e 一 ir e h r e p e a t , L R R )蛋白激酶
则是植物受病原侵害后转导信号的主要膜蛋 白 (杨
崇林和陈章良 19 9 7 ) 。 e u p t a 和 L u a n ( 2 0 0 3 )发现
P T P 也在植物逆境信号转导中起重要作用 , 它可
以介导植物 H Z o Z信号的转导 ; D 一 4 0 r e p e a t 蛋 白
是 G 蛋 白 p 亚基 , G 蛋白是 c AM P 信号转导途径
的主要成员 (G i lm an 1 9 5 7 , v a n d e r V o o nr 和 p l o e g h
199 2 ) ; M A P K K K 1 8
、
S e r/ T hr 激酶和 P P ZC 是植物
逆境信号转导的主 要成 员 ( x i o n g 等 2 0 0 2 ,
M e i n h a r d 和 G r i l l 2 0 0 1) , A T C O R 4 1 3一 p M I 是拟
南芥中的冷诱导蛋 白 (G ar w e 等 2 0 0 3) ; 肌醇单磷酸
酶 (m y o 一 i n o s i t o l m o n o p h o s p h a t a s e )是参与肌醇代谢
的主要酶 , 也与第 二信使物质 I P 3 的合成有关
( G i l l a s p y 等 1 9 9 5 ) 。 在植物适应逆境的过程中 ,
P S B M 参与光合作用的适应性调节 (H an k a m er 和
B a r b e r 1 9 9 7
, 万东石等 2 0 0 3 ) 。
差异显示 D N A 片段的进一步鉴定在差异显示
分析中至关重要 , 通常采用的方法是 N or t h er n 和
反向 N or ht er n 杂交 。 前者需要将每个片段进行标
记 , 然后与不同的 R N A 分别杂交以排除假阳性 ,
工作量大且难度高 , 需要大量的 R N A ; 后者则
以标记的 c D N A 第一链为探针 , 与差异片段进行
杂交 , 简便易行 。 在 该工作中 , 我们采用 了反
向 N o r t h e r n 分析 。
将 D D R T 一P C R 分离到的 12 个 c D N A 片段 (表
l) 和 N A D H 脱氢酶片段进行再扩增 , 各取约 3 0 0
n g 的 D N A 产物 , 同时点样于两张尼龙膜上 。 分
别与 以 3 0% PE G 诱导的 A厂日K l 突变体及其野生型
R N A 反转录标记的 c D N A 第一链探针 杂交 。 以
R u b i s e o (ir b u l o s e b i s p h o s p h a et e abr
o x y l a s e )小亚基 Zb
为正对照 (+) , d dH 20 为负对照。 ) 。 结果显示 1号
尸
TP 的杂交信号在两张膜上都很弱 , 说明 尸TP 在
突变体和野生型中表达没有 差异 , 且表达量在
P E G 诱导下也很低 。 9 号 N A D H 脱氢酶 、 1 0 号
和 1 号尸尸Z C 表达量都很强 , 但在突变体中表达
没 有减弱 。 所 以可 以认 为这 4 个片段 经 反 向
N or ht er n 验证在 P E G 诱导后的突变体和野生型之
间表达没有差异 , 它们在 D D R T 一 P C R 表现出的
P E G 诱导下的表达增强属于假阳性 。 其余 9 个片
段与野生型 R N A 杂交的信号均强于突变体 R N A ,
表明突变体的这 9 个基因对 P E G 诱导的敏感程度
低于野生型的基因 (图 5 ) 。
图 5 部分 D D R T一CP R差异 c D N A 片段的反向 No hrt em 杂交
F ig
.
5 R e v e r s e N o r th e r n b lo t ti n g o f 13 d ife
r e n t i a l d i s P la y
e D N A fr a gm e snt for m D D RT
一
CP R
A : W T : B : A T H K I
一
m u t a n t : 9 : N A D H d e h y d r o g e n a s e :
O ht e r s s e e T ab l e 1
.
