全 文 ：中国农学通报 2010,26(20):43-46
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
维生素E又称生育酚，是一种脂溶性的小分子抗氧
化剂，在哺乳动物和植物体内都有重要的功能。在动
物体内维生素E能增强机体免疫力、防癌、防衰老、防
心脑血管疾病及预防或减慢某些慢性疾病的发生[1-3]。
在植物体内的功能有抗氧化、调节脂肪酸合成和糖类
运输[4-6]，抗重金属盐离子胁迫[7]，抗旱[8]，抗老化[9]，调节
JA（茉莉酸）[10]和乙烯[11]信号转导，促进种子发芽[12]等
功能。维生素E在高等植物中合成，但活性较高的α-
生育酚和γ-生育酚在总生育酚中所占的比例不高，因
基金项目：国家重点基础研究发展计划973项目“作物特殊营养成分的代谢及其调控研究”（2007CB108801）；转基因生物新品种培育科技重大专项
“优质功能型转基因玉米新品种培育”（2008ZX08003-002）。
第一作者简介：叶立涛，男，1983年出生，河北省任丘市人，硕士，主要从事维生素E代谢分子生物学研究。通信地址：100081北京市中关村南大街12
号中国农业科学院生物技术研究所，Tel：010-82106134，E-mail：yelitao1983@163.com。
通讯作者：王磊，男，1970年出生，河南平顶山人，研究员，博士，研究方向为植物代谢与营养工程。通信地址：100081北京市中关村南大街12号中国
农业科学院生物技术研究所，Tel：010-82106134；E-mail：caaswlwl@163.com。
收稿日期：2010-05-19，修回日期：2010-06-16。
大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶（GmVTE3）
对转基因拟南芥生育酚组成的影响
叶立涛，张 兰，王 磊
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要：2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ-MT，VTE3）是维生素E合成途径中的关键酶之一，通
过转化模式植物拟南芥，研究大豆VTE3（GmVTE3）基因在拟南芥中过量表达对维生素E组分含量的
影响。成功构建了植物表达载体pZP212-GmVTE3，将其转入模式植物拟南芥，获得转基因纯系植株6
个；利用HPLC检测技术对转基因拟南芥种子和叶片中维生素E含量进行了测定。结果表明：6个转基
因纯系植株种子中，γ-生育酚/δ-生育酚比值均比野生型有所提高，为野生型的1.7倍；叶片中未检测到δ-
生育酚。表明GmVTE3可以有效地把δ-生育酚转化为γ-生育酚，从而改变植物体内VE的组成。
关键词：大豆；拟南芥；维生素E；生育酚；大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2010-1575
Effect of Glycine max 2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol Methyltransferase (GmVTE3) on
Vitamin E Content of Transgenic Arabidopsis
Ye Litao, Zhang Lan, Wang Lei
(Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract: MPBQ-MT (2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinone methyltransferase,VTE3 ) was a key enzyme in
the biosynthesis of vitamin E, GmVTE3 was transformed into Arabidopsis thaliana for investigating the effect
of its overexpression on the content and composition of vitamin E. In the study, plant expression vector
pZP212-GmVTE3 was constructed for Arabidopsis transformation, and obtained six homozygous lines, and
vitamin E were measured in the seeds and leaves of transgenic lines by HPLC. The results showed that the
ratio of γ -tocopherol / δ-tocopherol in the seeds of six transgenic homozygous lines was 1.7 times of wild
type, and in the leaves δ-tocopherol was undetectable, thus indicating that GmVTE3 gene was able to increase
the content of γ -tocopherol and decrease the content of δ-tocopherol, and then changed the content and
composition of vitamin E .