3 讨论
常见 的渗透胁迫 , 如干旱 、 盐害及冻害等 ,
会严重影响植物的生长发育及产量 。 植物在长期
的进化过程中形成了一系列保护机制来减轻渗透胁
迫造成的伤害 。 人们正在从生理生化 、 细胞和分
子水平来了解这一系列的保护机制 。 理解植物如
何感知环境信号和传递信号到细胞内部 , 从而引
起一系列应答的机理是 问题的关键 。
植物适应逆境的信号转导首先起始于植物对
逆境信号的感知 , 然后产生相应的第二信使物
质 , 通过第二信使物质激活蛋 白磷酸化反应 , 引
起转录 因子的表达或激活 , 最后引起一系列逆境
响应基因 的表达 , 以此来适应所处的环境条件
( x ot n g 2 0 0 2)
。 在整个保护机制的信号转导过程
中 , 植物如何感觉环境的变化是最关键的环节 。
干旱 、 盐害及冻害等逆境信号转导的研究不像研
究激素信号转导那样可以用标记的激素分子去寻找
和研究其受体 , 因此这方面的研究进展较缓慢 。
但是上述逆境信号可以转换为机械胁迫或渗透胁迫
的信号 , 对这些信号的识别研究近年来己有一定
的进展 。 渗透胁迫会使植物丧失一定的水分从而
导致细胞膨压降低 , 这一变化可能引起植物细胞
植物生理与分子生物学学报3 0卷
壁与细胞膜的相互作用 , 并引起细胞膜上一些蛋
白构象的变化 , 从而识别外界环境中的渗透胁迫
信号 (杨洪强等 2 0 0 1 ) 。 在大肠杆菌和单细胞真核
酵母中 , 已经发现这种膜上 的渗透胁迫信号识别
蛋白为一种 “ 双组分系统 ” , 如酵母的 sl ln 为一
种跨膜组氨酸蛋 白激酶 , 能识别渗透胁迫信号 ,
而 S s k l 则是一种信号调节蛋白 , 它们共同组成信
号识别及调节的 “ 双组分系统 ” ( P o s a s 等 1 9 9 6 ) 。
U ar o 等 ( 19 9 9) 克隆的拟南芥 A z H K I 。 D N A , 预测
的蛋白质是具有组氨酸残基的信号转导域和保守的
A s p 残 基 受体 区域的膜蛋 白 , 类似于酵母的
S l ln
, 推测它可能是植物的渗透感受器 。
本实验所用的拟南芥突变体是 T 一D N A 插入所
造成的突变体 , T 一 D N A 插入到 A T H K I 基 因的第
1 2 外显子区域 。 如果 A T H K I 是植物中的渗透感
受器 , 那么突变体感受胁迫信号 的能力会比野生
种低 , 自我保护作用减弱 , 其结果是突变体适应
逆境的能力比野生种弱 。
从 A T H K I 突变体和野 生型的生理差异来分
析 , P E G 胁迫 3 6 h 时可见突变体开始萎蔫 , 而野
生型还没有变化 , 4 8 h 时野生型也表现萎蔫 , 但
突变体的萎蔫程度明显大于野生型 (图 1 ) 。 突变体
的失水程度 (图 2) 、 在 P E G 胁迫后的细胞膜伤害程
度 (图 3) 都大于野生型 , 这些指标均一致地表示突
变体抵抗 P E G 胁迫的能力低于野生型 。 从 D D R T -
P C R 结果来分析 , P E G 胁迫后筛选到 12 个与植物
适应逆境相关 。 D N A 片段 (表 l ) , 但反向 N o r t h e r n
验证后 , 在突变体中只有 9 个基因对 P E G 诱导的
敏感程度明显低于野生型的基因 (图 5) , 这些基因
编码的蛋白包括从逆境信号传递的上游成员 D 一4 0
r e p e a t
、
M A P K K K 18
、
S e lr T h r 激酶 , 到信号传递
下游的植物适应逆境的功能蛋白 G S H 和 A P x 。 这
可能是由于突变体中A Z’H K l基因失活引起下游基因
响应逆境胁迫的能力减弱 , 说明 A Z H K I 基因参与
调控植物的抗渗透胁迫的应答反应 。
在酵母和拟南芥的组氨酸激酶双组分系统的
信号转导途径中 , M A P K 信号放大系统位于组氨
酸激酶双组分系统的下游 , 在酵母中作为渗透感
受器的双组分系统的反应调节部分直接与 M A P K
放大系统起作用来传递信号 (H w a gn 等 20 0 2) 。 我
们的 D D R T 一 P C R 结果显示 , 在 A z 日K l 突变体中
再么A尸尤尤犬1 8 、 S e 子刃’h ; 两个激酶基因的表达减弱 ,
二者都是 M A P K 信号放大系统的成员 (S oy an o 等
20 02 )
, 可以推测 A T H K I 是 M A P K 系统的上游信
号传递成员 , 可能是植物中的渗透感受器 , 这与
u r a o 等 ( 1 9 99) 的 A T H K I 基因在酵母渗透感受器
S L N I 突变体中的功能互补的结果一致 。 推测
A T H K I 作为植物渗透感受器的信号传递途径如图
6 所示 。 要进一步证实 A T H K I 就是植物的渗透感
受器 , 还需要在植物体内研究与它相互作用的蛋
白质 , 以及它与 M A P K 系统 的关系 。
图 6 推测的以 A T H K I 为植物渗透感受器调控的信号转导
途径
R g
·
6 Po s s ib 1e s i gn ia t ra I1sdu ict on P hat w ay in
v of v ed i
n A T H K 1
a s o sm o s e n s or i n Pl an ts
T h e v e rt ic a l bar s er Per s e in t r a n sme m b
r a n e d o m ia n s
.
H : H i s : D :
A s P : P : P h o s Ph o yr l g r o u P
.
参 考 文 献
张宪政 ( 1 989 ) . 植物生理学实验技术 . 沈阳 : 辽宁科技出版
社 , 4 7一 48
李振国 ( 19 9 9) . 植物细胞质膜透性的测定 . 见 : 中国科学院
上海植物生理研究所主编 .现代植物生理学实验指南 .北
京 : 科学出版社 , 30 2一 3 03
B r a y E A ( 199 7 )
.
P lan t
r e s Po n s e s ot w at e r de if
e i t汉)℃刀山 P la n l
S c i
,
2 : 4 8一 5 4
C h a n g C
,
M e y e r o w i t z EM ( 19 95 )
.
T h e e t hy l e n e h o r m o n e
r e s Po n s e i n A ar b id
o P s i s : A e u kar y o ti e t w o
一 e o m Po n e n t
si g n al i n g s y s te m
.
P or c N d tl A
c a d cs i 〔js八, 92 : 4 12 9一133
C h an g C
,
S t e w art R C (199 8 )
. 了h e t w o 一 e o m Po ne n t s y s te m . 尸勿n r
P hy s io l
,
117 : 72 3一 7 3 1
C la r k e JM
,
M e C ia g T N (19 82 )
.
E v a l u at io n o f t e e h n i q u e s of r
s e r e e n i n g of r d r o u g h t re s i s t a n c e i n w h e a t
.
C即P S c i , 2 2 :
5 03一 5 0 6
G ao Z Y
,
C h e n Y F
,
R an d l
e t M D
,
Z h ao X C
,
iF n d e ll J L
, 幻 e b e r
J J
,
S e hal l er G E (2 X() 3)
.