Key words: soybean; Arabidopsis thaliana; vitamin E; tocopherol; MPBQ-MT
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此，利用基因工程的方法改变植物生育酚组成，提高生
育酚的生物活性，具有重要意义。20世纪 90年代，高
等植物维生素E的生物合成途径及其在叶绿体中的合
成位点已基本阐明[13]，随着分子生物学和基因工程的
快速发展，天然维生素E生物合成途径中的所有酶的
基因都已经从聚球藻和高等植物中分离得到，并对其
功能进行了一些分析[14-17]。2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲
基转移酶（VTE3）催化 2-甲基 -6-植基 -1,4-苯醌
（MPBQ）的甲基化，生成 2,3-二甲基-6-叶绿基-1,4-苯
醌（DMPBQ），是维生素E合成过程中的关键酶之一。
2002年，Shintani DK等[16]首次从聚球藻(Synechocystis
sp. PCC 6803)中克隆了VTE3基因，遗传学和生化证
据表明该基因的开放阅读框编码一个MPBQ甲基转
移酶。Van Eenennaam等[18]研究发现：拟南芥VTE3突
变体种子中大量积累δ-生育酚，γ-生育酚含量很低；将
拟南芥VTE3基因转入大豆中使大豆种子中δ-生育酚
由原来占总生育酚 20%降低到占 2%；将 VTE3和
VTE4共同转入大豆中表达时，发现大豆种子中α-生育
酚从原来的 10%升高到 95%以上。这些结果表明，
VTE3在外源植物中表达能够促进γ-生育酚的合成，改
变生育酚的组分。前人研究的目的基因来源于聚球藻
和拟南芥，目前尚无大豆VTE3基因在拟南芥中过表
达研究该基因对生育酚合成的影响的报道，笔者利用
已克隆的大豆 2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基
因(GmVTE3)，构建了植物表达载体，转化模式植物拟
南芥并对转GmVTE3基因拟南芥种子和叶片中维生
素E的组成进行了初步分析研究，为维生素E的代谢
工程研究等工作提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、载体和植物材料 大肠杆菌(E.coli)菌株
DH5 α，农杆菌菌株 LBA4404、pZP212 质粒载体、
GmVTE3基因（T-MPBQ MT 5#质粒载体）、拟南芥（哥
伦比亚）均为本实验室保存。
1.1.2 工具酶和试剂盒 各种限制性内切酶和修饰酶购
自 Promega公司、北京天根生物技术有限公司、New
England Biolab公司、TOYOBO公司和 Invitrogen公
司 。 质 粒 DNA 提 取 的 WizardTM Minipreps DNA
Purification System 和 WizardTM Maxipreps DNA
Purification System试剂盒购自 Promega公司；提取植
物 总 RNA 的 TRIZOL 试 剂 盒 和 反 转 录 的
SuperScriptTM First Strand Synthesis System for RT-PCR
试剂盒均购自 Invitrogen公司；DNA回收使用明日百奥
生物技术有限公司DNA片段快速纯化/回收试剂盒。
1.1.3 测序和引物合成 测序和引物合成分别由北京中
科希林生物技术有限公司和北京三博远志生物技术有
限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体的构建 pZP212质粒载体用Xba I
酶切，补平，再用 Sac I切，回收载体片段；以MTF1：
5-GGGTCTAGACCATGGGTTCAGTAATGCTCAGT-
3，MTRV0：5-GAGCTCTTAGATTGGCTGACCTTT-3
为引物，T-MPBQ MT 5#为模板进行PCR，PCR反应条
件为：94℃预变性4 min；94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 60 s，
30个循环；72℃延伸10 min。回收PCR产物用Sac I酶