L oc al
z iat o n o f ht e R a 卜li k e ik n a s e
5期 郝岗平等 :7 A’ HKl 基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程 9 55
C I T Rt oh e t
en d ol Pas 而 ei r e tu el um of Aa rbi 峨叨si s th r ough
Pa r ti ei Pa ti n oi n e tl h yn r e e e e e Pt os ri g nai l ng e om l Px e es
.
J
i B ol h C
em
,
27 8 : 34 72 5一 3 47 3 2
G a r w e D
,
T h o m s o n JA
,
M u n d
r e e S G (2 0 0 3 )
.
M o l e e u la
r
e har
e te ir z at io n o f X议沮P l , a s tre s s 一re s op n s i v e g e n e ofr m
ht e re s u r e e it o n P lan tXe
r口P梅at v is e os a B a k e r . J 丑切 B o r ,
54 (3 8 1 ) : 19 1
一
20 1
G il l a s Py G E
,
K e d d i e J S
,
o d a K
,
G r u i s s e m W ( 19 95 )
.
P la n t
in o s i to l m o n o Ph o s Ph a t a s e 15 a l it h i u m
一 s e n s i t iv e e n z y m e
e n e o d e d b y a m u lt ig e n e fa m i ly
.
P la n t eC l
,
7 : 2 175
一
2 185
G i lm a n A G ( 19 8 7 )
.
G P r o t e i n s : t r a n s d u e e r s o f r e e e P t o r
-
g e n e r ate d
s i g n a l s
.
A 拄n R e v B i o e h e m , 56 : 6 15一64 9
G u P t a R
,
L u a n S (2 00 3 )
.
R e d o x e o n t r o l o f Pr o te in ty r o s i n e
Ph o s P h a t a s e s a n d m i t o g e n
一 a e t i v a t e d Pr o t e i n k in a s e s i n
P l
a n t s
.
P la n t P hy s i o l
,
1 32 : 1 1 4 9一 115 2
H a n k a m e r B
,
B a r b e r J ( 19 9 7 )
.
S t r u e t u r e a n d m e m b r a n e
o r g翻 z at i o n o f hP o ot s y s te m 11 in g r e e n Plan t s . A n n u R e v
P l a n r P勺 5 10 1 P l a n t M口1 B io l , 4 8 : 6 4 1一 67 1
H u a n g Y
,
L I H
,
H u te h i s o n C E
,
L a s k e y J
,
K i e b e r J J ( 20 0 3 )
.
B i o e h e m i e a l a n d fu n e t io n a l a n a l y s i s o f C T R I
, a Por te i n
k i n a s e t h a t n e g a t i v e l y r e g u l a t e s e t h y l e n e s i g n a l i n g i n
A ar b id op s is P al n t J
,
3 3 (2 ) : 22 1
一
2 33
H u a n g Y z (黄有总 ) , x u J Y (徐建云 ) , C h e n e J (陈超君 ) ,
H e x y (何雪银 ) (2 00 2 ) . C o m Par a t i v e t e s t s o n d r o u g h t
r e s i s tan
e e a n d fr o s t er s i s ta n c e o f s e v e r a l n e w s u g acr
a n e
v ar i e t ie s
.
J G
u a n肛 1 A g ; 刀10 1 s e i (广西农业生物科学 ) ,
21 (2 ) : 10 1
一
10 4 ( in Ch i n e s e )
H u t e h i s o n C E
,
K i e b e r J J ( 20 0 2 )
.
C y t o k in i n s i g n a l i n g i n
A ar b id op
s is
.
P la n t C e l l
,
14 : 5 4 7
一
5 5 9
H w a n g l
,
C h e n H C
,
S h e e n J (2 0 02 )
.
T w o
一e o m P o n e n t s ig n a l
t r a n s d u e t i o n P a t hw a y s i n A ar b i d
o
P s i s
.
P la n t P h y s i o l
,
12 9 : 5 00 一 5 15
I n gr am J
,
B a rt e l s D (199 6 )
.
hT
e m o le e u lar b a s i s o f de h y dr
a it o n
to l e r a n e e in P la n t s
.
A n
n u R e v P la n t P h y s i o l P la n t M o l
B io l
,
47 : 37 7一 4 0 3
nI ou e T
,珑 g u c ih M , H a s hi mo ot Y , S e ik M , oK b a y a s hi M , K aot
T
,
T a b a t a S
,
S h i n o z a k i K
,
K a k i m o t o T (2 0 0 1 )
.
Id e n t iif e a t i o n o f C R E I a s a e y t o k i n i n r e e e P t o r fr o m
A ar b id op s is
.
N d tu re
,
4 09 : 10 6 0一 10 6 3
J o r d an W R
,
Sh o u s e P J
,
B l u m A
,
M i ll e r F R
,
M o n k R L ( 1 9 84 )
.
E n v ior
n m e n atl P hy s io lo g y o f s o r ghu m
·
l EP i
e u t ic u lar w ax
lo ad an d e u it e u lar tr a n s P ir a tio n
.
C兀少 cS i , 24 : 116 8一 1 17 3
瓦e b e r J J , R o ht e nb e r g M , R o m a n G , eF l dm a n n K A , E e k e r J R
( 19 9 3 )
.
C T R I
, a n e g a t iv e r e g u l a t o r o f t h e e t h y le n e
re s Po n s e Pa ht w ay i n A ar b i dop s i
s , e n c o d e s a m e m b e r o f
th e r a f f a m i l y o f P r o t e i n k i n a s e s
.
C e l l
,
7 2 ( 3 ) : 42 7
-
44 1
L e e J H
,
K im W T (2 0 0 3 )
.
M o l e e u l a r a n d b i o e h e m i e a l
e h a r a e te r i z a t i o n o f V R
一
E IL s e n e o d i n g m u n g b e a n
E T H Y L E N E IN S E N S I T IV E 3
一
L I K E P r o t e i n s
.
P l a n t
尸入夕5 10 1, 13 2 : 14 7 5一 14 8 8
M e i n har d M
,
G ir ll E (2 00 1)
.
H y dr o g e n Pe r o x i d e 15 a re g u l a to r
o f A B l l
, a P r o t e i n Ph o s Ph a t a s e Z C fr o m A ar b id op s i s
.
尸石刀S L e t r , 5 0 8 (3 ) : 科 3一4 6
M i z u n o T ( 199 7 )
.
C o m P il a t i o n o f a ll g e n e s e n c o d i n g t w o
-
c o m Po n e n t P h o s P h o t r a n s fe r s i g n a l t r a n s d u e e r s i n th e
g e n o me
o f sE e h e
r
i
e
h i a e o l i
.
D 入姓 R e s , 4 (2 ) : 16 1一 16 8
N o c ot r G
,
G o me
z L
,
V an ac k e r H
,
oF y er C H (20() 2 )
.
nI te r a c t io n s
b e tw e e n b i o s y n th e s i s
, e o m Pa rt m e n t at i o n a n d atr
n s Po rt in
t h e e o n tr o l o f g lu t at h i o n e h o m e o s t a s i s a n d s i g n a l in g
.
J
E 郑, B o t , 5 3 (37 2 ) : 1 2 8 3一 13 04
Ot a MI
,
V ar hs va sky A (199 3 )
.
A y e a s t P r o te in s i而 l ar ot b ac te ir al
t w o
一 e o m Po n e n t re g u l at o r s
.
S e i e
n e e , 2 62 : 56 6一 5 69
P a r ik n s o n J S ( 199 3 )
.
S i g n a l tr an
s d u e t i o n s e h e me
s o f b ac t e r ia
·
C e l l
,
7 3 : 85 7一 87 1
Po s a s F
,
W
u gr l e r
一
M u pr h y S M
,
M ae d a T
,
Wi te n E A
,
hT ia T C
,
S a i t o H ( 199 6 )
.