切，得到GmVTE3基因片段；将载体片段和GmVTE3
基 因 片 段 用 连 接 酶 连 接 ，构 成 重 组 质 粒
pZP212-GmVTE3，电击转化转入大肠杆菌DH5α，对
重组质粒进行酶切鉴定，测序。
1.2.2 拟南芥转化和PCR检测 将pZP212-GmVTE3质
粒电击转化转入农杆菌LBA4404中，挑取鉴定正确的
农杆菌的单菌落，接种于 5 mL YEB（Kan 50 mg/L，Rif
50 mg/L）液体培养基中，28℃，250 r/min培养36 h。按照
1:300转接至用 500 mL三角瓶装的 200 mL YEB（Kan
50 mg/L，Rif 50mg/L）液体培养基中，28℃，250 r/min
培养约 15 h，至OD600≈2.0。5000 r/min离心 5~6 min，
所收集的菌体重悬于约 2倍体积的 10%的蔗糖溶液
（现用现配），至OD600=1.0左右，加入 0.02%的 Silwet
70。将拟南芥倒置，使花蕾朝下浸入渗透液中，停留
20~40 s，取出花蕾，轻轻抖落植株上的多余渗透液，将
植株正置。转化后的植株用硬塑料板保护后，盖好保
鲜膜。在温室中正常培养，直到开花结荚收集种子。
将收集的种子播种于 1/2MS含Kan 50 mg/L培养基上
培养，10天后，将绿苗移至土中继续培养，并取叶片做
PCR 检 测 ， 所 用 引 物 为 CaMV35S：
5-CACAATCCCACTATCCTTC-3，MTRV0：5-GAGC
TCTTAGATTGGCTGACCTTT-3。反应条件为：94℃
预变性 4 min；94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 60 s，30个循
环；72℃延伸10 min。
1.2.3 抗性植株 RT-PCR分析 以PCR阳性拟南芥植株
的叶片为植物材料，采用 Trizol法提取总RNA，按照
SuperScriptTM First Strand Synthesis System for RT-PCR
试剂盒说明书进行反转录。根据拟南芥Actin基因
（AK318637） 合 成 内 标 引 物 ： actinFW：
5-CCAACAGAGAGAAGATGA-3和 actinRV：5-ATG
TCTCTTACAATTTCCCG-3(扩增大小 295 bp)，PCR
反应条件为：94℃预变性 2 min；94℃ 15 s，53℃ 15 s，
72℃ 20 s，28 个循环；72℃ 延伸 10 min。根据
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叶立涛等：大豆 2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶（GmVTE3）对转基因拟南芥生育酚组成的影响
GmVTE3 基因特异序列合成引物 GmVTE3 FW
5-ATGGGTTCAGTAATGCTCAGT-3和 GmVTE3 RV
5-TCTAATTGGTCCGGTCTACC-3(扩增产物大小
661 bp)。PCR反应条件为：94℃预变性 2 min；94℃
25 s，55℃ 25 s，72℃ 25 s，35个循环；72℃延伸10 min。
1.2.4 转基因拟南芥生育酚的测定 取生长2周的转基
因拟南芥纯系植株叶片及野生型拟南芥叶片(大于
100 mg)或成熟的拟南芥种子100 mg，在液氮中充分研
磨，取100 mg粉末转移至1.5 mL EP管中，加入600 μL
甲醇/氯仿(V/V，2:1)，混匀，加入200 μL氯仿，混匀，加
入 250 μL去离子水，混匀，10000 r/min，室温离心
20 min，吸取下层氯仿移至新的离心管中，氮气吹干。
将样品溶于200 μL无水乙醇中，利用HPLC，采用
外标法进行测定，色谱条件：仪器Waters244型HPLC，
柱 Shodex L18(0.4 cm×15 cm)，流动相 CH3OH，流速
0.8 mL/min，检测器UV280 nm，上样体积 20 μL，标准
品购于Sigma公司。标准品α-生育酚、γ-生育酚、δ-生
育酚的浓度均为10 ng/ul，上样体积为10 μL。
生育酚含量(mg/100 mg) = (标准品浓度/标准品峰高 ×样品峰高) ×样品总体积 × 100样品总重量
2 结果与分析
2.1 转GmVTE3基因拟南芥植株的获得
经含卡那霉素（Kan50 mg/mL）的 1/2MS平板筛
选，共获得 20个抗性株系，以此抗性植株的基因组
DNA为模板，以 CaMV35S和MTRV0为引物，进行
PCR扩增，获得 14个 PCR阳性株系；最终获得 6个转
基因纯系。
2.2 转基因拟南芥RT-PCR分析
以actin基因作为内标，以GmVTE3基因本身特异
区段设计引物，对转基因拟南芥纯系植株中GmVTE3
的表达进行RT-PCR检测。结果表明：6个转基因纯系
植株中GmVTE3基因均有表达，但表达程度不同：4#株
系表达量最高，其次依次是 6#，25#，16#株系，而 2#株系
表达量最低（图1）。不同株系间表达量的不同可能是
由于插入位点的不同造成。
2.3 转基因拟南芥生育酚的含量及其组成分析
通过HPLC对转基因植株种子测定发现：转基因
植株的总生育酚水平同野生型相比，没有显著差异，高
活性的α-生育酚的含量与野生型相比，也没有差异（数
据未显示），而γ-生育酚/δ-生育酚的比值比野生型拟南
芥有所提高，约为野生型的 1.7 倍（图 2），表明
GmVTE3基因的超表达能提高植物种子中γ-生育酚的
含量，改变维生素E的组成。
通过HPLC对转基因拟南芥叶片中的生育酚含量
测定发现：叶片中总生育酚的含量以及α-生育酚的含
量与野生型相比，没有显著差异；γ-生育酚含量与野生
型相比均有所提高，平均为野生型含量的1.4倍；野生
型叶片中δ-生育酚的含量为 1.5 ng/100 mg，转基因植
株叶片中未检测到δ-生育酚；表明GmVTE3基因把植
物叶片中的δ-生育酚转化为γ-生育酚。
3 讨论
（1）笔者以CaMV 35S启动子驱动的Gm VTE3基
因在拟南芥中进行超表达，转基因拟南芥种子和叶片
中总生育酚的含量与野生型没有差异，种子中γ-生育
酚与δ-生育酚的比值与野生型相比有所提高，叶片中
γ-生育酚含量升高，未检测到δ-生育酚，GmVTE3基因
在拟南芥种子中表达的实验结果与本实验室前期研究
的该基因在烟草中超表达的结果一致[19]，进一步说明
GmVTE3基因能够在外源植物中表达，并行使其功
能。但是转基因植株种子和叶片中α-生育酚的含量与
野生型植株相比，并没有差异，说明仅仅通过提高底物
γ-生育酚的含量并不能提高植物体内α-生育酚的含
量，如果再想要提高植物体内α-生育酚的含量，需要再
提高γ-TMT基因的表达量。
（2）从RT-PCR分析结果与维生素 E测定结果来
看，转基因株系中GmVTE3基因的表达量高低与测定
的γ-生育酚/δ-生育酚比值的高低并不是完全对应的关
WT 2 4 6 16 21 25
MPBQ-MT
Actin
图1 转基因植株的RT-PCR检测
23.03
40.89 42.4036.88
52.41
37.7233.83
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
WT 2# 4# 6# 16# 21# 25#
株系
γ
-VE/
δ
-VE
图2 转基因拟南芥种子中γ-生育酚与δ-生育酚含量的比值
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系，分析原因可能是：GmVTE3基因在植株叶片和种
子中有不同的表达，尤其是蛋白水平存在差异，这有待
于进一步实验验证。
4 结论
（1）利用克隆的大豆VTE3基因，构建了植物表达
载体pZP212-GmVTE3，转化模式植物拟南芥得到6株
转基因纯系植株，对 6株转基因纯系植株叶片和种子
中维生素E的含量进行了测定。结果表明，转基因植
株种子和叶片中γ-生育酚的含量在总生育酚中的比重
都升高，总生育酚和α-生育酚的含量与野生型相比没
有变化，说明GmVTE3基因能提高拟南芥中γ-生育酚
的含量。
（2）首次将克隆的GmVTE3基因转入模式植物拟
南芥，并改变了拟南芥中生育酚的组分含量，但是生物
活性最高的α-生育酚在转基因拟南芥种子和叶片中含
量都没有增加，说明不能单独利用GmVTE3最大限度
地提高植物中生育酚的生物活性，利用基因工程提高
作物中总生育酚活性可通过同其他维生素E合成相关
基因共转化来实现。
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