Y e a s t H O G I M A P k i n a s e e a s e a d e 15
r e g u l a te d b y a mu l
t i s te P Ph o s Ph o re la y m e e h a n i s m i n t h e
s L N I一Y阳 l一S s K I “ t w o 一 e o mP o n e n t ” o sm o s e n s o r · eC ll ,
86 : 8 65 一 87 5
R e i s er V
,
R ia t t D C
,
S ia t o H (20 0 3 )
.
Y e a s t o s m o s e n s o r S ln l
a n d P lan t
e y t o k i n i n er e e P to r C er l er s P o n d t o e h a n g e s i n
tu r g o r P r e s s u r e
.
J eC ll B i
o l
,
16 1 : 103 5一 104 0
S ih on z adl K
,
Y am
a g u e h i
一
S hi n o z iak K ( 199 7 )
.
G e n e e x Per s s i o n
a n d s i g n a l t r a n s d u c t i o n in w a te r
一 s tr e s s r e s Po n s e
.
P l a n t
hP y
s io l
,
115 : 3 27一 334
S o y a n o T
,
I s h i k a w a M
,
N i s h i h a m a R
,
A r a k i S
,
I t o M
,
I t o M
,
M a e h i d a Y ( 20 0 2 )
.
C o n t r o l o f P l a n t e y t o k i n e s i s by a n
NP K I
一
me id
at e d 而 ot g e n 一 ac t iv a te d P ro t e i n ik n a s e c a s c a de ·
P h i l rT
a n s R S o e oL
n d B B i o l cS i
,
3 57 ( 142 2 ): 7 6 7
一
77 5
5 t o e k A M
,
R o b i n s o n V L
,
G o
u
d r e a u P N (2 0 0 0 )
.
T w o
-
e o m P o n e n t s i g n a l tr an
s d u e t i o n
.
A
n n u R e v B i o e h e m
,
69 :
183一 2 15
T o r s e th a u g e n G
,
P it e h e r L H
,
Z i l in s k a s B A
,
P e l l E J ( 19 9 7 )
.
o v e pr r o d u e t i o n o f a s e o r b a t e Pe r o x id a s e in t h e to b a e e o
e h l o r o P l a s t d o e s n o t P r o v i d e P r o te e t io n a g a i n s t o z o n e
·
P la n t P hy
s io l
,
1 14 (2 ): 5 2 9
一
5 37
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,
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,
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一
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,
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,
H i r a y a m a T
,
Sh i n o z a k i K ( 19 99 )
.
A t r a n sm e m b r a n e
h y b r i d
一
t y Pe h i s ti d i n e ik n a s e i n A ar b id op s is fu n e ti o n s a s
an o s r n o s e n s o r
. 尸亡“ n r eC ll , 11 : 174 3一 17 54
v
an d
e r V o o rn L
,
P l o e g h H L ( 19 92 )
.
T h e WD
一
4 0 re pe at
· 尸E刀S
L e t
,
30 7 (2 ) : 13 1
一 1 34
w a n 0 5 (万东石 ) , L i H Y (李红玉 ) , z h a n g L X (张立新 ) ,
L ia n g H G (梁厚果 ) (20 0 3 ) . G e n e e x p r e s s io n a n d s i g n a l
t r a n s d u e ti o n o f Pl an t
s u n d e r d r o u g h t s t r e s s i n v i v o
.
A e at
肠 t 刀 o er a l一 O e e ide n r s i n (西北植物学报) , 2 3 ( 1) : 2 15 -
157 (i n C hi n e s e )
W
a n g W Y
,
H a l l A E
,
0
’
M a l le y R
,
B l e e e k e r A B ( 2 00 3 )
.
C a n o n i e a l h i s t id i n e k i n a s e a e ti v i ty o f t h e t r a n s m i t t e r
56 0 Jo u rn a l of P la n t P h少s to lo gy a n d M d le e u la r B to l o gy 20 04 , 30 (5 ): 5 53一5 60
d o m a i n o f th e ET R I het y l
e n e r e c e Potr fr
o m A ar b id op s i s
15 n o t
r e q u i r e d fo r s i g n a l t r a n s m i s s i o n
.
P or
c
Na
t l A
c a
d
S c i U SA
,
10() : 35 2
一
3 57
W
e s t A H
,
S to e k A M (2 00 1 )
.
H i s t i d i n e k i n a s e s a n d r e s Po n s e
re g u la ot r P r o t e in s i n tw o
一e o m P o n e n t s i g n a l in g s y s te m s
·
介己 n de B i o c h e m cS i , 26 (6 ) : 36 9一 37 6
X io n g LM
,
S e h u m a k e r K S
,
Z h u J K (20 0 2 )
.
C e l l s i g n a li n g
du ir n g e o ld
,
d r o u g ht
,
an d s a l t s tre s s
.
P al n t eC ll
,
14 : 5 16 5
-
5 18 3
Y an g C L (杨崇林 ) , C h e n ZL (陈章良) ( 199 7 ) . L R p or t e in s in
h i g h e r P la n t s
一 s t r u e t u r e a n d fu n e ti o n
.
hC i
n a B i
o t e c h
n o
l
(中国生物工程杂志 ) , 6 : 4 3一 4 7 ( i n e h i n e s e )
Y a n g H Q (杨洪强 ) , Z h a n g L Z (张连忠 ) , L i L G (李林
光 ) , L I J (李 军 ) (20 0 1 ) . p e cr e p t io n o f dr o u g h t s ig n a l
a n d het rP
o d u e t io n a n d tr an
s Po rt o f s tr e s s me
s s e n g e r in
p l a n t
.
R e s 50 12wa et
r
oC
n s e yr (水土保持研究) , 3 : 7 2一 76
(i n C h i n
e s e )
Y au C P
,
W an g LJ
,
Y u M D
,
Z e e S Y
,
YI P W K (20( 科 ) . D ife er n it al
e x P r e s s i o
n o f thr e e g e n e s e n e o d in g a n e ht y le n e er e e P to r
i n ir e e d u ir n g d e v e lo Pm e n t
,
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n er s Po n s e ot i n d o le
一
3
-
ac e t i e a e i d a n d s i lv e r i o n s
.
J E塑 B o r , 55 (397 ) : 54 7一 5 56
Y o k o t a n i N
,
T am
u r a S
,
N a k a n o R
,
I n a b a A
,
K u b o Y (2 00 3 )
.
C h a r a e t e r i z a t i o n o f a n o v e l to m a t o E IN 3
一
l i k e g e n e
(L
e E IL 4 )
.
J E斗 , B o t , 54 (39 3 ) : 277 5一 2 77 6
Z h o u D
,
K a la i t z i s P
,
M a t to o A K
,
T u c k e r M L ( 19 9 6 )
.
T h e
m RN A fo r an E T R I h o m o l o gu e in ot m a to i s c o n s it ut it v e ly
e x P r e s s e d i n v e g e ta t i v e a n d r e P or d u e ti v e t i s s u e s
.
P l
a n r
材d l B io l , 3 0 : 133 1一 1 33 8
A工仔K l G e n e R e g u l a t e s S i g n a l rT a n s d u c t i o n o f o s m o t i c s t r e s s i n
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A e a d e m夕 of A g r i e u i r u re a n d F o re s t尽 S e i e n e e s , B e ij i n g 10 0 0 8 9 , C h i n a : ’ UR Z , 4 nU i t衫 d e G血改 i叮 u e e t A m目 i o n ar t i o n de s p al 陀 et s , IN R A
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,
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e x P r e s s io n b e t w e e n A不H K I k n o c k 一 o u t m u t a n t
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